吸光光度法.docx

1、吸光光度法第六章 吸光光度法实训一 分光光度计的使用一、 目的要求1.了解朗伯-比耳定律的物理意义及应用范围。2.明确分光光度计的构造及操作方法。二、实训原理在日常生活中我们看到各种溶液呈现不同的颜色，这是与它们对可见光的选择吸收有关。利用有色溶液颜色的深浅与溶液浓度有关的性质，进行定量测定的分析方法称为比色法。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度和液层厚度有一定的比例关系，也符合于朗伯-比耳定律。T=I/I0 (12-1) A= -lgT = lg(I0/I) = kcb (12-2)式中: T透射比； I0 入

2、射光强度；I 透射光强度；A 吸光度；k吸收系数；b溶液厚度；c溶液浓度。 图6-1 溶液对光的吸收从以上公式可以看出，当入射光、吸收系数和溶液的光径长度不变时，透过光是根据溶液的浓度而变化的，分光光度计的基本原理是根据上述物理光学现象而设计的。 分光光度计的工作原理是用分光能力较强的棱镜或光栅来分光，棱镜或光栅将入射光色散成谱带，从而获得纯度较高，波长范围较窄的各波段的单色光。这种单色光的波长范围一般约在5nm左右。因而测定的灵敏度高选择性较好，因此若选择最合适的波长进行测定，可以校正偏离朗伯-比耳定律的情况。吸光光度法的最大优点是可以在一个试样中同时测定两种以上的组分，不必事先进行分离。因

3、为吸光光度法可以任意选择某种波长的单色光，根据不同物质对于不同波长光的吸收不同，可以利用各种组分吸光度的加和性，在指定条件下进行混合物中各组分含量的测定。三、紫外可见分光光度计的构造 分光光度计按波长范围分类，波长在420700nm范围的称可见分光光度计。波长在2001000nm范围的称紫外可见分光光度计。紫外可见分光光度计是目前厂矿及学校应用比较广泛的分光光度计。分光光度计基本构造相似，是由图6-2所示的几个主要部件构成。 光源 单色器 吸收池 检测器 测量系统图6-2 721型分光光度计主要部件示意图1.光源:在可见光区，常用钨丝灯为光源，波长范围约为3202500nm；在紫外光区，常用氢

4、灯、氘灯为光源，波长范围约为200375nm。氘灯的辐射强度比氢灯高23倍，寿命亦较长。氙灯的强度一般高于氢灯，但欠稳定，适用的波长范围为1801000nm，常用作荧光分光光度计的激发光源。2.单色器:单色器是将光源发射的复合光分解为单色光的光学装置。白光通过棱镜或光栅将波长按长短顺序分散成单色光。单色器一般由五部分组成：入光狭缝；准光器（一般由透镜或凹面反光镜使入射光成为平行光束）；色散器；投影器（一般是一个透镜或凹面反射镜将分光后的单色光投影至出光狭缝）；出光狭缝。 色散器是单色器的核心部分，常用的色散元件是棱镜或光栅。 棱镜由玻璃或石英制成，玻璃棱镜色散能力大，但吸收紫外光，只能用于35

5、0820nm的分析测定，在紫外区必须用石英棱镜。 光栅是在玻璃表面上每毫米内刻有一定数量等宽等间距的平行条痕的一种色散元件。高质量的分光光度计采用全息光栅代替机械刻制和复制光栅。光栅的主要特点是色散均匀，呈线性，光度测量便于自动化，工作波段广。 光栅分光光度计的单色器光学系统原理见图6-3。 图6-3 单色器光学系统原理图1一样品池；2一聚光镜；3一平面反射镜；4一入光狭缝；5一出光狭缝；6一球面反射镜；7一平面光栅图6-3中，入光狭缝和出光狭缝均位于球面反射镜的焦面位置，通过入光狭缝的光束经平面反射镜反射后射向球面反射镜，球面镜将平行光束反射至平面光栅，经光栅色散后的平行光束又经球面镜反射聚

6、焦在出光狭缝处。 单色器的狭缝设计一定的宽度，经过狭缝的单色光是一个具有一定光谱宽度的谱带，称为光谱带宽。从理论上讲，狭缝的宽度愈小，波长愈接近单色光，但带宽太小，将使单色光的强度减小，使光电流信号减弱，降低信噪比。 由于分子吸收光谱的吸收峰比较宽和平滑，一般情况下光谱带宽26nm对分析结果影响不大。3.吸收池： 吸收池是盛放样品溶液的容器，它具有两个相互平行、透光且具有精确厚度的平面。玻璃吸收池用于可见光区，石英吸收池用于紫外光区。吸收池的光程长度一般为1cm，也有0.110cm的。由于吸收池厚度存在一定误差，其材质对光不是完全透明的，在作定量分析时，对吸收池应做配套性试验，试验后标记出放置

7、。4.检测器： 检测器是一种光电转换设备。它将光强度转变为电信号显示出来。常用的有光电池、光电管或光电倍增管等。光电池由于其光电流较大，不用放大，用于初级的分光光度计上。缺点是疲劳效应较严重。 光电管是常用的光电检测器，锑-铯阴极的紫敏光电管适用波长为200625nm，银-氧化铯-铯阴极的红敏光电管适用波长为6251000nm。 光电倍增管是目前应用最为广泛的检测器，它利用二次电子发射来放大光电流，放大倍数可高达108倍，性能好，唯独价格较高。5.测量系统：测量系统包括放大器和结果显示装置。早期的分光光度计用表头读数，70年代以来，采用数字读出装置。现代的分光光度计在主机中装备有微处理机或外接

8、微型计算机，控制仪器操作和处理测量数据；装有屏幕显示、打印机和绘图仪等，使测量精密度、自动化程度提高，应用功能增加。四、实训器材1.高锰酸钾。2.苯甲酸钠。3. HCl（1+1）。4.石油醚。5.721可见分光光度计。6.755紫外可见分光光度计。7.分析天平五、紫外可见分光光度计的使用方法（一）721型分光光度计使用方法图6-4 721型分光光度计l一波长读数盘；2一微安表；3一比色皿暗盒盖；4一波长调节器；5一“0”透射比调节器；6一“100”透射比调节器；7一比色皿架拉杆；8一灵敏度选择；9一电源开关 1.检查仪器（图6-4）各调节钮的起始位置是否正确，接通电源开关，打开样品室暗箱盖，使

9、电表指针处于“0”位，预热20min后，再选择须用的单色光波长和相应的放大灵敏度档，用调“0”电位器调整电表为T=0。 2.盖上样品室盖使光电管受光，推动试样架拉手，使参比溶液池（溶液装入45高度，置第一格）置于光路上，调节100透射比调节器，使电表指针指T100。 3.重复进行打开样品室盖，调0，盖上样品室盖，调透射比为100的操作至仪器稳定。4.盖上样品室盖，推动试样架拉手，使样品溶液池置于光路上，读出吸光度值。读数后应立即打开样品室盖。5.测量完毕，取出吸收池，洗净后倒置于滤纸上晾干。各旋钮置于原来位置，电源开关置于“关”，拔下电源插头。6.放大器各档的灵敏度为：“l” 1倍；“2”10

10、倍；“3”20倍，灵敏度依次增大。由于单色光波长不同时，光能量不同，需选不同的灵敏度档。选择原则是在能使参比溶液调到T 100处时，尽量使用灵敏度较低的档，以提高仪器的稳定性。改变灵敏度档后，应重新调“0”和“100”。（二）755B型分光光度计使用方法 仪器共有 23个键，其中数字键 12个，功能键 11个。数字键“09”，负号“”，小数点“”，此12个键用于仪器在测量过程中信息的输入或参数的设定。图6-5 755B型分光光度计的操作键盘11个功能键的功能如表12-1。表6-1 755B型分光光度计各功能键的功能功能键功能I / O暂空MEM方程存储键，直接按此键，当前内存中的方程被存储，并

11、返回-记录号， 以备今后调用；若按过数字键后再按此键，则将内存中相对应的方程调入，按“0”“MEM”，则将内存中所有方程清零。注：仪器第一次使用时，请将内存清零。MODEa 初始响应，开机后必须按此键才能进入工作状态。b模式转换，连续按“MODE”键，仪器显示状态按T（透射比）A（吸光度）C（浓度）顺序轮回。100置满度，仪器在规定波长范围内的任意波长处，当参比试样置于光路时，按此键可在不同的显示模式状态下自动调整，在“T”状态显示“T100.0”，“A”状态显示“A0.000”，“C”状态（浓度）显示“C0.000”，另外当仪器显示“TE2”时，按此键仪器可自动调整至“T100.0”。0暗电

12、流置零，打开样品池盖，若仪器显示值（暗电流）不为零，按此键即可调零。C标准样品浓度值输入，仪器工作在C方式时，为建立浓度曲线而输入17点标准样品时用，操作方法详见本项目五.10.（2）建立AC浓度曲线一节。M/Na方程系数M、N轮回显示键，没有方程则显示“NO”。b浓度曲线系数输入键，使用方法详见本项目五.10.（1）建立浓度曲线一节。CLEAR浓度曲线系数输入健，按此键则清除机内原有的曲线方程，在C模式下显示“CEO”。注：在每次建立浓度方程前必须先按此键清除原有的浓度方程。CE清除键，如数字输入过程中发生错误，按此键可清除。TABLE打印当前浓度方程及内存中的所有浓度方程系数和记录号。PR

13、INT打印键，用法详见本项目五.11打印方式一节。755B型分光光度计使用方法：1.插上电源线，打开电源开关，仪器显示“F755B”，按“MODE”键，仪器显示T“.”。检查仪器后面反射镜位置是否是你需要的灯源位置，200330nm范围内用氘灯，3301000nm范围内用钨灯。仪器初始化结束，预热30分钟后，仪器即可使用。 2.调节波长旋钮使波长移到所需之处。3.四只比色皿，其中一个放入参比试样，其余三个放入待测试样，将比色皿放入样品池内的比色皿架中，夹子夹紧，盖上样品池盖。 4.将参比试样推入光路，按“MODE”键，便显示（T）状态或A状态。 5.按“100”键，显示“T100.0”或“A0

14、.000”。 6.打开样品池盖，按“0”键，显示“T0.0”或“AE1”。 7.盖上样品池盖，按“100”键，显示“T100.0”。 8.然后将待测试样推入光路，显示试样的（T）值或A值。 9.如果要将待测试样的数据记录下来，只要按“ PRINT”键即可。 10.建立标准样品浓度曲线： 仪器可以按照二种方法建立浓度曲线方程AMCN，这是一个线性回归方程，一旦仪器内建立了这个方程，操作者就可以直接测得待测试样的浓度值。 （l）M、N系数直接输入： 浓度曲线方程AMCN，其中A为吸光度，C为浓度，M为斜率，N为截距，若知系数M、N，则可直接将M、N输入仪器建立曲线方程，如已知 M2.12310-3

15、，N1.02510-3，则只要将M2.123、 N1.025输入即可，即按2.123，再按“MN”输入M，按1.025，再按“MN”输入N，在C模式下显示实际数字，则说明方程已建立，若需打印出方程，则按“TABLE”键。 以下有几点说明： 必须先输入M，再输入N。 系数M范围 0.00110-3999910-3 系数N范围 999910-3999910-3 输入时，若输入0.001在仪器内转换成0.00110-3同理；其他任何数值的输入在仪器内均乘以10-3。 相关系数R反映浓度C和吸光度A之间的线性关系，R越接近于1，浓度C和吸光度A之间的线性关系越好，反之越差。 （2）建立试样的标准曲线(

16、A一C曲线） 将浓度分别为100、300、500（单位）的某标准样品输入仪器建立标准曲线，步骤如下： 将参比试样和100、300、500（单位）三个标准试样放入样品池中 调整波长至所需之处 按“CLEAR”键清除原有方程，在 C模式下显示“ CEO” 将参比试样推入光路，按“100”键，置满度，打开样品池盖，按“0”键 将100（单位）标准试样推入光路，按“100C”键，显示“ CO1”，则一点已输入 将300（单位）标准试样推入光路，按“300C”键，显示“ C02”，则二点已输入 将500（单位）标准试样推入光路，按“500C”键，显示“CO3”，则三点已输入 以上三点标样已输入微机，并建

17、立了标准曲线，将未知试样推入光路，在C模式下显示的值即为被测试样的浓度值，若需打印，按“PRINT”键，便可打印出该未知试样的T、A、C相应数值。11.数据打印方式：(1)实时打印： 仪器无论在T、A、C任何一种模式下按“PRINT”键便可打印出现状态T、A、C相应数值，若标准曲线方程没有建立，则C（浓度）一栏打印“NO”。(2)定时打印：本仪器提供了定时打印功能，能够提供定时测量打印，以秒为T单位，操作方式如下：如需对数据进行定时采样，采样次数为20次，间隔为5秒，则按键“5”，“PRINT”，再按键“20”，“PRINT”，仪器便进入定时打印状态，若想终止定时打印状态，按键“CE”可退出。

18、注意：本仪器的基本使用方法适用于不需要得到浓度值而仅仅需得到了（T）或A值的使用者，对于初次接触分光光度计的使用者来说，使用这个方法只要熟悉四只键，即“MODE”、“PRINT”、“ 100”和“0”即可。六、实训步骤1.721型分光光度计测定高锰酸钾溶液的吸光度：(1)称取1.6g高锰酸钾固体，置于烧杯中溶解，定容至1000mL，混匀，该溶液浓度约为0.01mol/L。分别取0.01 mol/L高锰酸钾溶液，1.00mL、2.00mL 、3.00mL置于100mL容量瓶中，定容后分别配制成 0.0001mol/L、0.0002mol/L、0.0003mol/L的高锰酸钾溶液，备用。(2)将配

19、置好的各种浓度的高锰酸钾标准溶液分别在500nm、525nm、550nm和575nm波长条件下，测定吸光度，记录数据。2.755B型分光光度计测定苯甲酸钠溶液的吸光度：(1)配置2.00mg/mL苯甲酸钠标准溶液。分别吸取1.00mL、3.00mL、5.00mL苯甲酸钠标准溶液于100mL容量瓶中,分别用蒸馏水定容至刻度线，摇匀备用。(2)分别吸取稀苯甲酸钠标准溶液5mL，另吸取5mL蒸馏水作空白溶液，加0.4mL HCl(1+1)，用石油醚稀释至50mL。振动1min。以空白溶液为参比，分别在234nm、254nm、280nm波长条件下，测定石油醚层的吸光度，记录数据。七、注意事项1.发现仪

20、器有故障时，应先仔细分析，确定故障的关键，然后着手解决，切忌盲目行事。2.避免有硫化氢、二氧化氢、氟气等有腐蚀气体的场所，避免灰尘过多的地方3.环境温度在1535，环境相对湿度在4585%范围内 4.避免经常有强烈震动的地方,避免阳光直射的地方 5.仪器应尽量远离发强烈电场、磁场或高频的电气设备6.放置本仪器的工作台，必须有足够强度能承受30kg的重量，仪器后测应距离墙壁至少 10cm以上，以保证及时散热。7.755B型分光光度计打印的几点说明： （l）定时打印T范围599（秒）（2）定时打印次数1255（次）思考题1.比较在同一波长下不同浓度的样品溶液吸光值的变化有什么规律？为什么？2.比较

21、在不同波长下同一浓度的样品溶液吸光值的变化有什么规律？为什么？实训二 高锰酸钾溶液吸收曲线的制作一、目的要求1.了解分光光度计的结构和正确的使用方法。2.学会绘制吸收曲线的方法，正确选择测定波长。3.学习如何选择分光光度分析的实验条件。二、原理物质呈现的颜色与光有着密切关系，在日常生活中溶液所以呈现不同的颜色，是由于该溶液对光具有选择性吸收的缘故。当一束白光（混合光）通过某溶液时，如果该溶液对可见光区各种波长的光都没有吸收，即入射光全部通过溶液，则该溶液呈无色透明状；当溶液对可见光区各种波长的光全部吸收时，则该溶液呈黑色；如某溶液对可见光区某种波长的光选择性地吸收，则该溶液呈现被吸收光的互补色

22、光的颜色。通常用光吸收曲线来描述物质对不同波长范围光的选择性吸收。其方法是将不同波长的光依次通过某一定浓度和厚度的有色溶液，分别测出它们对各种波长光的吸收程度（用吸光度A表示），以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标，画出的曲线即为光的吸收曲线（吸收光谱）。光吸收程度最大处的波长，称为最大吸收波长，用max表示。同一物质的不同浓度溶液，其最大吸收波长相同，但浓度越大，光的吸收程度越大，吸收峰就越高。溶液对光的吸收规律-光的吸收定律（朗伯-比耳定律），为吸光光度法提供了理论依据。三、试剂1 高锰酸钾固体四、步骤1 KMnO4溶液的配制称取1.6g高锰酸钾固体，置于烧杯中溶解，定容至1000mL，混匀，

23、该溶液浓度约为0.01molL-1。2 KMnO4溶液吸收曲线的制作 用吸量管移取上述高锰酸钾溶液1.0、2.0、3.0mL，分别放入三个100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，充分摇匀，各溶液KMnO4浓度分别为0.0001 molL-1、0.0002 molL-1、0.0003 molL-1。将配制好的各浓度的KMnO4溶液，用1cm比色皿，以蒸馏水为参比溶液，在440580nm波长范围内，每隔10nm测一次吸光度，在最大吸收波长附近，每隔5nm测一次吸光度。在坐标纸上，以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制A和关系的吸收曲线。从吸收曲线上选择最大吸收波长max，并观察不同浓度KMnO4溶液的

24、max和吸收曲线的变化规律。思 考 题1.同一波长下不同浓度的KMnO4溶液吸光值A的变化有什么规律？为什么？2.不同波长下同一浓度的KMnO4溶液吸光值A的变化有什么规律？为什么？3.收曲线在实际应用中有何意义？附：721型分光光度计一、仪器结构分光光度计按波长范围分类，波长在420700nm范围的称可见分光光度计；波长在2001000nm范围的称紫外可见分光光度计。721型分光光度计是一种可见分光光度计，主要用于波长范围在360800nm的光吸收测量，且适用于高吸光度的示差分析。分光光度计的主要部件包括光源、单色器、吸收池、检测器和测量系统。721型分光光度计采用12伏25瓦的钨丝灯作为光

25、源，单色器由狭缝、棱镜、准直镜、凸轮及波长刻度盘组成，并密封于暗盒内，用硅胶干燥；检测系统使用GD-7型光电管，并与微电流放大器电路板一起安装在液槽架后的暗盒内。二、仪器的使用方法1. 检查仪器（图1）各调节钮的起始位置是否正确，接通电源开关，打开比色皿暗盒盖，使电表指针处于透过率“0”位。预热20min后，再选择须用的单色光波长和相应的放大灵敏度档，再用调“0”调节器复校电表透过率T=0%。2. 盖上比色皿暗盒盖使光电管受光，将参比溶液池（溶液装入4/5高度，置第一格）推入光路上，调节“100%”透过率调节器，使电表指针处于透过率T100%。3. 按上述方法连续几次调整透过率“0”及“100

26、%”，直至不变，即可进行测量工作。4. 将待测溶液推入光路，读出吸光度值A。读数后应立即打开比色皿暗盒盖。5. 测量完毕，取出吸收池，洗净后倒置于滤纸上晾干。各旋钮置于原来位置，电源开关置于“关”，拔下电源插头。6. 放大器各档的灵敏度为：“l” 1倍；“2”10倍；“3”20倍，灵敏度依次增大。由于单色光波长不同时，光能量不同，需选不同的灵敏度档。选择原则是在能使参比溶液调到T100%处时，尽量使用灵敏度较低的档，以提高仪器的稳定性。改变灵敏度档后，应重新调“0”和“100”。三、仪器使用注意事项1. 发现仪器有故障时，应先仔细分析，确定故障的关键，然后着手解决，切忌盲目行事。2. 避免SO

27、2、NO2及酸雾等有腐蚀的气体侵蚀仪器部件，应与化学操作室隔开。3. 环境温度宜保持在1528，环境相对湿度在4565%范围内。4. 防尘、防震和防电磁干扰。仪器周围不应有强磁场。5. 当测量优挥发性和腐蚀性样品溶液时，吸收池应加盖。6. 经常更单色器盒的干燥剂，防止色散元件受潮生霉。实训三 邻二氮杂菲分光光度法测定铁一、目的要求1.了解分光光度计的结构和正确的使用方法。2.掌握邻二氮杂菲分光光度法测定铁的原理及方法。3.学会制作标准曲线的方法。二、原理邻二氮杂菲是测定微量铁较好的试剂。在pH为29的溶液中，邻二氮杂菲与Fe2+生成稳定的橙红色配合物，显色反应如下：Fe2+ 其lgK稳21.3

28、，摩尔吸光系数5101.1104。橙红色配合物的最大吸收峰在510nm波长处。Fe3+与邻二氮杂菲作用形成蓝色配合物，稳定性较差，因此在实际应用中常加入还原剂使Fe3+还原为Fe2+，再与邻二氮杂菲作用。常用盐酸羟胺NH2OHHCl（或对苯二酚）作还原剂。4Fe3+ 2NH2OH 4Fe2+ 4H+ N2O H2O测定时酸度高，反应进行较慢；酸度太低，则离子易水解。本实验采用HAc-NaAc缓冲溶液控制溶液pH5.0，使显色反应进行完全。本方法的选择性很高，相当于含铁量40倍的Sn2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、SiO32-；20倍的Cr3+、Mn2+、VO3-、PO43-；5倍

29、的Co2+、Ni2+、Cu2+-等离子不干扰测定。但Bi3+、Cd2+、Hg2+、Zn2+、Ag+等离子与邻二氮杂菲作用生成沉淀干扰测定。三、试剂1.铁标准溶液（100gmL-1）：准确称取0.8634g铁盐NH4Fe(SO4)212H2O(A.R)，置于烧杯中，加入20mL 6molL-1HCl溶液和少量水，溶解后，定量转移至1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，充分摇匀。或准确称取铁粉0.1g左右，加入10mL 10%硫酸，待完全溶解后，冷却，用水稀释至100mL。2.铁标准溶液（10gmL-1）：用移液管吸取上述铁标准溶液10.00mL，置于100mL容量瓶中，加入2.0mL 6molL

30、-1HCl溶液，用水稀释至刻度，充分摇匀。3.盐酸羟胺溶液（10%）：新鲜配制。4.邻二氮杂菲溶液（0.1%）：新鲜配制。5.HAc-NaAc缓冲溶液（pH5.0）：称取136g醋酸钠，加水使之溶解，在其中加入120mL冰醋酸，加水稀释至500mL。6.HCl溶液（1+1）。四、步骤1.邻二氮杂菲-Fe2+吸收曲线的绘制用吸量管吸取铁标准溶液（10gmL-1）0.0、2.0、4.0mL，分别放入三个50mL容量瓶中，加入1mL 10%盐酸羟胺溶液，2mL 0.1%邻二氮杂菲溶液和5mL HAc-NaAc缓冲溶液，加水稀释至刻度，充分摇匀。放置10min，用3cm比色皿，以试剂空白（即在0.0m

31、L铁标准溶液中加入相同试剂）为参比溶液，在440560nm波长范围内，每隔2040nm测一次吸光度，在最大吸收波长附近，每隔510nm测一次吸光度。在坐标纸上，以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制A和关系的吸收曲线。从吸收曲线上选择测定Fe的适宜波长，一般选用最大吸收波长max。2.标准曲线的制作用吸量管分别移取铁标准溶液（10gmL-1）0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别放入7个50mL容量瓶中，分别依次加入1mL 10%盐酸羟胺溶液，稍摇动；加入2.0mL 0.1%邻二氮杂菲溶液及5mL HAc-NaAc缓冲溶液，加水稀释至刻度，充分摇匀。放置10min，用3cm比色皿，以试剂空白（即在0.0mL铁标准溶液中加入相同试剂）为参比溶液，选