免疫分析专业技术基本原理.docx

1、免疫分析专业技术基本原理免疫分析技术基本原理作者:日期： 免疫分析技术基本原理利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法 抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。按其引起免疫应答的能力分半抗原、抗原、超抗原。 抗体：由动物免疫系统产生,可特异性结合某种物质的免疫球蛋白。分IgG、 IM、 IE、 IgA、 五个亚型。不同亚型针对同一抗原表位的结合位点的结构相同。不同亚型出现的先后顺序不同,在血清中的含量不同,在机体中出现的地点不同。 抗原抗体反应的特性1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡,其反应式为：Ag+bAgAb 抗体的亲和力(afinity），

2、可以用平衡常数表示：K=Agb/gb，AAb的解离程度与值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合,两者结合牢固,不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性2 特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质,而不需先分离待检物。3 最适比例 4敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平。酶反应测定法的敏感度约为-10/ml。免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫敏感度可提高数千倍,达nl水平。例如，HBsAg,其敏感度可达1ngl。固相免疫测定的原理基础:抗原

3、或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,由此进行定性或定量分析。双抗体夹心法原理此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBAg、HBg、P等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。双抗原夹心法原理用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。间接法原理间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立

4、检测相应抗体的方法。竞争法的原理小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELIS测定多用此法。俘获法原理gM的检测常用于传染病的诊断。用抗人Ig抗体包被固相,以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IM)。此法常用于病毒性感染的早期诊断。生物素亲合素法:固相支持物；：固相化抗原;：特异性Ig(待检物）;:生物素化抗小鼠IG (ion）；:辣根过氧化物酶HR-酶

5、标链亲和素（iin）；:底物及显色剂;：显色。阳性/假阳性阳性(ptie, P)：在给定的某一判定标准下，某一测量结果符合存在条件的称为阳性。例如ELSA实验中规定，标本的测量结果大于界值判定为阳性。假阳性:真实结果不满足存在的条件,由于某些因素的干扰,导致测量结果满足存在条件的称为假阳性。在表述阳性或者假阳性时,测量方法、测量对象和适用范围一定要具体。例如，我们经常说某人HCV阳性，严格的说这是一个不规范的说法。因为可以理解为这么多的意思:此人是丙肝患者；此人HCV抗原阳性;此人C抗体阳性（可能是患者也可能不是患者）;此人HCVRNA阳性;等等等等。阴性/假阴性阴性（Netive,):在给定

6、的某一判定标准下,某一结果不符合存在条件的称为阳性。假阴性：真实结果满足存在的条件，由于某些因素的干扰,导致测量结果不满足存在条件的称为假阴性。在表述阴性和假阴性时,和表述阳性/假阳性一样,测量方法、测量对象和适用范围一定要具体。样本/标本/临床标本样本：在统计里,我们把所要考察对象的全体叫做总体， 其中每一个考察对象叫做个体， 从整体中所抽取的一部分个体叫做总体的一个样本。样本是一个统计学的概念，样本往往不只包含一个个体。标本(Samle, S)：在给定的考察或测量方法中的具体测量对象,往往和统计学的个体等价。例如在IS实验里，HCG有测血样的也有测尿样的,对应的血样或尿样叫这个测量方法的标

7、本。临床标本:在检验技术中，直接从机体采集的，经过处理而适用于临床检验的标本。例如从人体采集的抗凝血清叫临床标本，而经过稀释或浓缩的标本只能称为稀释标本或浓缩标本而不能称之为临床标本。医学决定水平医学决定水平(Mdciedecidevel， ML）：是指不同于参考值的另一些限值，通过观察测定值是否高于或低于这些限值，可在疾病诊断中起排除或确认的作用,或对某些疾病进行分级或分类,或对预后作出估计,以提示医师在临床上应采取何种处理方式，如进一步进行某一方面的检查,或决定采取某种治疗措施等等。随着检测技术的进步,某一检测指标检测灵敏度的提高,临床意义的改变，往往能改变某一疾病的医学决定水平。例如某些

8、激素项目的超敏试剂盒能帮助医师判定疾病的进程及处理对策。金标准金标准:现有条件下最科学最准确的标准。在检验学中指的是某种疾病标志物的确证实验。如菌体培养，组织切片,组织活检,抗体条带免疫印迹()，核算诊断等等。 LIA方法往往只检验某种疾病众多表征或标志物中最具代表性或最具操作性的一种或几种，即通常所说的初筛实验，追求的是灵敏、简便和快速，而这些表征或标志物的检出不能确证患病与否,所以需要更进一步的确证实验。对照实验对照实验(ontrl xrent):一般进行某种试验以阐明一定因于对一个对象的影响和处理效应或其意义时，除了对试验所要求研究的因子或操作处理外，其他因素都保持一致，并把试验的结果进

9、行比较,这种试验称为对照试验。目的是通过对比实验的结果找到想要研究的因素对实验的影响作用，从而为科学的研究提供事实依据和直接证据。对照试验有对照组和实验组。有以下常见的类型：1空白对照:即不作任何实验处理的对照组。.自身对照:即实验与对照在同一对象上进行，不另设对照组(通常意义上的重复)。3条件对照：即给对象施以某种实验处理，但这种处理不是实验假设所给定的实验变量。例如我们通常在进行配方改进的时候,所改变的条件相对于原来的配方来说就属于条件按对照。空白(blank,BL)1. 空白实验(blak test)和空白样品：空白试验指对不含待测物质的样品用与实际样品同样的操作进行的试验。对应的样品称

10、为空白样品（简称：空白）。 2. 现场空白和实验室空白:现场空白指带到监测现场而模拟现场监测过程的空白样品。实验室空白指没有带到监测现场的空白样品。 3. 标准空白、试剂空白和全程空白：标准空白是指配标准溶液（标准系列溶液)时“零”浓度的空白，或不添加标准物质的空白。试剂空白是指随同试样分析步骤的空白样品。全程空白即全程试剂空白，是指经历试样分析全部步骤的空白样品。本底/非特异结合本底（ackn )：亦称背景，指某一测量方法中阴性样本的信号值或计数值。非特异结合(nonsef bn, S):由非待检物产生的有用检测信号。表现形式为高本底阴性或阳性。CO值CO值（Ct Off aue, C):界

11、值或阳性判定值，指某仪测量方法中用于区分阳性和阴性的数值。有两种判断方式：一种是大于CO值判为阳性，否则为阴性，常见于ELIA实验中除竞争抑制法以外的方法,判断方法较为直观;另一种是小于C值判为阳性,否则为阴性,常见于LIA实验中的竞争抑制法，判断方法不直观，要求测量方法稳定且重复性好。CO值的计算方式：往往以某一常数加上或乘以一个变量,变量的变动范围较小,常数反映本底信号，变量反映多次测量之间的差异。例如，我公司HIV试剂盒O值计算公式：CO=NC+.1（10）、锥形转动以及最末端的可变区,依托ab的恒定区作微小的“球穴”摆动（见）。 当其与被捕捉抗原分子之间,发生交差重叠结合之后,由于“立

12、体效应(steric effect)”,加之标记二抗的亲和力大于一抗等辅助因素,是可以迫使已被捕捉的抗原分子从一抗上解离洗涤出去的。很可能与下列因素有关：i. 包被-抗体亲和力低ii. 洗涤不合适iii. 酶标抗体不足iv. 过度孵育v. 其他非特异性反应窗口期窗口期(windw rid):病毒感染后病毒出现在血液中直到可以检出足够多的相应病毒标志物(抗原或抗体)前的时期。在这段时间内，血清中无法检测出相应的抗原抗体标志物。各种病毒的窗口期是不一样的，一般所称的窗口期指的是检测到病毒抗体的时间,但抗原以及核酸检测同样存在窗口期，但时间大大缩短。 B V、H C、HI V的窗口期的时间分别为56

13、、0和2天，4抗原的窗口期平均为15天，而应用核酸技术，可分别将H B V、H C V、H I V的窗口期缩短为41、12、11天。由于检测技术的局限，某种检测结果为阴性并不意味着就没有感染，因此定期复查是非常重要的。相信随着检测的病毒标志物的不同,检测技术的提高,可大大缩短窗口期时间。心理窗口期还有一个很重要的“心理窗口期”。由于医学上还没有绝对明确的窗口期，有个别朋友甚至2年以后还在检查，不知道他们还要在恐惧中多久才能找到回家的路!所以,每个人都应该在深思熟虑后为自己确定一个明确的心理窗口期,也就是说,过了这个期限还是阴性就可以彻底放心,之后的任务就是如何恢复到以前的生理和心理状态，回到自

14、己以前的生活中去。 潜伏期潜伏期（incbationperio)是指病原体侵入机体到最初出现症状和体征之间的这段时期。各种疾病的潜伏期长短不一,短者数小时，长者可达数月或数年。如禽类禽流感的潜伏期从几小时到数天，最长可达1天。人类患上禽流感后，潜伏期一般为7天以内。非典型性肺炎的潜伏期一般在10天，临床报告最短病例为1天，最长有0天,甚至有极个别病例达到2天。一般认为潜伏期长短与感染病毒的种类或者型别、病毒的致病性、病毒的数量、感染途径、被感染机体的免疫力以及其他非生理因素等有关。比如艾滋病病毒，经输血感染的剂量一般较大，所以潜伏期相对较短，而性接触感染艾滋病病毒的剂量较小，因此潜伏期相对较长

15、。HBV感染后的潜伏期一般为天至6个月，也有报道8天,平均7080天；HC感染后临床表现一般较轻,常为亚临床型,但输血后感染的潜伏期一般为天至6个月,也有资料报道22周,平均8周；H感染后1到个月内可能出现急性的症状和体征，随后进入较长的无症状期,持续1年,平均81年，大量输血的可缩短至15年。梅毒的潜伏期一般为24周灰区灰区：把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑,需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性,如仍落在灰区范围内则报告+(阳性)。 灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。 灰区的设置有二种： 1)C.O（1CV), V为该试剂的批内CV

16、(一般在15-0%间）; 2)C.O2s,为实验室做室内质控ROC（受试者工作特征曲线）的。酶免疫吸附实验（E)的性能指标(定性产品)灵敏度灵敏度（sensivity）：某一检测系统检出极低被检物质的能力。包括两层意思:检出被检物质最低量的能力；2.对大量样品中阳性检出的能力。检出被检物质最低量的能力：常用检出最低量被检物的含量(即分析灵敏度或最低检出限)来表示。比如01， 0.1u，01等，意思是在某一检测方法下,检测系统能将有用信号和背景信号区分开来时所对应的被检物的浓度。但这种区分在目前的条件下是否在临床上有确切的意义并不能全部的肯定。评价方式：用标准被检物持续稀释,直到能区分有用信号和

17、背景信号的最大稀释倍数。也叫滴度。在ELISA实验里，常用强阳性混合血清系列稀释,同时用市场反应较好的试剂盒同时进行标定,选择这些试剂盒都能检出的最大稀释倍数的血清作为灵敏度血清，通常会有成系列的几个血清。在标定系列灵敏度血清的时候要非常注意一个问题:要注意基质效应在不同系统（包括不同厂家的试剂盒、工艺、不同原材料)上对灵敏度血清测量值的影响，在改变系统时，必须重新标定灵敏度血清。2为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力（假阴性越少越好)，取决于包被物的全面性和亲和力。 选择原材料一定要选择亲和力高的原料。有些厂家为追求试剂对大多数阳性标本的灵敏度,只选择最强的一种或少数几种优势表位，而牺牲了在患者人群中较少出现的亚型或者原材料片段,这种做法是非常危险的，是对目标人群的不负责任。特异性特异性：指试剂正确检定不存在的被检物质的能力(无假阳性)，取决于包被抗原(体）及标记抗原（体)的纯度及特异性，生产工艺对试剂的特