高糖刺激肾小球系膜细胞Bcl2SmacFas的表达研究.docx

1、高糖刺激肾小球系膜细胞Bcl2SmacFas的表达研究高糖刺激肾小球系膜细胞Bcl-2、Smac、Fas的表达研究（作者:_单位: _邮编: _） 【摘要】 目的:研究高糖刺激肾小球系膜细胞后，凋亡相关基因Bcl-2、Smac、Fas的表达情况。方法: 将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分为正常对照组（糖浓度为5.6 mmol/L）和高糖组（糖浓度为30 mmol/L），采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同作用时间（12 h、24 h、36 h、48 h）下，系膜细胞的增殖状况，且在各时间点，采用免疫荧光染色法观察Bcl-2、Smac、Fas的表达情况并测定其荧光强度。结果：MTT比色法检测

2、结果显示高糖组较对照组系膜细胞增殖明显，与作用时间呈正相关。同时，免疫荧光检测结果显示高糖组Bcl-2在以上不同时间作用下，与对照组相比，荧光强度增强（P0.05），且高糖组随作用时间的延长，强度也相应增强，24 h、36 h、48 h各时间点的荧光强度与12 h相比，差异有统计学意义（P0.05）。而Smac、Fas的荧光强度与对照组相比则减弱（P0.05），且随作用时间的延长，强度也逐渐减弱，24 h、36 h、48 h各时间点与12 h相比，差异有统计学意义（P0.05）。Bcl-2的荧光强度与Smac或Fas的荧光强度之间存在明显的负相关关系（P0.05）。Smac的荧光强度与Fas的

3、荧光强度之间存在明显的正相关关系（P0.05）。结论：高糖刺激系膜细胞后，细胞增殖明显， Bcl-2的表达增加，Smac、Fas的表达下降，呈时间依赖性。 【关键词】 肾小球系膜细胞 高糖 Bcl-2 Smac FasAbstract Objective: To investigate the expression of apoptosis gene associated with Bcl-2, Smac, Fas in glomeruli mesaginal (Mcs) cells under high concentration glucose. Methods: Mcs cells we

4、re divided into two groups: control group(with normal concentration glucose, 5.6 mmol/L), high glucose group(with high concentration glucose, 30 mmol/L). Using MTT assay, the proliferation of Mcs after 12 h、24 h、36 h、48 h was examined respectively. The expression of Bcl-2、Smac、Fas in Mcs cells was o

5、bserved by fluorescence microscope at each time point mentioned above and the fluorescent intensity was calculated by image analysis system. Results: The proliferation of Mcs cells under high concentration glucose was more obvious, compared with controls（P0.05), and was found in a time-dependent man

6、ner. At these time points, the fluorescent intensity of Bcl-2 in high concentration glucose was stronger than controls（P0.05). But the fluorescent intensity of Smac, Fas was weaker（P0.05). And the effects were in time-dependent manners. In Mcs cells under high concentration glucose, the effects of 2

7、4 h, 36 h, 48 h were more obvious than that of 12 h. The correlation between the fluorescent intensity of Bcl-2 and the fluorescent intensity of Smac or Fas was negative（P0.05) The correlation between the fluorescent intensity of Smac and the fluorescent intensity of Fas was positive（P0.05). Conclus

8、ion: High concentration glucose can promote the proliferation of Mcs. In Mcs cells under high concentration glucose , the expression of Bcl-2 increases, while the expression of Smac and Fas decreases, compared with controls.Key words Glomeruli mesaginal cell; High concentration glucose; Bcl-2; Smac;

9、 Fas增生性肾小球肾炎的早期病变表现为球内细胞数量和（或）细胞外基质的异常增多，随着病变发展呈球内硬化，甚至全球硬化，并引起严重的肾功能障碍。肾小球细胞的异常增殖尤其是系膜细胞的异常增殖是肾小球炎症的基本病变，是导致细胞外基质异常堆积和肾小球硬化的一个共同途径。因而遏制球内细胞和基质的异常增多，是有效防治肾小球硬化的关键。以往研究多集中在增殖方面，随着凋亡研究的不断深入，发现维持细胞数目稳定需要增殖与凋亡两者作用的平衡。细胞凋亡参与了肾脏正常发育和肾脏病发生等多个过程。细胞凋亡受多种因素调控，在自身免疫性疾病及其肾脏损害的发病过程中，凋亡相关基因Bcl-2、Fas备受关注，近年来对新发现的一

10、种促凋亡基因Smac研究也逐渐升温。Smac通过诱导procaspase-3的活性及增加成熟Caspase-3的酶活性促进凋亡，这两种功能均依赖于IAPs与Smac的相互作用。目前国内对凋亡基因Bcl-2，Fas研究较多，Smac研究尚不多见，尤其是Smac与Fas及Bcl-2的关系国内外报道少见。我们通过高糖刺激肾小球系膜细胞增殖，同时观察凋亡基因Bcl-2、Smac、Fas表达的变化，以探讨高糖刺激对系膜细胞增殖和凋亡的影响及其机制，进一步了解糖尿病肾病的发病机制，从而为糖尿病肾病的防治提供理论依据，对预防其发生，延缓其进展，具有重要的理论和实践意义。1 材料与方法1.1 材料 （1）细胞

11、：肾小球系膜细胞购自上海第二军医大学附属长征医院肾内科肾脏病实验室，是大鼠系膜细胞系；（2）试剂：DMEM粉剂购于GIBCO公司，胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶和四甲基偶氮唑蓝（MTT）购于AMRESCO公司，二甲亚砜（DMSO）购于上海实生公司。抗体：兔抗大鼠Bcl-2、兔抗大鼠Fas和荧光素标记羊抗兔IgG购于北京博奥森，羊抗大鼠Smac(C-20) 和荧光素标记驴抗羊IgG购于美国Santa Cruz公司。1.2 方法1.2.1 MTT法测定系膜细胞增殖状况 将铺满培养瓶底的310代系膜细胞胰酶消化，用吸管充分吹打成单细胞悬液，进行细胞计数。用含10%FCS的DME

12、M培养液，调细胞密度为1104个/ml。取细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔200 L。待培养至60%70%的融合度时，改用含2%FCS的DMEM培养液培养，于不同时间点换成含10%FCS的培养液。实验组换高糖培养液，对照组换低糖培养液，每孔200 l，每组设4个复孔，用MTT法测定A570吸光度。1.2.2 免疫荧光法观察系膜细胞Bcl-2、Smac、Fas的表达情况并测定其荧光强度 对数生长期的系膜细胞胰酶消化后制成单细胞悬液，接种于24孔培养板，当细胞达到60%70%融合后，换含2%胎牛血清的培养液同步化。于不同的时间点，对照组（低糖组）和实验组（高糖组）加入相应的培养液，每组设4个复孔

13、。对细胞染色，检测荧光强度。1.2.3 统计学方法 运用Stata 7.0统计软件包对相关数据资料进行统计处理。计量资料以xs表示，用方差分析，两两比较用q检验，两变量关系用直线相关与回归分析。检验水准均取=0.05。 2 结 果2.1 高糖刺激下，肾小球系膜细胞持续增殖 为了观察高糖对肾小球系膜细胞增殖情况的影响，把肾小球系膜细胞分别培养在葡萄糖浓度为30 mmol/L（高糖组）和5.6 mmol/L（对照组）的培养基中。用MTT法检测系膜细胞增殖状况，高糖组与对照组相比，细胞明显增殖（P0.05），见表1。高糖组随刺激时间延长，增殖作用也更明显。2.2 高糖刺激下，肾小球系膜细胞Bcl-2

14、、Smac、Fas蛋白的表达 高糖刺激下，系膜细胞持续增殖，是否由于凋亡被抑制，是否与某些调亡基因有关？为了解决这个问题，我们采用了免疫荧光法观察高糖培养后系膜细胞的凋亡相关基因（Bcl-2、Smac、Fas）表达变化。高糖培养系膜细胞12 h，24 h，36 h，48 h后，胞浆所显示的Bcl-2绿色荧光较低糖(对照)组明显增强（图1），且随时间延长作用越明显。低糖组12 h，24 h，36 h，48 h的绿色荧光强度之间没有明显改变。高糖同样作用于系膜细胞后，胞浆所显示的Smac绿色荧光较低糖（对照）组明显减弱，低糖组各时间点间的荧光强度没有明显改变,而高糖组随着时间的延长，荧光强度逐渐减

15、弱（图2）。同样处理后，胞浆所显示的Fas绿色荧光较低糖（对照）组明显减弱，低糖组各时间点的荧光强度之间没有明显改变，而高糖组随着时间的延长，荧光强度逐渐减弱（图3）。为了对Bcl-2、Smac、Fas蛋白表达变化进行定量分析，观察各组间表达是否有差异，我们使用图像分析系统来测定荧光强度，统计结果见表2，Bcl-2在不同作用时间（12 h、24 h、36 h、48 h）下，与对照组相比，荧光强度增强（P0.05），且随作用时间的延长，强度也相应增强，高糖组在24 h，36 h，48 h，与12 h相比，差异有统计学意义（P0.05）。而Smac、Fas的荧光强度与对照组相比则减弱（P0.05）

16、，且随作用时间的延长，强度也逐渐减弱，高糖组在24 h，36 h，48 h，与12 h相比差异有统计学意义（P0.05）。糖刺激系膜细胞各时间段Bcl-2、Smac、Fas表达的相关与回归分析结果显示，Bcl-2的荧光强度与Smac的荧光强度之间存在明显负相关（r=-0.9969，P0.05），回归方程是Y=264.9157-0.9399515x。Bcl-2的荧光强度与Fas的荧光强度之间存在明显负相关（r=-0.9986，P0.05），回归方程是Y=282.9206-0.9897176x。Smac的荧光强度与Fas的荧光强度之间存在明显正相关（r=0.9994，P0.05），回归方程是Y=4

17、.183698+1.050507x。3 讨 论Gosio2研究发现，葡萄糖浓度从1 gL至4.5 gL对系膜细胞生长具有双重作用，培养2448 h可刺激细胞增生，而培养7296 h则抑制细胞增生。我们的实验也证实了这一点，高糖刺激系膜细胞12 h、24 h、36 h、48 h后，系膜细胞明显增殖，随时间作用的延长，增殖越明显。我们的研究表明：高糖组Smac的荧光强度明显减弱，随时间延长，作用更明显。这提示高糖状态改变了凋亡基因Smac的表达，使Smac的表达下调，抑制了细胞的凋亡。近年又有研究表明Bcl-2家族通过减低或增加线粒体膜的通透性而调节促凋亡因子的释放，高表达Bcl-2不仅抑制细胞色

18、素c氧化酶从线粒体的释放，同时抑制Smac的释放4-6。我们研究也发现，高糖刺激系膜细胞12 h、24 h、36 h、48 h后凋亡基因Smac的平均荧光强度逐渐减弱，而Bcl-2的平均荧光强度逐渐增强，Smac的表达和Bcl-2的表达之间存在着负相关的关系，可能和上述机制有关。本实验研究表明，高糖组Fas的荧光强度明显减弱，也呈时间依赖性。提示高糖刺激后肾小球系膜细胞增生也可能部分是由于Fas的低表达阻止了Mcs的死亡所致。近来也有文献报道Bcl-2通过激活磷脂酶A2抑制Fas介导的细胞凋亡过程3。而我们的实验结果提示，Fas的表达与Bcl-2的表达之间存在着负相关的关系，其机制可能与此有关

19、。已有研究表明，糖尿病肾病早期以肾脏体积增大和细胞增生为特征。并且近来有报道细胞凋亡可能参与了糖尿病肾病的发病机制7。根据本研究的结果，我们可以推断：高糖刺激的肾小球系膜细胞增生可能部分是由于Bcl-2的表达上升，Smac、Fas的表达下降而引起的细胞凋亡抑制。提示糖尿病肾病早期细胞异常增殖，凋亡被抑制，致使机体不能及时清除增殖细胞，而导致细胞外基质异常堆积，最后发展为晚期的肾小球硬化。因此，可以尝试通过增加或降低某些特定的细胞对凋亡的敏感性来寻找干预糖尿病肾病早期进展的新方法和药物；同时凋亡受一系列相关基因如Bcl-2、Smac、Fas的调控，可以通过调控其表达强度来诱导或抑制细胞凋亡，这有

20、可能成为防治糖尿病肾病的又一新途径。【参考文献】 1 Morris MC, Heitz A, Mery J, et al. An essential phosphorylation-site domain of fuman cdc25C interacts with both 14-3-3 and cyclinsJ. J Biol Chem, 2000, 275(37): 28849-28857. 2 Wolf G，Sehroeder R，Zalmer G，et a1. High glucose -induced hypertrophyofmesmlgial cells requires p2

21、7，an inhibitor of cyclin-dependent kinaseJ Am J Pathol,2001, 158(3): 1091-1100 3 旷兴林促凋亡因子SmacDIABLO的研究进展J 国外医学临床生物化学与检验学分册，2003，24(2)：213-214. 4 Adrain C, Creagh EM, Martin SJ, et a1Apoptosis associated release of SmacD1AB1 O from mitochondria requires active caspases and is blocked by Bcl-2J EMB, 2

22、001, 20(23)：6627-6636 5 Schuler M, Green DR. Mechanisms of p53 dependent apop -tosisJ Biochem Soc Frans，2001，29 (pt6) ：681-688 6 Tsujimoto Y Cell death regulation by the Bcl-2 protein family in the MotochondriaJ J Cell Physio1, 2003, 195(2)：158-167. 7 侯玉龙，翁孝刚，王兰君. 细胞凋亡在肾脏疾病中的研究进展J. 中华现代内科学杂志，2006，3（7）：759-760. . .