微生物脂肪酶的应用及其研究进展.docx

1、微生物脂肪酶的应用及其研究进展江苏农林职业技术学院 毕 业 设 计（论 文）SNL/ 微生物脂肪酶的应用及其研究进展专 业 生物技术及应用 学生姓名 彭 林 班 级 09生物技术及应用 学 号 02 指导教师 张 小 华 完成日期 2012年月 微生物脂肪酶的应用及其研究进展摘要: 随着工业催化技术的发展，脂肪酶作为一种重要的生物催化剂现已成为世界研究的热点。文中对微生物脂肪酶的结构、性质以及其在粮油食品加工、生物柴油、有机合成、手性化合物合成及三甘酯结构测定等方面的应用进行了综述和展望。关键词：微生物脂肪酶；结构；催化特性；应用；油脂加工Research progress and appli

2、cation of microbes lipasePeng XiaDepartment of Bioengineering, Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry, Jurong, Jiangsu, 212400Abstract：With the development of technology of industrial catalytic. As an important biocatalyst, lipase has become the research hotspot all around the world

3、.The paper summarized and prospected the structure and the property of the microbial lipase and the application in the fields of grain,oil and food processing,biodiesel,organic synthesis,chiral synthesis and the triglyceride structure determination. Key words：microbial lipase；structure；catalytic pro

4、perties；application；oil processing目 录前言 11 脂肪酶的结构特点11.1脂肪酶的多样性与保守性11.2 “盖子”结构22 脂肪酶的催化特性23 脂肪酶的应用33.1 在粮油食品加工中的应用.33.2 在油脂工业工业中的应用.43.3 在生物柴油中的应用.43.4 在有机合成中的应用53.5 在手性化合物合成方面的应用53.6 在三甘油脂结构测定中的应用53.7在医药工业中的应用.63.8 在纺织工业中的应63.9 在化学品合成工业中的应用63.10在其他工业方面的应用. 74 展望 9参考文献10前言脂肪酶又称三酰基甘油水解酶，是一类主要水解由甘油和水不溶

5、性长链脂肪酸形成的甘油三酯的酯键水解酶，广泛存在于动物组织、植物种子和微生物中，主要制备方法有提取法、化学合成法和微生物发酵法。催化甘油三酯分解成甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸，是一类特殊的酯键水解酶。脂肪酶的来源很多，其中微生物来源的脂肪酶可以催化酯类化合物的水解、醇解、酯化、酯交换及合成等，反应不需要辅酶、条件温和、能耗低、底物原料品质要求低、副产物少，主要用于食品加工、生物柴油制备、生物传感器（酶传感器）、手性药物拆分等领域。由于微生物生长繁殖快，所产脂肪酶种类多，具有比动植物源脂肪酶更广泛的作用pH值和温度范围，且微生物脂肪酶一般都是胞外酶，更适合于工业规模生产和获得高纯度制品，因此

6、微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，且在理论研究方面也具有重要意义。随着生物技术的快速发展以及固定化酶技术、界面酶学和非水相酶学研究的突破性进展和一些脂肪酶基因的克隆及在异源系统中的高效表达，已有不少脂肪酶实现了工业化生产，在日常生活和工业生产的各领域将得到越来越广泛的应用。人们对微生物脂肪酶产生了浓厚的兴趣。以下是我对微生物脂肪酶特性及其应用进行了综述，并对其研究前景进行了展望。1脂肪酶的结构特点1.1脂肪酶的多样性与保守性到目前为止，大约2 000种脂肪酶及相关酶的非冗余序列被提交到蛋白质数据库，所有已知的脂肪酶没有特征性的相似序列，相反，它们呈现出惊人的多样性。在微生物酯酶及脂肪酶数据

7、库中，脂肪酶被分为16个超家族，39个同源家族1。它们的唯一共性是都有一个Gly-Z-Ser-W-Gly（在少数情况下，甘氨酸被其他小的残基取代）的五肽序列；尽管脂肪酶的一级序列不同，但是所有脂肪酶表现为相同的结构框架，即所谓的/水解酶折叠，并且它们有相同的催化机制.这种结构的保守性是一种非常有用的工具，可以帮助对新酶进行分类鉴定，即使这些酶没有明显的序列相似性2。典型的/水解酶折叠的基础是一个位于核心的，几乎是8个平行的-折叠束构成，其中只有一束2是反平行的，38是通过-螺旋（A-F）在折叠的两端连接。此特殊结构为酶的活性位点提供了一个稳定支架催化三联体。这个三联体包括亲核试剂、酸性残基和组

8、氨酸3。多数微生物脂肪酶活性中心为丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸构成的三联体，而白地霉（Geotrichum Candium）和假丝酵母（Candida Cylindracea）等少数脂肪酶活性中心由丝氨酸、谷氨酸和组氨酸构成。具有亲核基团的Ser残基，通常情况下位于5链之后，酸性氨基酸（如Glu或Asp）残基位于7后面，而His残基位于8后面4（如图1）。图1 典型的/水解酶折叠不同来源的脂肪酶空间结构主要差别在于-折叠束和-螺旋的数量以及-折叠角度和-螺旋的空间排列5。1.2“盖子”结构脂肪酶通过与水/底物界面的相互作用来获得不同的构象状态。在关闭构象状态时，“盖子”覆盖在酶的活性位点上，酶难以

9、靠近底物分子，而转变到开放构象状态时，催化通道入口打开.近年来，发现“盖子”的作用不仅仅是调节底物靠近活性位点的大门。“盖子”是两性分子结构，在关闭状态，酶的结构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部，当酶转变到开放状态时，疏水端会暴露出来，隐藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域，引起脂肪酶的构象改变，增加了酶与脂类底物的亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活6-7。2脂肪酶的催化特性脂肪酶的催化特性主要包括最适温度与最适pH值、热稳定性、区域选择性等几个方面。微生物脂肪酶一般易溶于水，不溶于乙醇，通常在

10、pH值4.011.0之间水解能力较强，部分脂肪酶在pH值3.0时仍有稳定的活性，最适作用温度在3060之间。脂肪酶的区域选择性被成功应用的一个领域是修饰三酰甘油，这些三酰甘油具有3个相关的特性：区域选择性，脂肪酸在甘油骨架上的位置；脂肪酸特异性，如特定链长或不饱和脂肪酸；甘油酯的类型，如单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油。大部分已知的脂肪酶都是1,3位甘油酯键专一性的，并在伯醇位置具有活性，例如：青霉（Penicillium sp）和米黑毛霉（Mucor miehei）脂肪酶为1位和3位甘油酯键专一水解酶，但也有少量在2位具有活性，可以完全水解为脂肪酸。由于脂肪酸的选择性，脂肪酶可以将中链的酯转化为

11、长链（如将C4变为C8，但很少达到C22），只是转化率不同。在这个性质方面，甚至相同酶的不同亚型也不同。如玫瑰假丝酵母脂肪酶的亚型1主要作用于中链（C8C10）的底物，亚型3作用于可溶性的短链底物，而亚型2和4则作用于长链分子（C16C18），另外，脂肪酶应用越来越多的领域是多官能团的选择性酰化，例如，糖类、氨基酸和多肽，尤其在保护和去保护过程中，对新药研发中构建糖类骨架化合物库是必需的。精细化工、制药、农用化学品是脂肪酶其他性质最重要的应用领域，这归功于它对大量底物的立体选择性，它可以使前手性底物和拆分外消旋反应更加容易7-8。脂肪酶催化特性还表现为，在油/水界面上其催化活力最大。“盖子”中

12、-螺旋双亲性会影响脂肪酶与底物在油/水界面结合能力，其双亲性减弱将导致脂肪酶活力降低。由于脂肪酶与油/水界面缔合作用，导致“盖子”张开，活性部位暴露，使底物与脂肪酶结合能力增强，底物较容易进入疏水性通道而与活性部位结合生成酶-底物复合物。界面活化现象可提高催化部位附近疏水性，导致-螺旋再定向，从而暴露出催化部位.界面存在，还可使酶形成不完全水化层，这有利于疏水性底物脂肪族侧链折叠到酶分子表面，使酶催化易于进行9。3脂肪酶的应用3.1在粮油食品加工中的应用脂肪酶已成为粮油食品加工中不可或缺的成分，已经广泛应用于焙烤食品、油脂加工、乳制品以及食品添加剂工业中。在面包生面团中加入脂肪酶可使甘油三酯水

13、解成甘油二酯、甘油单酯和脂肪酸，它能改善面团的流变学特性，增强面团对过度发酵的耐受性，提高入炉急胀能力，增大面包体积，改善面包芯的组织结构和柔软性，且对面包芯有二次增白作用；若与其他酶制剂如葡萄糖氧化酶复配后能够取代化学增筋剂溴酸钾，用于提高面制品的烘焙品质、改善面包质地、延长制品的货架期；对于馒头生产，脂肪酶同样能起到良好的面团调理作用。在油脂加工中，脂肪酶可以催化酯交换、酯化、水解等反应。利用1,3-定向脂肪酶催化油脂进行定向酯交换，将廉价的油脂经过改性而转变成高利用价值的油脂，目前在油脂工业上研究最多也最有研究价值的是类可可脂的生产10。此外，脂肪酶还广泛应用于乳制品工业中，主要包括奶粉

14、和奶酪风味的加强、缩短奶酪成熟期、以及奶酪产品的生产、乳脂和奶油的脂解改性等，其中脂肪酶作用于乳脂产生游离脂肪酸，进而形成有挥发性的异戊醛、二乙酰、3-羟基丁酮等呈味物质，改善了奶酪风味，并产生特殊香味11。除奶制品外，脂肪酶在瘦肉加工过程中用于去除多余的脂肪及在发酵肉制品中用于改善产品的风味等12。目前国内外都有用微生物酶法合成芳香化合物等用作食品添加剂的。L抗坏血酸棕榈酸酯被广泛用作酯溶性抗氧化剂及营养强化剂。蔗糖月桂酸酯用作食品添加剂具有乳化、抗菌等功能。在茶叶生产中应用米赫根毛霉产生的脂肪酶可减少茶叶中的脂质成分，提升多不饱和脂肪酸的浓度，从而改善茶叶风味。酒精饮料发酵过程中加入一定量

15、脂肪酶可赋予产品类似奶酪的香味。生产无脂肉时脂肪的去除是用脂肪酶来完成的。陈正中等10人发现添加微生物脂肪酶可改善发酵香肠品质。另外，利用微生物脂肪酶可选择性地水解鱼油，使鱼油中的n3系高不饱和脂肪酸（n3 PUFA）含量提高，而n3 PUFA具有预防循环系统疾病和提高记忆力的生理功能。3.2在油脂工业中的应用脂肪酶在油脂工业中的应用非常广泛。在油脂精炼工艺中，由于毛油中含有较高的游离脂肪酸，而酸值是衡量油脂品质的重要指标，因此需要脱酸以提高油脂品质。传统脱酸方法主要是化学碱炼法和物理精炼法，近年来多用生物精炼法。原理：一定的条件下，脂肪酶催化脂肪酸与甘油酯化生成中性甘油酯。已经证明生物精炼与

16、常规的碱炼、脱色、脱臭工艺结合或与物理精炼工艺结合起来应用，是一种非常有效的处理高酸值油脂的工艺技术。油脂的改性通常采用酯交换技术，即通过改变油脂的脂肪酸和甘油酯的组成，从而改变油脂的性质。应用脂肪酶作为催化剂可以克服传统化学酯交换法产物纯度低、杂质多的缺点。目前人们已利用鸟桕脂、茶油等为原料，经动物胰脂酶或米黑毛霉（Mueor miehei）脂肪酶（Lipozyme IM）的l，3位定向催化酯交换改性，生产出了优质的类可可脂。脂肪酶用于油脂的水解，可改变传统油脂水解反应产物脂肪酸颜色深、发生热聚合和不适用于热敏性油脂的不足，并且还具有键选择性。芥酸分布在菜籽油甘三酯的1位和3位上，利用l，3

17、定向脂肪酶可有选择地水解出菜籽油的芥酸13。另外，脂肪酶还应用于植物油脱臭馏份中VE提取工艺的优化中。雷炳福等14人研究了解脂假丝酵母脂肪酶在从水解大豆油脱臭馏份中的甘油酯中提取天然VE的工艺，证明了脂肪酶可提高VE等天然成分的提取率。3.3在生物柴油中的应用生物柴油是由动植物油脂与短链醇经酯交换反应而得的脂肪酸单烷基酯，最典型的生物柴油是脂肪酸甲酯。生物柴油具有可再生、无毒、易于生物降解、燃烧尾气中有害气体和颗粒物的浓度大大降低、无二氧化硫排放、缓解温室效应等特点15。邹立壮等16利用Photobacterium lipolyticum M37脂肪酶催化废餐油和甲醇制备生物柴油，在反应温度4

18、0、pH值7.5、水质量分数0.4%、无溶剂条件下，一次加甲醇时转酯率可达70%，采用3次加甲醇，转酯率高达90%；魏金霞等17用固定化Candida sp.99-125脂肪酶催化色拉油进行转酯化反应，采用三步醇解法成功地将96%的色拉油转化为相应的甲酯，并且脂肪酶可重复使用25个周期（即50 d）而几乎无活性损失。蒋剑春等18用脂肪酶Novozym435和LipozymeTLIM联合催化猪油和甲醇制备生物柴油，最佳反应条件为：有机溶剂叔丁醇与油的体积比为0.55，醇油摩尔比为512，反应温度40，pH值7.0，反应20 h后脂肪酸酯产率达到97.6%。毕艳兰等19利用皱褶念珠菌和Novozy

19、m 435脂肪酶经两步酶法制备生物柴油，由于后者酶活性受甲醇影响较大，所以先通过前者脂肪酶在棕榈油和异辛烷比为11（V/V）、pH值7.0、温度30、脂肪酶0.1%及转速250 r/min最佳条件下催化水解棕榈油；然后利用Novozym 435脂肪酶催化第一步水解的产物（脂肪酸）与甲醇制备生物柴油，在脂肪酸与甲醇比为65、反应温度30的条件下，转酯率高达98%。而在丁醇介导系统中，用Novozym 435脂肪酶单步酶法催化棕榈油和甲醇制备生物柴油，转酯率只有92%，而且皱褶念珠菌和Novozym 435脂肪酶分别重复使用10个和50个周期，几乎无活性损失。3.4在有机合成中的应用脂肪酶在有机合

20、成中的应用已成为国内外的研究热点，脂肪酶催化反应不仅具有高度的立体选择性和区域选择性，还具有催化反应条件温和、无环境污染等优点，特别适合某些化学方法难以实现的多功能化合物的合成，减少副产物的产生。曹健等20研究了在水-有机溶剂二相体系中催化水解消旋萘普生甲酯合成（S）-萘普生的一系列参数对皱褶假丝酵母脂肪酶（CRL）立体选择性的影响，并获得了（S）-萘普生的最高对映体比率，对映体选择率为171.1，转化率为49.8%，底物对映体过剩值为95.7%。谭天伟等21利用南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）高效区域选择性酰化合成6-氮尿苷的5-O-单酯。研究表明，选择不同类型的酰基供体，对CALB的活性具

21、有重要的影响，以乙酸乙烯酯作为酰基供体时反应速率、底物转化率和区域选择性都很高。 徐剑河等22克隆了黏质沙雷菌ECU1010的一种脂肪酶，并在大肠杆菌中表达，这种重组脂肪酶能立体选择性水解（R，S）-酮洛芬酯合成（S）-酮洛芬，产物对映体过剩值达到91.6%，对映体选择率达到63，转化率高达48.2%。3.5在手性化合物合成方面的应用脂肪酶催化合成手性化合物的基本类型有两个：（1）前手性底物的反应；（2）外消旋化合物的拆分。催化的底物已由传统的前手性或手性醇和羧酸酯扩展到二醇、二酯、内酯、胺、二胺、胺基醇、或羟基酸等.因此，大多数重要的功能性有机化合物可通过脂肪酶催化立体选择性地制备。文西等2

22、3用固定化YILip2脂肪酶对（）-苯乙胺进行氨解，在45时，以乙酸乙酯作为酰化剂，添加3%正己烷及6倍固定化脂肪酶，反应6 d，产物对映体过量值可达到96.0%，对映体选择率为190。任梦远等24采用离子交换法固定化Candida rugosa脂肪酶，催化（）-薄荷醇的酯化反应，结果表明，固定化脂肪酶具有很高立体选择性，在pH值5.0、酯化温度30、Aw 0.69和固定化反应150 min的条件下，固定化脂肪酶在离子液体PF6中催化拆分（）-薄荷醇的效果最佳，对映体过量值可达93，对映体选择率为35。3.6在三甘酯结构测定中的应用脂肪酶可根据其底物专一性来分类。例如：青霉（Penicilli

23、um sp.）、米黑毛霉（Mucor miehei）所产脂肪酶作用于甘油1位和3位羟基，定义为1,3专一性脂肪酶；而柱状假丝酵母（Candida cylindracea）、假单胞菌（Peudomona sp。）及染色粘性菌（Chromobacterium viscosum）所产脂肪酶则为随机水解酶25。并且白地霉（Geatrichum candium）产脂肪酶对顺式不饱和脂肪酸，如油酸具有选择性，而米黑毛霉（M.miehei）的脂肪酶则同样不与多不饱和脂肪酸（PUFA），如-亚油酸和二十二碳六烯酸（DHA）作用，对脂肪激素敏感的脂肪酶则可优先从三甘酯中释放PUFA。因此，通过特定的脂肪酶催化含

24、不同类型的脂肪酸酯，可以产生特定的脂肪酸水解产物，可据此推测三甘酯的结构4。3.7在医药工业中的应用脂肪酶在药业中主要用于助消化、降血脂、局部消炎，亦可用于临床诊断脂血病、胰腺炎等疾病，市场上已有作血脂分析用的酶制剂出售。脂肪酶还可用于药物合成，近年来，利用脂肪酶已合成抗炎镇痛药物、抗抑郁药物及其中间体、抗肿瘤药物以及维生素类药物。利用脂肪酶的高度立体选择活性，可催化不对称水解、酯化、转酯化和胺解等反应制备光学活性化合物。脂肪酶催化合成手性化合物目前已成为合成手性药物的主要方法，主要应用有前手性底物的不对称化和外消旋化合物的拆分两类。曹健等20人研究了在水有机二相体系中催化水解消旋萘普生甲酯合

25、成（S）萘普生的一系列参数对CRL立体选择性的影响。赵莉莉等26人研究证实固定化的节杆菌属螺菌脂肪酶（ABL）在动力学拆分氟西汀中间体时具有极好的特性。邱寿宽等27人用固定在丁基纤维素上的洋葱假单胞杆菌脂肪酶高效合成了杀菌剂（R）甲霜林的重要中间体2甲氧乙基（R）N（2，6二甲苯基）丙氨酸（R）Z。王雁萍等7人利用CALB的区域选择性醇解合成了一系列新的2，3，6氮尿苷双酰化衍生物，产率均较高，合成的亲水和亲脂性衍生物可用作6氮尿苷的前药。3.8在纺织工业中的应用脂肪酶在纺织工业上主要可用于纺织原料脱脂及改善性能。张静等28人用商品脂肪酶处理羊毛纤维，并研究了处理后的羊毛纤维的物理和化学变化，

26、发现无水碱液处理的羊毛纤维表面仍存在脂肪酸，用脂肪酶可去除，对改善羊毛性质效果很好。韩慧芳等29人研究了脂肪酶对丝纤维除蜡效果的影响，以及用脂肪酶和蛋白酶同时除蜡及脱胶对丝纤维失重率、上染率、润湿性、显微结构、手感和光泽等性能的影响，结果表明用法和用量得当的情况下，使用脂肪酶的效果优于不用脂肪酶很多。脂肪酶用于皮革工业能除去皮革胶原纤维间及皮毛上的油脂，不仅不影响皮革厚度和牢度，且处理后皮毛产品丰满柔软，弹性好。Achwal W B研究了脂肪酶对棉纤维的作用。另外，棉织物的脱浆过程中，淀粉酶和脂肪酶还可以将淀粉降解成水溶性物质，减低废水污染程度。李歆等8人研究了脂肪酶水解对涤纶长丝纱线的改性作

27、用。3.9在化学品合成工业中的应用脂肪酶催化化工合成可制备一些化学法生产成本较高的化工产品，近年来在生物表面活性剂、结构酯、维生素脂、蜡脂等方面有较多应用。生物表面活性剂主要指中长链脂肪酸与多羟基醇如甘油、山梨醇和糖类化合物形成的酯类产品。其中糖基连接长链脂肪酸或羟基脂肪酸形成的糖酯被广泛用作化学乳化剂，由于本身无毒且可生物降解，一些糖酯已被用作食品添加剂。结构酯这里指通过脂肪酶催化的酯化、酸解和酯交换反应改变脂肪酸链在甘油酯结构中的定位和分布或者在特定的位置替换上新的脂肪酸而形成，可以使油脂获得新的代谢途径和营养功能。有关微生物脂肪酶用于油脂修饰和结构酯合成的研究很多，其中固定化酶Lipoz

28、ymeRM IM（来源于Rhizomucor miehei lipase）已经用于SSTs商品化生产12。脂肪酶催化维生素生成维生素酯可改善一些易氧化变质的维生素的稳定性，并使其具有良好的脂溶性。如用固定化Candida antartica脂肪酶能有效地将维生素C转化为相应的脂肪酸酯。蜡酯是含C16以上偶数碳原子的高级脂肪酸与高级脂肪醇所形成的酯，用作高级润滑剂和润肤油的原料。近年来，已经用固定化Candida sp99125脂肪酶在无溶剂体系中催化菜籽油和鲸蜡醇转酯化反应合成液态不饱和蜡酯，可用作天然鲸蜡油的替代品11。3.10在其他工业方面的应用脂肪酶也应用在造纸工业、化妆品业、清洁剂工业

29、、生物感应器工业和环保工业等方面，特别是它在环保工业中的应用已成为当前研究的热点。如脂肪酶可应用于生物防污，处理含油废弃物。油污染的土壤或海岸、脂质加工厂或餐厅的废弃物，都可以利用不同来源的脂肪酶直接或间接加以处理。在废水处理时加入一定量的脂肪酶，可高效除去脂肪，减少废水处理的成本和降低二次污染。用含有脂肪酶及其他成分的复合制剂处理海中的石油，可将石油降解成适合微生物的营养成分，为浮在油表面的细菌提供优良养料，使得分解石油的细菌迅速繁殖，以达到快速降解石油的目的。4展望随着细胞工程、基因工程、固定化酶技术以及界面酶促反应等技术的快速发展，对脂肪酶的研究进一步深入，特别是对产脂肪酶的菌株进行诱变

30、育种及分子改造等方面取得了长足进展。目前，脂肪酶主要用于生产高附价值的具有热敏性的产品。然而，脂肪酶在应用中需要克服几个瓶颈：酶成本高、活性低、稳定性低和低反应产率。因此，为了进一步提高脂肪酶在工业领域中的应用，筛选和开发出具有新型催化活性和高稳定性的微生物脂肪酶将成为脂肪酶研究的热点和重点，新型脂肪酶的深入开发研究可以采取新的生物技术手段来实现，如宏基因组学和定点突变的DNA重组技术、蛋白质工程技术、固定化重组技术、化学修饰技术以及经全基因组测序和极端环境获得的产脂肪酶微生物进行体外定向进化技术等，从而为油脂精深加工、生物能源、生物医药等方面工业脂肪酶源的开发提供条件。脂肪酶在我国已应用非常广泛，新的应用领域也在不断拓展（如可再生能源和绿色化工等领域对新型酶催化转化技术的迫切需求使得越来越多的脂肪酶被应用到生物柴油、精细化学品及医药中间体合成等方面），脂肪酶已被认为是继蛋白酶、糖化酶之后的又一大工业用酶。但是，与国外相比，我国对脂肪酶的研究和开发较晚，目前脂肪酶种类欠丰、活性不稳定、回收困难、成本昂贵、固有的最大动力学拆分率仅有50，这些因素都限制了脂肪酶的应用范围。因此，尽快筛选酶活力高、产量高及低成本