纯化水方法学验证报告.docx

1、纯化水方法学验证报告纯化水微生物限度检查方法学验证报告1适用范围 本验证报告适用于纯化水微生物限度检查法的验证。2目的 建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方 法的完整性，保证检验结果的可靠性。3概述3.1 通过验证以确认所采用的方法适合于纯化水的需氧菌总数测定和控制菌检 查。根据样品特性制订检验方法和检验条件， 按制定的方法进行试验， 根据验证 结果判断是否符合验证标准。 若符合，按验证的方法和条件进行纯化水的微生物 限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验 证结果符合设立的验证标准。4验证所需要的仪器设备及文件4.1 验证需用仪器设备

2、器具名称规格型号检定日期检定单位有效期隔水培养箱GH-500立式压力蒸 汽灭菌锅LDZM-80KCS电热鼓风干 燥箱101-2EBS生化培养箱SPX-150霉菌培养箱MJP-1604.2 验证所需要的文件及存放地方资料名称存放地点GH-500 型隔水培养箱操作维护保养 SOPLDZM-80KCS 蒸汽灭菌器操作维护保养 SOP101-2EBS 电热鼓风干燥箱操作维护保养 SOPSPX-150 型生化培养箱操作维护保养 SOPMJP-160 型霉菌培养箱操作维护保养 SOP5可接受的限度范围标准5.1 纯化水微生物限度检查质量标准项目标准规定需氧菌总数100CFU/ml大肠埃希菌1ml 中不得检

3、出沙门菌10ml 中不得检出金黄色葡萄球菌1ml 中不得检出铜绿假单胞菌1ml 中不得检出5.2 计数方法适用性试验结果判断在 3 次独立的平行试验中 , 采用薄膜过滤法 , 若菌液对照组生长菌落符合要 求，阴性对照组无菌落生长且试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液 对照组菌落数的比值应在 0.52 范围内；若各试验菌的回收试验均符合要求，照 所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数计数。5.3控制菌检查方法验证结果判断在 3 次独立的平行试验中， 采用薄膜过滤法 ,若阳性对照组检出试验菌 （检 出试验菌判断如下 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4），阴性对照

4、组未检出试验菌且实 验组检出试验菌（检出试验菌判断如下 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4）按此供试液 制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查； 若试验组未检出试验菌， 应 采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。5.3.1大肠埃希菌检查方法适用性试验结果判断 若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定 试验，确证是否为大肠埃希菌； 若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长， 或虽 有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠杆菌。5.3.2沙门氏菌检查方法适用性试验结果判断若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长， 且三糖铁琼脂培养

5、基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进 行适宜的鉴定试验， 确证是否为沙门菌。 如果平板上没有菌落生长， 或虽有菌落 生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色； 或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。5.3.3金黄色葡萄球菌检查方法适用性试验结果判断 若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落 生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平 板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长， 或虽有相符或疑似的菌落生长 但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。5.3.4铜绿假

6、单胞菌检查方法适用性试验结果判断 若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性， 应进一步进行适宜的鉴定试验， 确证是否为铜绿假单胞菌。 如果平板上没有菌落 生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性， 或氧化酶试验阴性， 判供试品未检出 铜绿假单胞菌。6 验证依据USP40药典通则7 培养基采用符合美国药典规定的干燥培养基（见表 1），按照厂家提供的使用说明书 进行配 制和灭菌，并 按要求写好 XYK/REC-QC040培养基配制使用记录、 XYK/REC-QC02仪2 器使用记录， 参照 USP40药典通则 61、USP40药典通则 62 进 行培养基适应性检查试验，并按要求

7、写好培养基适应性检查记录。 （见表 2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13）表1 培养基信息概况名称配置批号允许 PH 值范围灭菌前 PH 值灭菌后 PH 值PH7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液胰酪大豆胨琼脂培养基R2A 琼脂培养基麦康凯琼脂培养基胰酪大豆胨液体培养基麦康凯液体培养基木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基RV 沙门菌增菌液体培养基沙氏葡萄糖液体培养基三糖铁琼脂培养基甘露醇氯化钠琼脂培养基溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基胰酪大豆胨琼脂对照培养基麦康凯液体对照培养基沙氏葡萄糖琼脂对照培养基R2A 琼脂对照培养基麦康凯琼脂对照培养基胰酪大豆胨液体对照培养基木糖赖氨

8、酸脱氧胆酸盐琼脂对照培养基RV 沙门菌增菌液对照培养基沙氏葡萄糖液体对照培养基三糖铁琼脂对照培养基甘露醇氯化钠琼脂对照培养基溴化十六烷基三甲铵琼脂对照培养基8.1 培养基适用性检查8.1.1菌液制备及菌落计数（参照 9 菌种）8.1.2.1胰酪大豆胨液体培养基适用性检查 ( 结果见表 2)接种不大于 100cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大 肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌至胰酪大豆胨液体培养基中， 至 3035培养 18-24 小时，每一试验菌株平行制备 2 管；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基 进行上述试验。被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。表2

9、胰酪大豆胨液体培养基适用性检查结果菌株名称菌液编号培养条件菌株稀释级胰酪大豆胨液体培养基生长状况结论金黄色葡萄球菌验证用培养基 (A)对照培养基 (B)铜绿假单胞菌验证用培养基 (A)对照培养基 (B)枯草芽孢杆菌验证用培养基 (A)对照培养基 (B)大肠埃希菌验证用培养基 (A)对照培养基 (B)乙型副伤寒沙门菌验证用培养基 (A)对照培养基 (B)结论：检验人：复核人：检验日期：复核日期：8.1.2.2沙氏葡萄糖液体培养基适用性检查 （ 结果见表 3） 接种不大于 100cfu 的白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，至 2025 培养 2-3天，每一试验菌株平行制备 2 管；同时，用相应的

10、对照培养基替代被检 培养基进行上述试验。被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。表 3 沙氏葡萄糖液体培养基适用性检查结果菌株名称菌液编号培养条件菌株 稀释 级沙氏葡萄糖液体培养基生长状况结论白色念珠菌验证用培养基 （A）对照培养基 （B）结论：检验人： 检验日期：复核人： 复核日期：8.1.2.3R2A 琼脂培养基（结果见表 4）取不大于 100cfu 的铜绿假胞杆菌液 及 枯草芽孢杆菌 液各 1ml，分别注入无 菌平皿中，立即倾入 R2A 琼脂样品培养基，每一试验菌株平行制备 2 个平皿， 混匀，凝固，置 3035培养 120 小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代 被检培

11、养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在 0.52 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。表 4 R2A 琼脂培养基计数适用性检查结果菌种类型样品培养基（ A ）对照培养基（ B ）A/B(%)菌落形态对比皿1皿2平均 A皿1皿2平均 B铜绿假胞杆菌枯草芽孢杆菌结论：检验人： 检验日期：复核人： 复核日期：8.1.2.4麦康凯液体培养基适用性检查（结果见表 5）促生长能力：分别接种不大于 100cfu 的大肠埃希菌于被检培养基和对照培 养基中，每株试验菌平行制备 2 个培养管，至 4244培养 24 小时以下。与对 照管相比较，被检试验菌应

12、生长良好。抑制能力：接种不大于 100cfu 的金黄色葡萄球菌于被检培养基中，至 4244培养 48 小时以上，试验菌应不得生长。表 5 麦康凯液体培养基适用性检查结果培养条件试验菌液名 称培养基菌液编 号菌液 稀释 级结果大肠埃希菌验证用培养 基麦康凯 液体培 养基对照培养基麦康凯 液体培 养基金黄色葡萄 球菌验证用培养 基麦康凯 液体培养基对照培养基麦康凯 液体培养基结论：检验人： 检验日期： 复核人： 复核日期：8.1.2.5麦康凯琼脂培养基适用性检查（结果见表 6） 促生长能力：用涂布法分别接种不大于 100cfu 的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平板上，每株试验菌平行制备 2 个

13、平皿，至 3035培养 18 小时 以下。被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。指示能力：用涂布法分别接种不大于 100cfu 的大肠埃希菌于被检培养基和 对照培养基平板上，至 3035培养 18 小时以下，被检培养基上菌落大小、形 态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。表6 麦康凯琼脂培养基适用性检查结果培养条 件试验菌 液 名称培养基菌液编号菌液稀 释级结果大肠埃 希菌验证用培养 基麦康凯琼脂培养基对照培养基麦康凯琼脂培养基结论：检验人： 检验日期： 复核人： 复核日期：8.1.2.6RV 沙门菌增菌液体培养基适用性检查（结果见表 7）促生长能力：分别接种不大于 1

14、00cfu 的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，每株试验菌平行制备 2个培养管， 30-35培养不大于 18小时， 与对照管相比较，被检试验菌应生长良好。抑制能力：接种不大于 100cfu 的金黄色葡萄球菌于被检培养基中， 30-35 培养不少于 24 小时，测试菌株应不得生长。表 7 RV 沙门菌增菌液体培养基适用性检查结果培养条件试验菌液 名称培养基菌液编号菌液稀 释级结果乙型副伤 寒沙门菌验证用培养基RV 沙门菌 增菌液体培养基对照培养基RV 沙门菌 增菌液体培养基金黄色葡 萄球菌验证用培养基RV 沙门菌 增菌液体培养基对照培养基RV 沙门菌 增菌液体培养基结论：检验人： 检验

15、日期：复核人： 复核日期：8.1.2.7木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基适用性检查（结果见表 8） 促生长能力：用涂布法分别接种不大于 100cfu 的乙型副伤寒沙门菌被检培 养基和对照培养基平板上，每株试验菌平行制备 2 个平皿，至 3035培养 18 小时以下。被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。指示能力：用涂布法分别接种不大于 100cfu 的乙型副伤寒沙门菌于被检培 养基和对照培养基平板上，至 3035培养 18 小时以下，被检培养基上菌落大 小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。表 8 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基适用性检查结果培养条件试验菌液名 称培

16、养基菌液编号菌液稀 释级结果乙型副伤寒 沙门菌验证用培养基木糖赖氨酸脱 氧胆酸盐琼脂 培养基对照培养 基木糖赖氨酸脱 氧胆酸盐琼脂 培养基结论：检验人： 检验日期：复核人： 复核日期：8.1.2.8三糖铁琼脂培养基适用性检查（结果见表 9）指示特性：用涂布法分别接种不大于 100cfu 的乙型副伤寒沙门菌于被检培 养基和对照培养基平板上，至 3035培养 18 小时以下，被检培养基上菌落大 小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。表9 三糖铁琼脂培养基适用性检查结果培养条件试验菌液名 称培养基菌液编号菌液稀 释级结果乙型副伤寒 沙门菌验证用培养基三糖铁琼脂培养基对照培养 基三糖铁琼脂

17、培养基结论：检验人： 检验日期：复核人： 复核日期：8.1.2.9甘露醇氯化钠琼脂培养基适用性检查（结果见表 10）促生长能力：用涂布法分别接种不大于 100cfu 的金黄色葡萄球菌于被检培 养基和对照培养基平板上，每株试验菌平行制备 2 个平皿，至 3035培养 18 小时以下。被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。指示特性：用涂布法分别接种不大于 100cfu 的金黄色葡萄球菌于被检培养 基和对照培养基平板上，至 3035培养 18 小时以下，被检培养基上菌落大小、 形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。抑制能力：接种不大于 100cfu 的大肠埃希菌于被检培养基

18、中， 至 3035培 养 72 小时以上，试验菌应不得生长。表 10 甘露醇氯化钠琼脂培养基适用性检查结果培养条件试验菌液 名称培养基菌液编 号菌液稀 释级结果金黄色葡 萄球菌验证用培养 基甘露醇氯化 钠琼脂培养 基对照培养基甘露醇氯化 钠琼脂培养 基大肠埃希 菌验证用培养 基甘露醇氯化 钠琼脂培养 基对照培养基甘露醇氯化 钠琼脂培养 基结论：8.1.3.0 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基适用性检查（结果见表 11） 促生长能力：用涂布法分别接种不大于 100cfu 的铜绿假单胞菌于被检培养 基和对照培养基平板上，每株试验菌平行制备 2 个平皿，至 3035培养 18 小 时以下。被检培养基与对

19、照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。抑制能力：接种不大于 100cfu 的大肠埃希菌于被检培养基中， 至 3035培 养 72 小时以上，试验菌应不得生长。表 11 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基适用性检查结果培养条件试验菌液名 称培养基菌液编号菌液稀释 级结果铜绿假单 胞菌验证用培养基溴化十六烷基 三甲铵琼脂培 养基对照培养 基溴化十六烷基 三甲铵琼脂培 养基大肠埃希菌验证用培养基溴化十六烷基 三甲铵琼脂培 养基对照培养 基溴化十六烷基 三甲铵琼脂培 养基结论：检验人： 检验日期：复核人： 复核日期：8.1.3.1胰酪大豆胨琼脂培养基适用性检查（结果见表 12）接种不大于 100cfu

20、的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌置胰 酪大豆胨琼脂培养基，置 3035培养不超过 3 天，白色念珠菌及黑曲霉孢子悬 液置胰酪大豆胨琼脂培养基，置 3035培养不超过 5 天；每一试验菌株平行制备 2 个平皿；同时，用相应的对照培养基替代被检培 养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.52范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。表 12 胰酪大豆胨琼脂计数培养基适用性检查结果培养条件菌株名称菌液编 号菌株稀释级胰酪大豆胨琼脂培养基菌落数( cfu )A/B结论皿1皿2平均金黄色葡萄球菌验证用培养基 (A)对照培养基 (B)铜绿假

21、单胞菌验证用培养基 (A)对照培养基 (B)枯草芽孢杆菌验证用培养基 (A)对照培养基 (B)白色念珠菌验证用培养基 (A)对照培养基 (B)黑曲霉验证用培养基 (A)对照培养基 (B)结论：检验人： 检验日期：复核人： 复核日期：8.1.3.2沙氏葡萄糖琼脂培养基适用性检查(结果见表 13)接种不大于 100cfu 白色念珠菌菌液及黑曲霉孢子悬液至沙氏葡萄糖琼脂培 养基，至 2025培养不超过 5 天，每一试验菌株平行制备 2 个平皿。同时，用 相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在 0.52范围内，且菌落形态大小应与对照

22、培养基上的菌落一致。表 13 沙氏葡萄糖琼脂培养基适用性检查结果培养条件菌株名称菌液编 号菌株稀释级沙氏葡萄糖琼脂培养基菌落数( cfu )A/B结论皿1皿2平均白色念珠菌验证用培养基 (A)对照培养基 (B)黑曲霉验证用培养基 (A)对照培养基 (B)结论：检验人： 检验日期：复核人： 复核日期：9. 菌种采用符合来自认可的国内外菌种保藏机构的标准菌株，参照检定菌管理规程 XYK/SMP-QC001、5 USP40药典通则 61、USP40药典通则 62，进行菌种复苏、传 代、保 存、 菌液 制备 、菌落 计数 及销 毁， 填 写 XYK/REC-QC031菌种 接收 XYK/REC-QC0

23、3菌4 种发放领用记录， XYK/REC-QC03菌2 种传代记录，YK/REC-QC035 菌种计数检查记录， XYK/REC-QC03菌6 悬液制备和使用记录， XYK/REC-QC03菌3 种保存检查记录， XYK/REC-QC03菌6 种、培养基、菌悬液销毁记录。表 14 菌种息概况菌种名称斜面编号菌液编号菌液制备日期枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌乙型副伤寒沙门菌白色念珠菌黑曲霉9.1 菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌 乙型副伤 寒沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上， 30- 35培养 18? 24 小时；

24、将白色念珠菌、 黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基 上或沙氏葡萄糖液体培养基中， 20- 25培养 2? 3 天。取新鲜的大肠埃希菌、 金 黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、乙型副伤寒沙门菌 新鲜培养物，用 pH7.0 无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液；取黑 曲霉的新鲜培养物加入 35ml含0.05%聚山梨酯 80的pH7.0无菌氯化钠 -蛋白胨 缓冲液，将孢子洗脱。然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05%聚山梨酯 80的 pH7.0无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的黑曲霉孢 子悬液。做活菌计数备用。9.2、菌落计数 金黄色葡萄球菌、铜

25、绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒 沙门菌：取上述制备的备用菌液三个稀释级各 1ml，分别注入平皿中，再在每皿 中加入不高于 45的胰酪大豆胨琼脂培养基约 20ml，每株菌每稀释级平行测定 两皿，3035培养不超过 3 天，计数，选择菌落数小于 100cfu的稀释级菌液试 验（结果见表 15）白色念珠菌、 黑曲霉菌液： 取上述制备的白色念珠菌菌液、 黑曲霉孢子悬液 备用的三个稀释级各 1ml，分别注入平皿中， 再在每皿中加入不高于 45的胰酪 大豆胨琼脂培养基约 20ml，每株菌每稀释级平行测定两皿， 3035培养不超过 5 天，计数，选择菌落数小于 100cfu 的稀释级菌液试

26、验（结果见表 15）。白色念珠菌、 黑曲霉菌液： 取上述制备的白色念珠菌菌液、 黑曲霉孢子悬液 备用的三个稀释级各 1ml，分别注入平皿中， 再在每皿中加入不高于 45的沙氏 葡萄糖琼脂培养基约 20ml，每株菌每稀释级平行测定两皿， 2025培养不超过 5 天，计数，选择菌落数小于 100cfu 的稀释级菌液试验（结果见表 15）。表 15 菌落计数结果表试验菌名 称培养基名称菌液编号培养 条件菌液稀释级选用 稀释 级10-510-610-7皿1皿2平 均皿1皿2平 均皿1皿2平 均金黄色葡 萄球菌胰酪大豆胨 琼脂培养基铜绿假单 胞菌胰酪大豆胨 琼脂培养基枯草芽孢 杆菌胰酪大豆胨 琼脂培养基大肠埃希 菌胰酪大豆胨 琼脂培养基白色念珠 菌胰酪大豆胨 琼脂培养基黑曲霉胰酪大豆胨 琼脂培养基白色念珠 菌沙氏葡萄糖 琼脂培养基黑曲霉沙氏葡萄糖 琼脂培养基乙型副伤 寒沙门菌胰酪大豆胨 琼脂培养基