P2微生物实验室安全操作手册安环中心.docx

1、P2微生物实验室安全操作手册安环中心附件三國立臺北科技大學P2以上實驗室安全操作手冊範本 安環中心100年12月15日製P2以上實驗室安全操作手冊系所/單位名稱：00000000/000000實驗室地點：00大樓0000室 實驗室指導教授：000實驗室管理人：000實驗室代理人：000 00年00月00日目 錄1.前言 12.生物安全的原則 (Principles of Bio-safety Level) 13.生物安全等級2（Bio-safety Level 2） 14.人員進出管制 25.實驗室操作規範及技巧(Laboratory Practices and Techniques) 36.

2、安全設備；初級防護設備 (Safety Equipment; Primary Barriers) 47.實驗室設施；二級防護設備 (Laboratory Facilities; Secondary Barriers) 58.實驗室防護等級 69.生物性與一般廢棄物之處理 910.實驗室之清潔與管理 1011.緊急應變處理 1012.圖表 1412.1表一、細菌清單 1412.2圖一、廢棄物清運處理路線流程圖 1512.3圖二、緊急疏散路線圖 1513.附錄 1613.1附錄一、生物安全操作台及細菌操作注意事項及應變處理方式 1613.2附錄二、人員訓練記錄 1713.3附錄三、每日實驗室例行檢

3、查表 1813.4附錄四、高溫高壓滅菌釜標準作業步驟 1913.5附錄五、滅菌釜確效實驗紀錄表 2013.6附錄六、生物安全操作櫃維修保養記錄表 2113.7附錄七、高溫高壓滅菌釜使用記錄表 2213.7附錄八、Virkon廣效高層次消毒殺菌劑之濃度配置使用說明 23前言000單位000部門位於00院區00大樓000室的實驗室，屬於生物性第二級危害實驗室(P2實驗室)，目前實驗室內部依執行相關計畫之需求建立P2級微生物實驗室。本實驗室所執行之相關計畫主要為000000000性能評估。本微生物實驗室主要利用標準方法所指定細菌進行性能分析。目前總計有00種細菌正在使用或保存，見表一。本安全操作手冊

4、主要目的為使工作人員熟悉操作與其他相關第二級生物危害微生物類(含病毒、細菌等)的潛在危險性，並且能夠在安全保證的環境下進行技術研發的工作。因此每位進入本實驗室的工作人員必須熟讀此操作手冊並符合進入本實驗室之條件。本手冊包含第二級危害實驗室的簡介，安全操作規定，生物實驗室的分類及附件，附件包含實驗室內進行微生物操作、培養，培養箱及生物安全操作台的使用規則，廢棄物處理等，工作人員請確實遵守相關安全規定，以確保工作安全。生物安全的原則 (Principles of Bio-safety Level)Containment 這個字通常被用來描述管理使用感染性物質之實驗室的安全。它的目的是為了降低或消除

5、實驗室工作者或外部環境暴露於潛在危害性物質中。Primary containment 是用於保護實驗室工作者及實驗室內部環境暴露於危害性物質中。它藉由良好的實驗室技巧及使用適當的安全設備來達成。 Secondary containment 是用於保護實驗室外部環境曝露於危害性物質中。它藉由適當的實驗室設計及正確的實驗室操作規範來達成。所以，實驗室操作規範及技巧、安全的設備和實驗室硬體的設計為containment 三要素。生物安全等級1至4的微生物對人的致病性是由最低到最嚴重；所以其防護也是從等級1為基礎，再往上逐漸加強，即是說：等級1之防護再加強成為等級2之防護，等級2之防護再加強成為等級3

6、之防護，等級3之防護再加強成為等級4之防護。1 生物安全等級2（Bio-safety Level 2）“生物安全等級2”適用於對實驗室工作人員及環境具中度的潛在性危險的特定物質時。需特別注意的有：3.1 實驗室工作人員受過使用致病物質的特殊訓練，並由適任的生物安全管理人員指導。3.2 特別小心受污染的尖銳物品。3.3 操作步驟可能產生氣霧或濺灑者，需使用I級或II級生物安全操作櫃或物理性防護設備，例如：安全的離心裝置、面罩、臉部保護等。此類微生物如：Staphylococcus aureus、 Klebsiella pneumoniae、 Trichophyton mentagrophytes

7、等，因為可能存在未知之感染物質，所以依生物安全等級2之操作。進入生物安全等級2實驗室工作人員須具有下列條件：3.4 由計畫主持人講解本操作詳細內容及本校生物操作人員安全訓練教材，人員需熟讀與熟悉本操作手冊後，經指導教授核定而完成訓練(須填寫人員訓練記錄)3.5 初次進入本實驗室工作，需由具有經且熟悉本實驗室之工作人員陪同示範一次以上。2 人員進出管制4.1 被允許之工作人員，刷卡進入P2實驗區，將一般實驗衣掛置於右面牆壁，鞋子置於右邊之鞋櫃，更換P2細菌實驗室專用鞋與實驗衣後，於準備室戴上口罩，刷卡才能進入P2實驗室。進入實驗室後戴上合適之乳膠手套，依P2實驗室之規定進行實驗操作。在工作完成後

8、，將手套、口罩脫下置於感染性垃圾桶，才離開P2實驗。在準備室以清潔劑清洗雙手才算完成，更換實驗衣與鞋子後，離開實驗室。4.2 爲維持所有實驗區、準備室壓力之正常，以維持工作環境之安全性，請進出時隨手將門關緊，不同區域之門不可同時開啟以避免發生污染。4.3 進入本區工作之人員，更換實驗區拖鞋時，均須穿上個人之襪子，以為維持公共衛生。4.4 乳膠手套使用範圍僅在實驗室內，若發現有破損請立即更換，切記不得戴上手套碰觸門把與電話。4.5 實驗結束且完成整理清潔後，才可脫手套出P2實驗區。3 實驗室操作規範及技巧(Laboratory Practices and Techniques)實驗室操作規範及技

9、巧為containment 三要素中最重要的。除了工作人員要熟知潛在危險外，對實驗技巧也必須熟練；實驗室主管必須制定一套訓練計畫並建立生物安全手冊。實驗室主管必需具備相關之背景及經驗，確實能擔任起該負責之實驗室所有事務。這些關於生物安全之事項應該經生物安全或其他健康及安全專家之評估。當基本的實驗室規範不足以管制實驗室之安全，必須再加以其他規範以滿足需求。當然，實驗室操作規範及技巧還必須配合適當的實驗室設計、安全設備及良好的管理規範。5.1 實驗室入口張貼生物性危害標示。5.2 實驗進行時，關閉實驗室門。只有被核准之人員方可進入實驗。實驗室主管有責任且具職權管制進出人員，必須建立進入實驗室政策或

10、程序中。例如：只有熟知潛在危害方可進入實驗室。先天免疫缺乏者、高危險性後天感染者，或感染後病症特殊者，禁止進入實驗室。5.3 實驗完成後必須洗手。5.4 工作區禁止：吃、喝、吸煙、儲存食物、施用化妝品等。5.5 禁止以口操作移液管。5.6 任何物質禁止放入口中，標籤禁止以舌舔。5.7 工作時穿實驗衣，且此實驗衣不可於非P2工作區域穿著。受污染之實驗衣以高壓滅菌法進行消毒。5.8 實驗室禁止穿涼拖鞋。5.9 實驗衣與自己的衣服必須分開放置。5.10 戴安全眼鏡或面罩。5.11 操作感染性物質必須配戴隔離手套，尤其手上皮膚有受傷時。5.12 小心操作以減少感染物的濺溢或氣霧之產生。5.13 工作桌

11、於每次實驗完成後與一日工作結束後以70%酒精擦拭消毒。操作中有人接觸或生物危害性物質濺溢時須立即消毒。5.14 實驗室應該保持整潔，實驗不必用到的物品不應該出現。5.15 安全操作尖銳品之政策要求為。5.15.1 並盡可能使用塑膠器材。5.15.2 不可徒手處理破碎玻璃器皿，而須使用機械式器具，如：掃帚與畚斗、鉗子、鑷子等。裝有感染性針頭、尖銳物品、及破碎玻璃的容器須先經消毒，在依據適當的法令規定處置。5.16 以防漏容器收集、處理、貯存、傳遞、運送培養物、組織或組織液樣本。5.17 所有培養物、貯存物、及其他管制廢棄物，在丟棄前需依認可之方法消毒，例如：高溫高壓滅菌法處理。若消毒須於臨近實驗

12、室處進行時，所有物品需置於耐用、防漏密閉的容器中，以利安全運送。5.18 除定期消毒外，若發生有感染性物質潑灑或其他污染情形發生時，實驗室內儀器及工作檯面須以適當的殺菌劑消毒，受污染的儀器依照政府相關單位的規定消毒及包裝後，才得移出維護修理。5.19 操作細菌、病毒或是感染性物質相關實驗時，若需使用微量吸取器進行操作微量液體之吸取，需使用含過濾頭之tip以避免發生污染，當使用完後tip需置於含10%Virkon消毒殺菌水溶液的瓶內浸泡，待瓶內空間飽和時將漂白水移除後再置於廢棄桶以進行消毒，此處理步驟由操作病毒人員視情況自行處理廢棄物。5.20 實驗室管理主管或指導教授必須建制該室之生物安全管制

13、規範。實驗室人員必須熟讀且遵守。5.21 實驗室人員必須接受感染性病原的使用防護措施之訓練。此外，若有修訂任何程序步驟須再接受額外的訓練。5.22 實驗室有任何意外必須立即向實驗室主管報告。任何藥物評估、監測及處理須紀錄及保存。4 安全設備；初級防護設備 (Safety Equipment; Primary Barriers) 實驗室管理主管或指導教授必須確認提供適當的設備，且它們被正確使用。通常這些設備符合共同之原則：6.1 避免或降低人員和感染性物質接觸。6.2 材質必須不滲透、抗腐蝕、並符合結構需求。6.3 組合上不要有粗糙的或鋸齒狀的邊。6.4 設計上要易於操作、維護、清潔及去除污染。

14、一般常用之安全設備有：移液管及移液輔助裝置(pipetting aids )、有栓蓋的試管或瓶子(screw-capped tubes and bottles )、符合P2規範之生物安全操作櫃(biological safety cabinets )、滅菌鍋(autoclaves)，個人防護裝置如安全眼鏡、隔離口罩、手套的使用、穿著實驗衣等。其他依實驗性質不同所使用之特殊設備。6.5 處理生物安全等級2所屬的物質，必須在I級或II級生物安全操作櫃中操作。6.6 工作時穿著實驗衣，以免污染外出服。並且不可將這些衣物穿離或帶離實驗室。6.7 戴隔離手套尤其當手上皮膚有破皮或出疹情形時。必要時甚至可

15、以戴兩層手套。6.8 如果預期有微生物或其他危險物質濺灑臉部，則須配戴眼部保護裝置。6.9 其他設備：如移液管及移液輔助裝置（pipetting aids）、有栓蓋的試管或瓶子（screw-capped tubes and bottles）、有蓋之離心管、其他依實驗性質不同所使用之特殊裝備。5 實驗室設施；二級防護設備 (Laboratory Facilities; Secondary Barriers)實驗室設施主要為保護實驗室人員，免於受到感染性物質之污染。設計上的主要考量為：7.1 實驗室位置，例如實驗室工作區與一般區分開，甚至採獨立棟建築，實驗室入口的氣鎖裝置。7.2 去除污染、高溫高

16、壓滅菌廢棄物處理之設施，例如滅菌鍋、焚化爐。7.3 人員衛生及清潔之安全設施，例如實驗室免接觸型之洗手裝置。7.4 防護設備，例如生物安全操作櫃 (Biological Safety Cabinet)，且符合符合P2規範。7.5 特定的空氣循環系統，以確保空氣流動的方向，以及空氣處理設施對排氣作去除污染之動作。準備室相對於走廊為正壓差(1.50.3 mmAq)，P2實驗區相對於準備室為負壓差(-20.3 mmAq)。此方面可參考ASHRAE (American Society of Heating, Refrigerating, and Air- Conditioning Engineers)

17、 出版之Applications Handbook for Heating, Ventilation, and Air- Conditioning。7.6 實驗室門必須有管制系統(如鎖或刷卡自動門) 以管制人員進出。7.7 實驗室遠離公共區域。7.8 實驗室設計必須易於清潔。不可使用地毯。7.9 實驗室要耐熱、酸、鹼、有機溶劑、耐化學品且不透水。7.10 實驗室空間不可過於擁擠，以利清掃。椅子櫥櫃表面要易於去除污染。7.11 生物安全操作櫃位置要遠離：門、可開啟之窗戶、人員走動頻繁之區域、使用上要經常拆卸之設備。7.12 照明要適當。避免反射、強光、鏡面等妨礙視覺。7.13 室內設置足量之UV

18、滅菌燈7.14 以機械式之空器循環系統來提供實驗室之進氣；空氣流由外向內，排氣不再循環至建築之任一處。7.15 高溫高壓滅菌鍋不一定要設定實驗室內，但在一個區域內例如同一層樓或同一棟建築必須至少要設定一座。6 UCSD實驗室防護等級（註：本項可置於附錄）生物研究涉及潛在危險性生物的UCSD實驗室防護等級生物安全等級(BSL)BSL-1BSL-2BSL-2設備中BSL-3實踐BSL-3A.危險等級危險的程度低危險E. coli K-12低中流行性感冒病毒,真菌, 細菌, 皰診病毒B 型肝炎病毒冠狀病毒 (*SARS除外)中高BSL-3實驗由IBC授權BSL-2設備實踐高結核病人體免疫缺損病毒愛滋

19、病病毒布魯氏桿菌B.標準的微生物學實驗1. 當實驗中公眾接近不推荐BSL-2實驗中限制公眾接近限制的不允許2. 每日防護溢出/每日溢出/每日溢出/每日及完成危險性生物材料的工作時溢出/每日及完成的工作時3. 危險性生物廢物消毒在處置前或者透過UCSD感染性廢棄物合約商BFI在處置前或者透過UCSD感染性廢棄物合約商BFI在處置前或者透過UCSD感染性廢棄物合約商BFI/要點1.在移出建築物前4. 移液管機械的機械的機械的機械的5. 吃、喝、使用化妝品或隱形眼鏡僅僅在指定的乾淨地區僅僅在指定的乾淨地區任何時間都不允許任何時間都不允許6. 洗手設備必須的必須的必須的（足、肘、電子操作）必須的（足、

20、肘、電子操作）7. 最少空氣傳染程序必須的必須的必須的必須的8. 實驗衣推薦（前扣）需要（前扣）潛在曝露在危險性生物材料工作人需使用後扣纏繞衣需要使用後扣纏繞衣C. 特殊實驗1. 壓力鍋不需要一定需要一定需要/要點1.先於實驗室需要2. 昆蟲/齧齒目動物防治計畫必須的必須的必須的必須的3. 消毒運離實驗室之危險性生物材料廢物雙層紅色袋子放入耐用、密閉、特定標記、防滲漏容器雙層紅色袋子放入耐用、密閉、特定標記、防滲漏容器雙層紅色袋子放入耐用、密閉、特定標記、防滲漏容器雙層紅色袋子放入耐用、密閉、特定標記、防滲漏容器要點1.必須把危險性生物廢物需由負責實驗室工作者以雙層紅色袋子放入耐用、密閉、特定

21、標記、防滲漏容器，並放在上鎖的UCSD感染性廢棄物合約廠商BFI廢物處理地區或壓力鍋中。（廢物允許留在實驗室裡過夜）D. 防護設備1. 生物安全工作櫃（BSC）不需要所有產生空氣傳染為程序需要所有危險性生物介質工作需要所有工作需要2. 其他物理防護設備使用後必須消毒當用危險性生物材料產生空氣傳染危險要使用物理防護（要點2）使用高濃度/大量體積危險性生物材料，如果使用密封或離心機的安全杯子則開放實驗室可使用離心機。唯有在生物安全工作櫃中才能打開杯子使用。設備使用後必須立刻消毒。當用危險性生物材料產生空氣傳染危險要使用物理防護裝置，如：離心機安全杯子、密封的離心機轉子和動物防護籠子。（要點3）設備

22、使用後必須立刻消毒當用危險性生物材料產生空氣傳染危險要使用物理防護裝置，如：離心機安全杯子、密封的離心機轉子和動物防護籠子。（要點3）設備使用後必須立刻消毒3. 冰箱冷凍庫不需要生物危險性符號需要生物危險性符號需要生物危險性符號，並且必須貼標籤於容器需要生物危險性符號，並且必須貼標籤於容器4. BSC檢定每年檢定每年檢定每年檢定每年檢定5. HEPA過濾的真空管線推薦必須的必須的必須的6. BSC工作表面消毒每日及溢出時在每次使用後需要必須的必須的7. 在防護室BSC內工作時的個人保護設備當處理感染的動物、危險性生物材料需要手套當處理感染的動物、危險性生物材料需要手套、保護衣服（要點4）當處理

23、感染的動物、危險性生物材料需要手套、保護衣服（要點4）當處理感染的動物、危險性生物材料需要手套、保護衣服（要點4）8. 在防護室BSC外工作時的個人保護設備當處理感染的動物、危險性生物材料需要手套當處理感染的動物、危險性生物材料需要手套、保護衣服，當有感染的動物應加NIOSH N95人工呼吸機當處理感染的動物、危險性生物材料需要手套、保護衣服，當有感染的動物應加NIOSH N95人工呼吸機當處理感染的動物、危險性生物材料需要手套、保護衣服，當有感染的動物應加NIOSH N95人工呼吸機要點2. 危險性生物材料的程序包括離心力、磨削、混合、強力震動、拌合、聲破壞、開容器時其內部壓力不同於環境壓力

24、。及預防接種動物、從動物或雞蛋獲得感染的組織。要點3. 危險性生物材料空氣傳染來源的程序，包括操縱培養診所或環境的材料。空器傳染之挑戰，如從實驗動物或雞蛋獲得感染的組織、和傳染的動物的屍體檢驗。要點4. 需要於空氣傳染產生設備、使用高濃度大量體危險性生物材料、診所樣品、及人類、傳染的動物或雞蛋之體液和組織。人類細胞培養、傳染的動物的屍體檢驗。E. 實驗室設備1. 通風負壓力、空氣沒有再循環到建築物其他地區負壓力、空氣沒有再循環到建築物其他地區空氣流動從低危險性到更高的危險地區、空氣不可再循環負壓力、空氣不可再循環2. 標示危險性生物材料不需要需要標示於儲存BSL-2材料室門。及需要實驗工作的地

25、區需要標示於儲存BSL-3材料室門。及需要實驗工作的地區需要標示於儲存BSL-3材料室門。及需要實驗工作的地區3. 工作檯工作允許僅允許低危險程序不允許危險性生物材料不允許4. 可開窗口用防蒼蠅網時允許用防蒼蠅網時允許不允許不允許5. 實驗室與一般公眾場所分離不需要不需要需要，當危險性生物材料工昨時必須關閉和鎖門需要，門必須全時關閉F. 其他要求1. 技術訓練需要及文件化一年兩次訓練及文件化每月訓練及文件化每月訓練及文件化2. 醫療檢查（最少血檢）適時需要適時需要必須的必須的3. 溢出.意外立即對實驗室主任報告、適當之醫療評估、檢查、處理，保留原實驗記錄立即對實驗室主任報告、適當之醫療評估、檢

26、查、處理，保留原實驗記錄立即對實驗室主任報告、適當之醫療評估、檢查、處理，保留原實驗記錄立即對實驗室主任報告、適當之醫療評估、檢查、處理，保留原實驗記錄4. 生物安全手冊手冊應以準備或採用，並要求人員對其中策略程序熟悉手冊應以準備或採用，並要求人員對其中策略程序熟悉手冊應以準備或採用，並要求人員對其中策略程序熟悉手冊應以準備或採用，並要求人員對其中策略程序熟悉7 生物性與一般廢棄物之處理 （註：可參考校內P2實驗室廢棄物分類處理清運流程）本實驗室所產生之廢棄物分為生物性廢棄物與一般廢棄物兩類:9.1 生物性廢棄物指本實驗室所產生之細菌、細菌培養液、等生物性物質或曾與上述物質接觸後所產生之廢棄物

27、，如使用過後之培養瓶、培養皿、玻璃或塑膠吸管、離心管等均屬之。9.1.1. 固態生物性廢棄物:手套、口罩和固體廢棄物皆須置於2層大型滅菌袋內(有紅色生物性為害標示圖案)，需加以密閉以避免污染，並將密封好之廢棄物，依院內廢棄物清運系統申請處理。為利高壓滅菌之進行，清運過程中需要兩位人員協同進行，帶有手套人員負責清運廢棄物，另一位未帶手套人員則是協助開啟各區之門以利運送。固態生物性廢棄物處理(在滅菌袋外貼上滅菌標示膠帶)以高溫高壓滅菌釜於121C，1.1kg/cm2下滅菌30分鐘後，依院內廢棄物申報處理程序處理。9.1.2. 液態生物性廢棄物:放置在不銹鋼提籃，以高溫高壓滅菌釜於121C，1.1k

28、g/cm2下滅菌30分鐘後，依院內廢棄物申報處理程序處理。玻璃試管和血清瓶再依一般實驗器皿清洗。9.2 一般廢棄物指非第1點所述之物，而無危害性者，一般性廢棄物則由清潔人員依一般事業廢棄物處理。9.3 實驗進行有時間的延續性，當天實驗其液態和固態生物性廢棄物產出後，液態廢棄物進行高溫高壓滅菌；固態廢棄物依9.1.1步驟，並噴灑消毒劑封口。待隔天實驗結束後，進行高溫高壓滅菌的廢棄物清運處理程序處理之。P2生物實驗室廢棄物分類處理清運流程8 實驗室之清潔與管理10.1 每天定期安全檢查並記錄。10.2 生物安全操作台之初級濾網應每三個月進行定期更換，替換掉之初級濾網需經滅菌袋封裝後，噴灑70%酒精

29、或1%Virkon消毒水溶液處理後，才能依廢棄物申報，依校內廢棄物清運系統申請處理。生物安全操作台每年委外校驗公司進行檢測風速與落塵數校正。10.3 空調系統濾網之更換: 委外校驗公司進行初級、中級與高級濾網之定期更換並填寫更換記錄，以維護本實驗室內環境之安全品質。10.4 進行細菌或感染性物質相關實驗時，操作用具若直接接觸細菌液時，需以1%Virkon消毒殺菌水溶液，進行浸潤1824hr消毒才可置於廢棄桶內。9 緊急應變處理11.1 生物試劑洩漏緊急應變處理11.1.1 櫥櫃內(生物安全櫃)洩漏處理：11.1.1.1 保持生物安全櫃功能之運作。(增設不斷電系統之110V和220V電源插座)1

30、1.1.1.2 穿著個人防護器材：手套、安全眼鏡、實驗衣等。11.1.1.3 將擦拭紙放置於洩漏區上。11.1.1.4 使用殺菌劑（如1%Virkon消毒水溶液）清潔櫥壁、工作面及凹槽。使用殺菌劑時應避免噴濺。11.1.1.5 讓殺菌劑停滯污染面1020分鐘。11.1.1.6 以擦拭紙擦拭或吸收所有的殺菌劑，將吸收棉紙放入標示有生物性危害紅色袋中，以生物性廢棄物處理。11.1.1.7 再以殺菌清潔劑清洗所有暴露面。11.1.1.8 以殺菌劑清潔生物安全櫃內部，包括更換初級濾網，替換掉之初級濾網放入標示有生物性危害紅色袋中，需經高壓滅菌處理後，依醫療廢棄物處理，若有紙製物或其他會吸收液體之物質則直接當生物性廢棄物處理。11.1.1.9 清潔與更換濾網完畢後，將UV(紫外光燈)開啟，至少3小時至隔夜。11.1.1.10 於生物安全櫃玻璃門張貼消毒中，禁止開啟相關字樣。11.1.1.11 如果櫥櫃有大量樣本洩漏，需立即停止所有作業立即投入緊急應變處理，並聯繫專職工安人員協助處理。11.1.2 實驗室內洩漏處理11.1.2.1 穿著個人防護器材：手套、安全眼鏡、實驗衣等。