最新 母细胞中心体纤毛膜指导子细胞纤毛发生.docx

1、非对称遗传：母细胞中心体相关的纤毛膜指导子细胞的纤毛发生纤毛（cilia）是由微管（microtubule）及其附属蛋白（appendage proteins）组成，包覆有特化细胞膜并突出于细胞表面的特殊结构并存在于多种组织、细胞的表面，如神经元，脑膜， 输卵管等。细胞的纤毛，就如同昆虫的触角一般，是细胞感受外界环境变化的重要细胞器， 与细胞运动（原生动物中），信号转导，增殖分化以及组织、个体发育过程密切相关。初级纤毛是细胞中由纤毛膜（ciliary membrane, CM）包覆的 9 条微管环绕形成的线状凸起结构，基部定位于由母中心粒（mother centriole）以及相关附属蛋白（a

2、ppendage proteins） 组成并与细胞质膜相连的基体（basal body）上。纤毛膜是特化的细胞质膜，尽管在结构上是细胞质膜的连续，但周围的膜蛋白却无法进入纤毛。目前学界普遍认为，初级纤毛在细胞有丝分裂期之前解体，使得中心粒可以在纺锤体两极位置发挥作用；而在在细胞分裂末期，来自母细胞的一个子中心粒（daughter centriole） 成熟为新的母中心粒，并在新分裂形成的子细胞的 G1 期早期形成新的纤毛核心。在大脑皮层（neocortex）的发育过程中，初级纤毛从上皮神经干细胞（即顶端祖细胞 apical progenitors, APs ）的顶膜向侧脑室（lateral v

3、entricle）延伸，此时，细胞可通过纤毛结构检测到脑脊液（CSF）中的各种信号分子。在神经发生（neurogenesis）起始之后，APs 从对称增殖的方式转换为非对称分化，通过 APs 直接分化或脑表面的基底层祖细胞（fate-restricted basalprogenitors）产生新的神经元。在果蝇（Drosophila germline）和小鼠脑皮层（mouse neocortex） 形成过程中，中心体的非对称遗传与干细胞特性的保持相关：继承了母中心粒的子细胞能够和母细胞一样，继续保持干细胞特性；而在细胞培养过程中发现，继承母中心粒的子细胞比另一个子细胞能够更快地重建纤毛结构，这

4、种非同步性差异揭示了子细胞对初级纤毛所携带的某种信号的不同反应。Why目前，作为初级纤毛（primary cilia）成核中心的中心粒（centriole）及其在有丝分裂中的非对称遗传（asymmetric inheritance）行为已经有很多学者进行了研究，根据相关的研究结果，中心体相关结构的继承与子代细胞间的非对称细胞命运（cell fate）调控有着密切的关联，但是，作为中心体相关结构之一，包覆在纤毛表面的纤毛膜（CM）在细胞分裂过程中的命运尚不十分明确。What作者发现，与先前的被普遍接受的观点相反，初级纤毛并未在细胞的有丝分裂期之前完全解体，而且母细胞初级纤毛的残余物质（CR, c

5、iliary remnant,包括中心粒及附属蛋白，纤毛膜和纤毛膜上携带的各种蛋白）可通过非对称遗传的方式传递给两个子细胞并造成两个子细胞的行为上的差异（如新纤毛的重建时间差异），同时，CR 的非对称遗传还在很大程度上影响了子细胞的命运决定（分化成为神经元 neuron 或成为保留干细胞特性的 APs）。How通过免疫荧光技术、免疫电镜技术以及构建融合蛋白的方法，对不同发育阶段的小鼠胚胎 APs 中 Arl13b（指示 cilia 或CM 位置）和 r-tubulin（指示中心粒位置）进行定位并对其在APs 不同分裂期以及神经发生不同阶段的相对位置进行持续观察，确定 CM 与中心粒之间的联系以

6、及细胞分裂、分化过程中的去向；通过对非对称遗传母细胞 CR 的子细胞的行为（如纤毛重建时间，子细胞命运等）和相关信号蛋白（ Smoothened）的研究（包括定性观察和定量分析），最终确定 CR 与子细胞行为之间的相互关联。Result1. 含 Arl13b（ADP-ribosylation factor-like 13b,一种 GTP 蛋白）的膜结构与有丝分裂期的顶端祖细胞（apical progenitors, APs）的中心体存在关联。Figure 1：Arl13b 与 r-tubulin 在 APs 中的定位A：小鼠胚胎发育第 12.5 天（E12.5）时， Arl13b（红色，指示初

7、级纤毛位置）和中心体（黄色，标记 r-tubulin，指示微管蛋白位置）在 APs 细胞中的定位。Arl13b 是初级纤毛膜特有的蛋白，可作为CM 的标记，在小鼠皮层的形成过程中与 APs的顶端膜相互区分。B. 单个 APs 细胞有丝分裂过程，Arl13b 蛋白与母细胞的两个中心体中的一个相互联系并最终被一个子细胞所继承。此外，在多数的 APs 的中心体附近都发现有Arl13b 的定位（Fig.1.E）。C. 有丝分裂过程中 APs 细胞的透射电镜图。黑色箭头：中心粒附近的细胞膜；紫色箭头：初级纤毛膜；青色箭头：末端附属蛋白；黄色箭头：中心粒。使用电子显微镜分析 Arl13b 的亚细胞定位，可

8、在大多数分裂期 APs 的纺锤体一端的中心体上发现有膜状结构并且这些结构与大型膜泡相连。D. E12.5 中期 APs 细胞中 Arl13b 的定位，图 1 为 Arl13b 的免疫荧光，图 4 中的颗粒为中心粒吸附的免疫胶体金颗粒，荧光与胶体金两者的位置重合。白色三角：纤毛；白色/黑色/紫色箭头：纤毛膜（CM）；黄色箭头：中心粒。EE12.5（小鼠胚胎发育第 12.5 天）的 APs 在有丝分裂不同阶段中，可检测到中心体相关Arl13b 蛋白免疫荧光信号的细胞占总细胞的比例（数据源自 Fig.5C）。从中可见，在有丝分裂过程中，多数 APs 的中心粒和 Arl13b 之间存在相互的关联。FE

9、12.5 的 APs 在有丝分裂不同阶段中出现与中心粒直接关联的纤毛膜或膜泡的细胞占总细胞的比例。黄色柱状区域为表面出现纤毛的细胞所占比例。2. 子细胞中含有 Arl13b 的纤毛膜来自于顶端初级纤毛。Figure 2：纤毛膜（CM）的内吞过程A,B： E13.5（小鼠胚胎发育 13.5 天）的单个 AP（虚线区域）的间期（A）和有丝分裂期（B） 表达的 Sstr3-EGFP 和 CAG-mCherry 等成分在细胞内的定位。LUT:表示 Sstr3-EGFP 的荧光强度。A 图右侧线框为中心体位置；箭头表示初级纤毛；B 图箭头表示被放大的区域。为了证实 Arl13b 特异性定位于纤毛膜上，作

10、者选择两种已经为人所知的纤毛膜特异性跨膜蛋白：Sstr3（somatostatin receptor 3 ）和 5HT6（serotonin 5-hydroxytryptamine receptor）, 并与 EGFP 构建融合蛋白基因并电转入分化中的 E12.5 APs 中，在 E13.5 分析 APs 的分化情况。如 Fig.2.A，Fig.2.B 所示，Sstr3-EGFP 与 Arl13b 均特异性定位于 APs 的纤毛膜区域； 5HT6-EGFP 也显示了类似的定位（数据未体现）。以上结果说明，Arl13b 的定位确实具有纤毛膜特异性。随后，作者对含有Arl13b 的纤毛膜的来源进行

11、了研究。根据分析，该纤毛膜的来源有两种可能：1）从新合成；2）内化细胞间期出现的初级纤毛膜。针对后一种可能，作者首先采用了细胞表面生物素化（cell-surface biotinylation approach ）的方法，研究了纤毛膜内吞过程是否发生于有丝分裂起始阶段，其实验原理如 C 图所示：4条件下，用 Sulfo-NHS-SS-biotin 将小鼠端脑细胞表面进行生物素化，此时细胞表面（包括纤毛表面）的膜蛋白会被标记上 Sulfo-NHS-SS-biotin；对照组细胞保持在 4条件下，此时由于温度较低，细胞不发生内吞作用；而实验组细胞被转移至 37条件下培养，随着细胞周期继续进行，纤毛

12、膜被细胞内吞；最后用荧光标记的 streptavidin 将对照组和实验组细胞中的Sulfo-NHS-SS-biotin 进行定位，发现：对照组有丝分裂期 APs 的中心体中未检测到 streptavidin 的荧光（Fig.2.D）；实验组有丝分裂期 APs 中发现有多个 streptavidin 的荧光点，其中有一个点与Arl3b 的定位相重叠（Fig.2.E,F,H,I）。以上数据说明，APs 在有丝分裂后期从细胞表面上内吞了部分质膜，这与先前电镜中观察到的初级纤毛内陷形成的膜泡结构（Fig.1.C,D）相互印证。3. 在整个有丝分裂过程中，纤毛膜与纤毛基体（中心粒）始终相互关联。以上实

13、验证明，与被广泛接受的观点相反，初级纤毛并未在有丝分裂前完全解体，并且在整个有丝分裂过程中 CM 始终与基体相联系。为了更进一步证明这一点，作者研究了 CM 相对于中心体特异性蛋白 Cep164（基体末端的附属蛋白，负责将纤毛锚定于基体）的定位以及中心体蛋白（Ninein）在 APs 中的位置。本研究中发现，EGFP 标记的 Cep164 和 Ninein 定位于基体末端（Fig.3.A,C），与已有的报道一致。另据之前的报道，EGFP 标记的 Cep164 和 Ninein 在纺锤体两端的信号强度差异（Fig.3.A-E）很可能反应出了中心粒的不同成长阶段，作者猜想，中心体中包含了高浓度的C

14、ep164 和 Ninein 以及母中心粒。Arl13b 的免疫荧光显示，在大多数有丝分裂 APs 中，含有 Arl13b 的 CM 与的母中粒相互关联（Fig.3.A-C,F）。与电镜图 1C 对比，表明在整个有丝分裂过程中，CM 通过末端附属蛋白始终与基体保持吸附状态。Figure 3：中心粒相关蛋白 Cep164，Ninein 在 APs 中的定位A E13.5APSs 表达 EGFP-Cep164 等成分在细胞有丝分裂不同阶段的定位， 白色箭头：初级纤毛（左）或中心体附近的纤毛膜（中，右）；黄色箭头：第二个中心体。EGFP 标记的Cep164 定位于基体末端（纤毛与中心粒之间）。BAP

15、s 中两个中心体上 r-tubulin 和EGFP-Cep164 的荧光信号强度。由右图可见，EGFP-Cep164 集中在一个中心体（centrosome 1，母中心粒）的位置。CE13.5APSs 表达 EGFP-Ninein 等成分细胞有丝分裂不同阶段的定位。黄色三角： EGFP-Ninein 的定位（在中心体位置附近）；白色箭头：初级纤毛（左）或中心体 1 的纤毛膜（右）；黄色箭头：中心体 2。DC 图中 r-tubulin（左）和 EGFP-Ninein（右）的荧光信号强度。黄色三角： EGFP-Ninein。黄色箭头：中心体 2。Ninein 定位于中心体侧面。E两个中心体间EGFP-Cep164 和 EGFP-Ninein 表现出信号强度差异（25%）的分裂期细胞占总细胞的比例。（MC 上的信号强于 DC）多数母中心粒上的