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1、分子实验操作手册第二版精品课程分子克隆技术实验操作手册2005生命科学技术学院课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆和分子杂交两大部分：分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Sout

2、hern blotting，Northern blotting，Western blotting及Dot blotting等。Southern blotting是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经X-光片自显影显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分析。本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内

3、切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。为让学生初步了解有关RNA的操作过程注意事项，我们还列出Northern blotting的操作步骤以供选择。目 录系列一 分子克隆技术 4实验一 质粒的制备 4实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳 5实验三 外源DNA片段在质粒载体中的克隆 7实验四 感受态细胞的制备 9CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 9电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 10实验五 质粒的转化及转化子的鉴定 11热激法转化实验步骤： 11质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作

4、步骤 12实验六 PCR技术 12系列二 Southern杂交技术 14实验一 植物总DNA的快速少量抽提（CTAB法） 14实验二 总DNA质量检测及酶切 15实验三 电泳、转膜 16实验四 Southern Blotting 18系列三 Northern Blotting 24实验一 RNA Extraction (mini prep) 24实验二 RT-PCR (Reverse transcription PCR) 26实验三 RNA的电泳，转膜和杂交 28附录 试剂配方 29一 细菌培养试剂 30二 质粒抽提试剂 30三 DNA操作试剂 31四 RNA操作试剂 34Stock Solu

5、tion: 34Work Solution 35系列一 分子克隆技术实验一 质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。 实验原理：在pH 12.0 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒

6、DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。实验步骤：1. 取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37过夜培养；2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37摇床250 r/min过夜培养；3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量

7、将菌液倒干净；4. 加入300 l溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 5. 加入300 l溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；6. 加入300 l溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；7. 12000 g离心10分钟；8. 吸取800 l上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；9. 12000 g 常温离心15分钟；10. 倒尽上清，加75乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；11. 室温放置或超净台上风干DNA；12. 加40 l灭菌超纯水或

8、TE溶解；13. 质粒、BAC的质量检测，于-20保存。附注：质粒检测电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.71.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。实验目的：掌握琼脂糖凝

9、胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。实验原理：在pH值为8.08.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。实验步骤：1 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；2 调整好梳子的高度；3 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗

10、粒完全溶解，冷却至45-50C时倒入制胶板中；4 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；5 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；pUC18 5l + ddH2O 3l + 溴酚蓝2l 共10l于0.5ml tube中混合后点样；6 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；7 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 g/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色1015 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。附注：1影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：1) DNA分子大小 迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本

11、相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋线性DNA）2) 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.3) DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。4) 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正

12、比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm5) 碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 6) 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)7) 电泳缓冲液 （0.5TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1TAE，1TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0）。2溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。3电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携

13、带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。实验三 外源DNA片段在质粒载体中的克隆DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。实验目的：学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。实验材料：外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段；克隆载体为PUC18。实验原理：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pU

14、C18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。实验步骤：1 载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：（50 l反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）：DNA 30 lR.E 1 l10buffer 5 lddH2O 14 l37反应1hr，分别取8 l 外源片段酶切产物和5 l PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按25步纯化、回收DNA2 加入ddH2O 150 l （扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000g离心10 min；3 吸取上清，加1/10体

15、积3M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20放置15分钟以上；4 12000g 4冷冻离心15分钟；5 倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10 l ddH2O（0.5ml tube中），PUC18溶于20 l ddH2O（1.5ml tube中）；6 按以下反应去除载体PUC18的5磷酸基团，50反应30 min 以上DNA 20 lCIAP（TaKaRa） 0.5 l10 buffer 4.0 lddH2O 15.5 l7 70水浴10 min, 使CIAP失活；8 按25步纯化载体，溶于10 l ddH2O；9 连接反应（15 l体系）：DNA 10 lpUC18 2.5 l

16、5 buffer 1.5 lT4 ligase (3U/l) 1 l 16水浴过夜10 转化大肠杆菌感受态细胞11 转化子的鉴定附注：1. 根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载体，采用不同粘性末端的双酶切可实现外源片段的定向克隆。2. 克隆中用到的几种工具酶：（1）限制性内切酶限制性内切酶的一个活性单位（1U）：指在50 l反应体系中，37下，经过1小时的反应将1g DNA完全切割所需要的酶量。限制性内切酶的star活性：限制酶在某些条件下使用时对DNA切割的位点特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现与限制酶、底物DN

17、A以及反应条件有关。（2）碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）都能催化水解DNA、RNA、dNTP和NTP上的5磷酸残基。比较而言，CIAP更常用，因其可在70 10内加热灭活或通过苯酚抽提而变性失活，同时CIAP的活性比BAP的高1020倍。它主要用于：（1）克隆时去除载体的5-P，以防载体自连；（2）在用 Kinase进行5末端标记前，去除DNA的5-P。（3）连接酶体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶，但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是首选的酶，因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。3. 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜

18、及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。实验四 感受态细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。实验目的：学习感受态细胞的制备过程实验材料：大肠杆菌菌株DH5或DH10B实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细

19、胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为1091010 转化子/g DNA；对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 107转化子/g DNA。CaCl2感受态细胞的制备实验步骤1 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜（约16小时）；2 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下

20、步骤需在超净工作台和冰上操作4 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5 4下3000 g冷冻离心5分钟；6 弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7 4下3000 g冷冻离心5分钟；8 弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70）。电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1. 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中3

21、7摇床培养过夜；2. 取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养至OD6000.6（约2.5-3小时）；3. 将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4. 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5. 4下3000g冷冻离心5分钟；6. 弃去上清，加入1500l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7. 4下3000g冷冻离心5分钟8. 弃去上清，加入750l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9. 4下3000g冷冻离心5分钟10. 加入20l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻

22、上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11. 立即使用或迅速置于-70C超低温保存。附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：1) 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5107/ml）；2) 所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3) 经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4) 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或C

23、o2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5) 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6) 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7) 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；实验五 质粒的转化及转化子的鉴定质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆

24、菌感受态细胞。实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0 CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。热激法转化实验步骤：1 制备选择性培养基平板：在融化的250ml L

25、A培养基中250 l Amp（100mg/ml），250 l X-gal (20mg/ml)，25 l IPTG (200mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中；2 取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3 每100 l感受态细胞加入约20ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；4 热击：将离心管放置42水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；5 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置12分钟；6 复苏：每管加400 l SOC培养基，在37摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；7 布皿：取适当体

26、积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；8 培养：倒置培养皿，于37培养1216小时 即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤1 制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中250 l Amp（100mg/ml），250 l X-gal (20mg/ml)，25 l IPTG (200mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中；2 取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3 每管感受态细胞加入1l连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；4 电转化仪选择1800V作为输出电压；5

27、 将要转化的混合物加入预冷的1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电击；6 立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞；7 将细胞转入合适的培养管中37C培养1小时；8 吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板；9 37C培养过夜，观察结果。附注：1 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不得超过105个菌落），同时37培养不应超过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。2 鉴定转化子中是否含有外源DNA片段常用的方法有：1) 互补；2) 杂交筛选；3) 插入失活（一

28、些老质粒如pBR322等）;4) 小量提取质粒酶切检测、PCR检测实验六 PCR技术聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中的常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。实验目的：掌握PCR原理，学习PCR操作过程实验材料：转基因水稻叶片总DNA，外源基因的特异引物实验原理：PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片

29、段得到大量扩增。实验步骤：1. 调整模板浓度至10 ng/l；2. 按下列体系配制反应混合液，混匀，加一滴矿物油，离心5秒Template DNA 2 l （20 ng）10 buffer 2.0 lMgCl2（25mM） 1.5 lPrimer F (10M) 0.2 lPrimer R (10M) 0.2 ldNTPs（2mM） 2.0 lTaq（5U/l） 0.2 lAdd ddH2O to 20 l3PCR反应循环条件设置：95 3 1 cycle94 1 55 1 72 130 35 cycles72 8 1 cycle4 forever4检测：加2 l溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15

30、 l反应产物点样电泳；5在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。附注：1 引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次；2 PCR反应的各种成份不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作；3 根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件；4 注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。系列二 Southern杂交技术Southern杂交，通过用限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（一般是硝酸纤维素膜或尼龙膜）。DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法（如放射性同位素）标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经X-光片自显影显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置。实验一 植物总DNA的快速少量抽提（CTAB法）DNA分子是分子生物学研究的基本材料，依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的DNA。实验目的： 了解植物DNA抽提的主要方法，掌握CTAB法快速抽提水稻DNA。实验材料及试剂：水稻叶片，1.5CTAB，氯仿/异戊醇(24:1)，95%乙醇或无水乙醇等实验原理：植物DNA的抽提常采