Bowtie2用法祥解.docx

1、Bowtie2用法祥解Bowtie2用法祥解懒人必看对参考序列构建index$ bowtie2-build genome.fasta index尝试使用前10000个reads进行比对$ bowtie2 -u 10000 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam使用8个线程进行比对$ bowtie2 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam比对的sam结果中添加了read group信息$ bowtie2 -p 8 -rg-id sample01 -rg PL:ILLUMIN

2、A -rg SM:sample01 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam 常用的参数进行比对，可以更改其中的参数获得更好的结果$ bowtie2 -q -phred33 -sensitive -end-to-end -I 0 -X 500 -fr -un unpaired -al aligned -un-conc unconc -al-conc alconc -p 6 -reorder -x -1 m1gt; -2 | -U -S 用法：bowtie2 options* -x -1 -2 | -U -S bowtie2-build用法bow

3、tie2-build默认情况下将fasta文件换成index的数据库。$ bowtie2-build 必须参数：-x 由bowtie2-build所生成的索引文件的前缀。首先 在当前目录搜寻，然后在环境变量BOWTIE2_INDEXES中制定的文件夹中搜寻。-1 双末端测寻对应的文件1。可以为多个文件，并用逗号分开；多个文件必须和-2中制定的文件一一对应。比如:-1 flyA_1.fq,flyB_1.fq -2 flyA_2.fq,flyB_2.fq.测序文件中的reads的长度可以不一样。-2 双末端测寻对应的文件2.-U 非双末端测寻对应的文件。可以为多个文件，并用逗号分开。测序文件中的r

4、eads的长度可以不一样。-S 所生成的SAM格式的文件前缀。默认是输入到标准输出。以下是可选参数：输入参数-q输入的文件为FASTQ格式文件，此项为默认值。-qseq输入的文件为QSEQ格式文件。-f输入的文件为FASTA格式文件。选择此项时，表示-ignore-quals也被选择了。-r输入的文件中，每一行代表一条序列，没有序列名和测序质量等。选择此项时，表示-ignore-quals也被选择了。-c后直接为比对的reads序列，而不是包含序列的文件名。序列间用逗号隔开。选择此项时，表示ignore-quals也被选择了。-s/-skip input的reads中，跳过前个reads或者p

5、airs。-u/-qupto 只比对前个reads或者pairs（在跳过前个reads或者pairs后）。Default: no limit.-5/-trim5 剪掉5端长度的碱基，再用于比对。(default: 0).-3/-trim3 剪掉3端长度的碱基，再用于比对。(default: 0).-phred33输入的碱基质量等于ASCII码值加上33.在最近的illumina pipiline中得以运用。最低碱基质量是“#”。-phred64输入的碱基质量等于ASCII码值加上64.最低碱基质量是“B”。-solexa-quals将Solexa的碱基质量转换为Phred。在老的GA Pipe

6、line版本中得以运用。Default: off. -int-quals输入文件中的碱基质量为用“ ”分隔的数值，而不是ASCII码。比如40 4030 40.。Default: off. end-to-end模式下的预设参数-very-fast Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 -fast Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 -sensitive Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.15 (default in -end-to-endmode) -v

7、ery-sensitive Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50loca模式下的预设参数-very-fast-local Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00 -fast-local Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75 -sensitive-local Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75 (default in -local mode) -very-sensitive-local Same as: -D

8、 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50 比对参数：-N 进行种子比对时允许的mismatch数.可以设为0或者1.Default: 0.-L 设定种子的长度.*功能选项给bowtie的一些参数设定值的时候，使用一个计算公式代替，于是值的大小与比对序列的长度成一定关系。有三部分组成: (a)计算方法,包括常数(C),线性(L),平方根(S)和自然对数(G); (b)一个常数; (c)一个系数.例如:为L,-0.4,-0.6则计算公式为: f(x) = -0.4 + -0.6 * x 为G,1,5.4则计算公式为: f(x) = 1.0 + 5.4 * ln(x)*-i 设

9、定两个相邻种子间所间距的碱基数。*例如：如果read的长度为30,种子的长度为10,相邻种子的间距为6,则提取出的种子如下所示：Read: TAGCTACGCTCTACGCTATCATGCATAAACSeed 1 fw: TAGCTACGCTSeed 1 rc: AGCGTAGCTASeed 2 fw: CGCTCTACGCSeed 2 rc: GCGTAGAGCGSeed 3 fw: ACGCTATCATSeed 3 rc: ATGATAGCGTSeed 4 fw: TCATGCATAASeed 4 rc: TTATGCATGA* 在-end-to-end模式中默认值为”-i S,1,1.1

10、5”.即表示f(x) = 1 + 1.15 *sqrt(x).如果read长度为100,则相邻种子的间距为12.-n-ceil 设定read中允许含有不确定碱基(非GTAC,通常为N)的最大数目.Default: L,0,0.15.计算公式为: f(x) = 0 + 0.15 * x,表示长度为100的read最多运行存在15个不确定碱基.一旦不确定碱基数超过15,则该条read会被过滤掉.-dpad Default: 15.-gbar 在read头尾个碱基内不允许gap. Default: 4. -ignore-quals计算错配罚分的时候不考虑碱基质量.当输入序列的模式为-f, -r或者-

11、c的时候,该设置自动成为默认设置.-nofw/-norc nofw设定read不和前导链(forward reference strand)进行比对; -norc设定不和后随链(reverse-complement reference strand)进行比对.Default: both strands enabled.-end-to-end比对是将整个read和参考序列进行比对.该模式-ma的值为0.该模式为默认模式, -local模式冲突.-local该模式下对read进行局部比对,从而, read两端的一些碱基不比对，从而使比对得分满足要求.该模式下 ma默认为2. 得分罚分参数-ma 设

12、定匹配得分. -local模式下每个read上碱基和参考序列上碱基匹配,则加分.在end-to-end模式中无效. Default: 2.-mp MX,MN设定错配罚分.其中MX为所罚最高分, MN为所罚最低分.默认设置下罚分与碱基质量相关.罚分遵循的公式为: MN + floor( (MX-MN)(MIN(Q, 40.0)/40.0) ).其中Q为碱基的质量值.如果设置了ignore-qual参数,则错配总是罚最高分. Default:MX = 6, MN = 2.-np 当匹配位点中read, reference上有不确定碱基(比如N)时所设定的罚分值.Default: 1.-rdg ,设

13、置在read上打开gap罚分,延长gap罚分.Default: 5, 3.-rfg ,设置在reference上打开gap罚分,延长gap罚分. Default: 5, 3.-score-min 设定成为有效比对的最小分值.在end-to-end模式下默认值为:L,-0.6,-0.6;在-local模式下默认值为: G,20,8.报告参数-k 默认设置下, bowtie2搜索出了一个read不同的比对结果,并报告其中最好的比对结果(如果好几个最好的比对结果得分一致,则随机挑选出其中一个).而在该模式下,bowtie2最多搜索出一个read 个比对结果,并将这些结果按得分降序报告出来.-a和-k

14、参数一样,不过不限制搜索的结果数目.并将所有的比对结果都按降序报告出来.此参数和-k参数冲突.值得注意的是:如果基因组含有很多重复序列时,该参数会导致程序运行极其缓慢.Effort 参数-D 比对时,将一个种子延长后得到比对结果,如果不产生更好的或次好的比对结果,则该次比对失败.当失败次数连续达到次后,则该条read比对结束. Bowtie2才会继续进行下去. Default: 15.当具有-k或-a参数,则该参数所产生的限制会自动调整.-R 如果一个read所生成的种子在参考序列上匹配位点过多.当每个种子平均匹配超过300个位置,则通过一个不同的偏移来重新生成种子进行比对. 则是重新生成种子

15、的次数. Default: 2.Paired-end 参数-I/-minins 设定最小的插入片段长度. Default: 0.-X/-maxins 设定最长的插入片段长度. Default: 500.-fr/-rf/-ff 设定上下游reads和前导链paired-end比对的方向. -fr: 匹配时，read1在5端上游, 和前导链一致, read2在3下游, 和前导链反向互补. 或者read2在上游, read1在下游反向互补; -rf: read1在5端上游, 和前导链反向互补, read2在3端下游, 和前导链一致; -ff: 两条reads都和前导链一致. Default: -fr

16、. 默认设置适合于Illumina的paired-end测序数据; 若是mate-paired, 则要选择rf参数.-no-mixed 默认设置下, 一对reads不能成对比对到参考序列上, 则单独对每个read进行比对. 该选项则阻止此行为.-no-discordant 默认设置下, 一对reads不能和谐比对(concordant alignment,即满足-I, -X, -fr/-rf/-ff的条件)到参考序列上, 则搜寻其不和谐比对(disconcordant alignment, 即两条reads都能独一无二地比对到参考序列上, 但是不满足-I,-X,-fr/-rf/-ff的条件).

17、 该选项阻止此行为.-dovetail read1和read2的关系为dovetail的时候,该状况算为和谐比对. 默认情况下dovetail不算和谐比对.-no-contain read1和read2的关系为包含的时候, 该状况不算为和谐比对. 默认情况下包含关系算为和谐比对.-no-overlap read1和read2的关系为有重叠的时候, 该状况不算为和谐比对. 默认情况下两个reads重叠算为和谐比对.输出参数-t/-time -un 将unpaired reads写入到.-un-gz 将unpaired reads写入到, gzip压缩.-un-bz2 将unpaired read

18、s写入到, bz2压缩.-al 将至少能比对1次以上的unpaired reads写入.-al-gz . ,gzip压缩.-al-bz2 . ,bz2压缩.-un-conc 将不能和谐比对的paired-end reads写入.-un-conc-gz . ,gzip压缩.-un-conc-bz2 . ,bz2压缩.-al-conc 将至少能和谐比对一次以上的paired-end reads写入.-al-conc-gz . ,gzip压缩.-al-conc-bz2 . ,bz2压缩.-quiet 安静模式,除了比对错误和一些严重的错误, 不在屏幕上输出任何东西.-met-file 将bowtie

19、2的检测信息(metrics)写入文件. 用于debug. Default: metrics disabled.-met-stderr 将bowtie2的检测信息(metrics)写入标准错误文件句柄. 和上一个选项不冲突. Default: metrics disabled.-met 每隔秒写入一次metrics记录. Default: 1. Sam 参数-no-unal不记录没比对上的reads.-no-hd不记录SAM header lines (以开头).-no-sq不记录SQ的SAM header lines.-rg-id 设定read group ID为text。在SAM文件的头中

20、增加一行RG，在输出的SAM文件中添加Tag RG:Z:text。-rg 使用text作为RG的一列，比如SM:Pool1。在RG中加入多列，则多次使用该参数即可。在进行Variant calling的过程中需要RG头，SM信息和Tag RG。性能参数-o/-offrate 无视index的offrate值, 以取代之. Index默认的 值为5. 值必须大于index的offrate值, 同时越大, 耗时越长，耗内存越少.-p/-threads NTHREADS 设置线程数. Default: 1-reorder 多线程运算时, 比对结果在顺序上会和文件中reads的顺序不一致, 使用该选项, 则使其一致.-mm 使用内存定位的I/O来载入index, 而不是常规的文件I/O. 从而使多个bowtie程序共用内存中同样的index, 节约内存消耗. 其它参数：-qc-filter 滤除QSEQ fileter filed为非0的reads. 仅当有qseq选项时有效. Default: off. -seed 使用作为随机数产生的种子. Default: 0.-version打印程序版本并退出-h/-help 打印用法信息并推出