第六章微生物的生长及其控制.docx

1、第六章微生物的生长及其控制第六章 微生物的生长及其控制微生物不论其在自然条件下还是在人为条件下发生作用，都是通过“以数取胜”或“以量取胜”。生长和繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。微生物生长是指由于细胞成分的增加导致微生物的个体大小、群体数量或两者的增长。个体细胞生长：细胞内组分的增加，导致细胞总量（体积、质量、大小）扩大的生物学过程。是逐渐发生的量变的过程。个体繁殖：是微生物个体生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。是质变的过程。由于微生物个体微小，以个体为对象研究其生长和繁殖十分不便，常以群体数量的变化来研究微生

2、物的生长。在微生物学中，凡说“生长”一般均指群体生长，这与研究大型生物有所不同。群体生长：指在一定时间和条件下，微生物细胞总量的增加。既有量变也有质变。三者之间的关系： 个体生长 个体繁殖 群体生长 群体生长 个体生长 个体繁殖第一节 测定生长繁殖的方法 测定生长的方法是以原生质含量的增加为基础，测定繁殖是建立在计算个体数目上。一、测生长量直接方法：测菌体细胞（数）量、菌体体积、菌体质量等；间接方法：根据细胞内某种物质的含量或某种代谢活动强度间接测定。（一）直接法1、测体积这是一种粗放的方法。将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或离心沉降，观察其体积。污泥沉降比（SV）：为含有污泥的混合液在

3、量筒中静置30 min后所形成的沉淀污泥的容积占原混合液容积的百分数，以%表示。又叫30 min沉淀率。 该参数是评定活性污泥质量的重要指标之一。 正常范围为15-30%。2、称重此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。包括称干重（DCW）和湿重。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重。如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。微生物干

4、重一般为其湿重的10%-20%。以上都是液体培养时的称重法。如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌，可先加热至50，使琼脂熔化，过滤得菌丝体，再用50的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。（二）间接法1、比浊法采用分光光度计对微生物菌悬液进行测定，波长通常在450-650 nm之间。原理：细胞越多，浊度就越大，则分光光度计测量的光密度值（OD值）就越大。对于单细胞微生物，在一定范围内OD值与细胞总数成正比关系。2、生理指标法微生物生长过程中，生长量与很多生理指标相平行，可以通过测定细胞的含N、C、P、DNA量等间接计算。 原理：若某物质在各细胞中的含量一样，那么细胞构

5、造中这种物质的总量就与总的微生物细胞量直接相关。氮量测定法： 细菌 含氮量6.5%-13% 霉菌 含氮量4.5%-8.5% 酵母菌 含氮量7.5%左右粗蛋白含量=含氮量6.25方法有：凯氏定氮法、Nessler法、过氯酸消化法等。二、计繁殖数对于繁殖来说，一定要计算微生物的个体数目，所以计繁殖数只适用于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。（一）直接法直接法就是指在显微镜下直接观察细胞并继续计数的方法，所得的结果是包括死细胞在内的总菌数。1、比例计数法 将已知颗粒浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，然后求出未知菌液中的细胞浓度。2、血球计数板

6、法采用血球计数板测定一定体积中的细胞总数目的常规方法。测定中按统计学原理计数n格中微生物细胞数量，取平均值。优点：此法容易、迅速、成本低、而且能观察细胞的大小和形态特征。缺点：样品中细胞数量不能太少；无特别的技术就不能区分死活细胞。鉴别死活细胞可以先进行染色处理。原理：美蓝进入活细胞后，可被还原脱色，而死细胞及代谢缓慢的老细胞，无还原能力可被着色，借此可区分活菌和死菌。（二）间接法：活菌计数法。液体培养基变浑浊、固体培养基上（内）长菌落。菌落计数法最常用。原理：活菌能在固体培养基上（内）形成菌落。1、倾倒平板法/浇注平板法/混菌法方法：取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前（50左右

7、）均匀混和。保温培养。稀释平板计数时，在一个9cm直径的培养皿平板上，不同种类微生物的稀释度计数标准是：细菌：50-500个菌落；放线菌：30-300个菌落；真菌：10-100个菌落CFU PFU 菌落计数器从平板上（内）出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液中含有的活菌数（一个菌落来源于一个活细胞）。2、涂布平板法 a将少量样品加到已凝固的琼脂平板中央；b将玻璃三角棒浸入酒精；c将蘸有酒精的涂布棒在火焰上灼烧后冷却；d均匀涂布后适当条件下培养方法：取一定体积的稀释菌液，涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养。从平板上出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液中含有的活菌数（一个

8、菌落来源于一个活细胞）。3、滤膜培养法方法：使样品滤过一种特制的，孔径小于细菌个体的滤膜，然后将滤膜置于培养基上或浸润有液体培养基的垫状物上培养，通过计算在滤膜上形成的菌落数就可知样品中的活菌数。第二节 微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长1、微生物的个体生长细菌的个体生长包括细胞结构的复制与再生、细胞的分裂与控制。在整个生长过程中，微小的细胞内发生着阶段性极其复杂的生物化学变化和细胞学变化。研究这一变化，目前使用的方法有两种：一是用电子显微镜观察细胞的超薄切片；二是使用同步培养技术。2、微生物的同步生长在分批培养中，细菌群体能以一定速率生长，但所有细胞并非同时进行分裂。也就是说，培

9、养中的细胞不处于同一生长阶段，它们的生理状态和代谢活动也不完全一样。显然，如果以群体测定结果的平均值代表单个细胞就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技术。 同步培养法：使培养基中所有微生物细胞处于相同的生长阶段的培养方法。用同步培养法所得到的细胞叫同步细胞或同步培养物。意义：采用同步培养技术就可以用研究群体的方法来研究个体水平上的问题。同步生长：培养物中所有的微生物细胞都处于同一生长阶段，并能同时分裂的生长方式。获得同步生长的方法：（一）机械法：依据：处于同一生长阶段的细胞的体积、大小相同。1、过滤分离法：应用各种孔径大小不同的微孔滤膜，可将不

10、同步的大小不同的细胞分开，然后用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。 2、离心法：通过密度梯度离心就可使处于不同生长阶段的大小不同的细胞群体在一定程度上分开，然后用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。 3、硝酸纤维素滤膜法：常用（二）环境条件控制技术即用温度、培养基成分或用能够影响细胞周期中主要功能的代谢抑制剂等条件，来诱导细菌进行同步生长的方法。二、单细胞微生物的典型生长曲线除某些真菌外，我们肉眼看到或接触到的微生物已不是单个，而是成千上万个单个的微生物组成的群体。微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。分批培养：在一个密闭系统内一次投入液体培养基，一次接种，经过

11、若干时间的培养后再将培养液一次放出的培养操作类型。生长曲线：即分批培养生长曲线。以培养时间为横坐标，以细胞数目的对数值为纵坐标，绘制所得曲线。一条典型的生长曲线至少可以分为迟滞期、指数期（对数生长期）、稳定期和衰亡期等四个生长时期。1、迟滞期（1）现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。通常，细菌、酵母菌的迟滞期最短，霉菌次之，放线菌最长。（2）细胞特点：生长速率为0；细胞形态变大或变长；细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高；合成代谢活跃，易产生各种诱导酶（为适应环境）；对外界不良条件（如NaCl溶液浓度、热、紫外线、X-射线、抗生素等物理化学因素）反应敏感。（3）影响延滞期长短的因素菌种 通常，

12、细菌、酵母菌的迟滞期最短，霉菌次之，放线菌最长。 通过遗传学方法改变种的遗传特性使延滞期缩短，选用繁殖快的菌种。接种龄接种龄：是指种子罐中培养的菌种开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种龄以菌种处于生命力极为旺盛的对数生长期末期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时较为合适。此时的种子能很快适应环境，生长繁殖快，可以大大缩短延滞期。过于年轻的种子接入种子罐后，往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟。过老的种子会引起生产能力下降而菌体过早自溶。实际中，最适合的接种龄应通过多次实验确定。接种量接种量：是指移入的种子液与接种后培养液体积的比例。 接种量的大小取决于生产菌

13、种在发酵罐中生长繁殖的速度。适当扩大接种量可缩短延滞期，克服不良的影响。当种子量多时，种子液中含有大量体外水解酶类，有利于对基质的利用，并且生产菌迅速被占据了整个培养环境，则可减少染菌的机会。但是，如果接种量过多，造成培养液粘度增加，溶解氧不足等。接种量一般为10%（V/V）。培养基成分培养基成分相差太大，接种后细胞适应时间长。所以，应尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大，以缩短适应时间。在发酵中，常使发酵培养基的成分与最后一级种子培养基的成分保持一致。（4）产生原因由于微生物进入新环境，代谢系统有一个适应过程。因此，延滞期又叫调整期或适应期。产生的原因可能是：接种后，新的M与原来的M

14、成分不同，细胞需要时间合成新的酶来利用新的营养物质； 接种后，细胞内的一些关键小分子、离子或酶由于稀释作用导致浓度下降，恢复到原来水平需要时间；种子较老，缺乏ATP，必需的辅助因子及核糖体；细胞可能受损伤而需要一段时间恢复。2、对数生长期/指数期细菌经过迟滞期进入对数生长期，并以最大的速率（且生长速率不变）生长和分裂，导致细菌数量呈对数增加，而且细胞内各成分按比例有规律地增加。（1）现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。（2）细胞特点生长速率常数最高，代时最短且稳定。因为这时养分、空间较丰裕，而排出的代谢物还不足以影响生长。若培养基及培养条件适当，生长速度就更快。 在对数期，每

15、个细胞以恒定时间间隔进行分裂，细胞数量以2n方式增加（因而细胞数量以指数或对数方式增加）。细胞数目增加一倍所需要的时间称为代时或倍增时间。细胞生长平衡 a.所有细胞组分呈彼此相对稳定速度合成； b.大小、组成、生理特征等均趋于一致。若营养水平或其它环境条件改变，将导致不均衡生长。酶系活跃，代谢旺盛。意义：对数生长期细菌的代谢活性、酶活性高而稳定，大小比较一致，生活力强，因而它广泛地在生产上用作“种子”和在科研上作为理想的实验材料。（3）影响对数生长期长短的因素菌种代时随菌种而异。例如，大肠杆菌为12.5-17 min，枯草芽孢杆菌26-32min，结核分枝杆菌792-932 min。营养成分：

16、同一菌种，营养越丰富代时越短。营养物浓度营养物在低浓度时影响菌体的生长速率，在高浓度时影响菌体的生长量。如果某营养物在较低浓度范围内可影响菌体的生长速率和生长量，称此营养物为生长限制因子。培养温度：最适生长温度为最佳。大肠杆菌（E.coli）在不同温度下的代时温度（）101520253035404547.5代时（分）8601209040292217.52077（4）对数生长期的意义研究代谢和生理性能的好材料；生产中用其作种子；增殖噬菌体的最佳宿主3、稳定期（1）现象活菌数目不增不减（生长和死亡处于动态平衡），总菌数达到最大，曲线有下降的趋势。最初表现是代时延长，菌体生长变得缓慢。（2）产生原因

17、营养物质尤其是生长限制因子的大量消耗；营养物的比例变得失调：例如C/N比不合适等；有毒代谢产物（如酸、醇、毒素及H2O2等）的大量积累；外界条件（如pH、氧化还原电位等）变得越来越不适宜。（3）细胞特点生长速率常数为0：新繁殖的细胞数等于死亡的细胞数，处于动态平衡。代谢活动继续进行，并保持相当水平；芽孢杆菌开始形成芽孢，细胞内开始贮藏物质（如脂肪、PHB等）。菌体量达到最高值生长得率表示了微生物对基质利用效率的高低。不仅是菌体量最高时期，还是代谢产物最多的时期。主要是抗生素、氨基酸等次级代谢产物。（4）影响稳定期长短的因素：菌种和培养条件。（5）稳定期的意义若以生产菌体或次级代谢物为目的，稳定

18、期是最佳收获期。对生物测定来说，稳定期是最佳测定时期。如果及时采取措施，补充营养物或取走代谢产物或改善培养条件，可获得更多的菌体物质或代谢产物。4、衰亡期（death phase）（1）现象：总菌数不变，活菌数曲线下降；细胞自溶（pH值上升）。（2）产生原因营养物质耗尽、有毒代谢产物的大量积累、理化环境的不利。（3）细胞特点细胞形态发生多行化，包括畸形和衰退形；细胞内颗粒更明显，出现液泡；菌体自溶：原因：细菌本身所产生的酶使细胞分解。芽孢杆菌释放芽孢；生理代谢活动停滞。（4）影响衰亡期长短的因素衰亡期与其它各期比较相对较长，其时限决定于细菌本身遗传性能及环境条件。低温、隔绝空气均能延长这个时期

19、。注意：以上是单细胞M.B（如细菌、酵母）分批培养正常生长所经过的各个生长期。但丝状菌（如放线菌、霉菌）没有对数生长期。生长曲线各时期特点的比较延滞期指数期稳定期衰亡期R0最大值0负值代时较长短较短长细胞形态大或长正常较正常易变，自溶生理代谢特性RNA含量高，细胞质呈碱性，对不良条件敏感，合成诱导酶，合成代谢旺平衡生长，酶系协调，合成代谢与分解代谢平衡细胞内累积贮藏物，合成次生代谢产物，形成芽孢蛋白酶活跃，分解代谢旺，分泌次生代谢物，释放芽孢细胞浓度最低较高最高快速降低用作种子后生长延期滞长生长延期滞短生长延期滞中等生长延期滞长三、微生物的连续培养在分批培养中，培养液中的细胞浓度、基质浓度和产

20、物浓度均随时间不断发生变化，处于一个不稳定的过程。必需营养物质的消耗或毒性产物的积累造成微生物生长的减慢和停止。 连续培养：当微生物以分批培养方式培养到对数生长期的后期时，一方面以一定的速度连续流入新鲜培养基和新鲜空气（指对好氧菌），并立即搅拌均匀，同时利用溢流方式（以相同速度 ）连续不断流出含有产物和细胞的培养液，使培养器内的微生物长期处在适宜的培养基中，并保持指数期方式生长，借以提高微生物的生长的代谢效率。连续培养时pH值、温度、营养成分的浓度、溶解氧等保持一定，微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上，所以培养基中微生物的生长和代谢活动始终保持旺盛的稳定状态。 连续培养过

21、程近似恒态。连续培养器的类型同样很多，连续培养重要特征是使微生物增殖速度和代谢活性处于稳定状态。连续培养方法按控制方法可分为恒浊器法和恒化器法。恒浊连续培养：通过光电装置自动测定并调节加入培养液的流速来保持培养物浊度恒定的培养方法。它可以实现微生物的高速生长，并提供大量形态与生理特征一致的细胞。在发酵工业中，为了获得大量菌体及与菌体平行的代谢产物时，往往采用此法。恒化连续培养：控制加入培养液的流速恒定，使培养室中营养物质的浓度保持恒定，从而保持微生物恒定的生长速率。一般找一种微生物必需的营养物质作为限制因子，通过控制限制因子的流速恒定即可。常用的限制因子有氮源如氨基酸、氨，碳源如葡萄糖、麦芽糖

22、及生长素，无机盐等。恒化连续培养多用于微生物的科研与教学中。和分批培养相比，连续培养的优点有：可以维持稳定的操作条件，所以产品质量相对稳定；能实现机械化和自动化，降低了劳动强度，减少了染菌机会；减少设备清洗、准备和灭菌等非生产时间，提高了设备利用效率；容易对过程进行优化。连续培养法的缺点：需要专门仪器，投资高；由于是开放系统，加上反应周期长，容易染菌；在长周期连续培养中，菌种易于退化；营养物的利用率一般低于单批培养；新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合，影响培养和营养物质的利用。四、微生物的高密度培养主要局限在大肠杆菌（E.Coli）和酿酒酵母的研究上。高密度培养：是指微生物在液体培养中细

23、胞群体密度超过常规培养的10倍以上时的生长状态或培养技术。以E.Coli为例，进行高密度培养的方法主要有：（1）选取最佳培养基成分和各成分含量；（2）补料；（3）提高溶解氧的浓度；（4）防止有害代谢物的生成第三节 影响微生物生长的主要因素微生物的生长繁殖以多种营养物质为基础，但同时又受到各种环境因素的制约，如环境条件不适宜，微生物的生命活动就会受到影响，甚至发生变异或死亡。环境条件包括：温度、pH值、氧气、氧化还原电位、渗透压、化学物质、辐射和超声波等。一、温度1、三种基本温度（or生长温度三基点）高温之所以能杀菌，最主要原因是高温使蛋白质变性凝固。各种微生物耐高温的程度大不相同，最大的区别在

24、于它们是否能够产生耐热的芽孢。芽孢是耐高温的，但是各种芽孢耐热的程度又不同。微生物对低温的抵抗力一般比对高温的抵抗力强。低温只能抑制微生物的生长，但其致死作用较差。所以，可以利用低温保存菌种。各种微生物都有其生长发育的最适温度。大多数微生物的最适生长温度在25-27，在此温度范围内，微生物生长繁殖最快。温度和微生物生长的关系有两方面：通常温度每升高10，生长速度就加快1倍；其次，不同生长阶段对温度的反映不同。2、按最适生长温度 将微生物分类 嗜冷菌（20） 中温菌（2045） 嗜热菌（45）（1）最低生长温度：微生物生长的最低温度一般在-10-5，极端的可达-30。低于最低生长温度，M.B的生

25、长受到抑制。（2）最高生长温度：微生物生长的最高温度一般80-95，极端的105-150。超过最高温度，M.B变性死亡。（3）最适生长温度：微生物代时最短或生长速率最高时的培养温度。通常是一范围。简称“最适温度”。对于同一微生物来说，其不同的生理生化过程有着不同的最适温度。也就是说，最适生长温度并不一定等于菌体生长量最高时的培养温度；也不一定等于发酵速度最高时的培养温度；也不一定等于积累某一代谢产物量最高时的培养温度。二、氧气按照与氧的关系，可将微生物分为好氧微生物（好氧菌）和厌氧微生物（厌氧菌）两大类，并可进一步细为5类：兼性好氧微生物/兼性厌氧微生物：既可在有氧条件，又可在无氧条件下生长的

26、微生物。1、专性好氧微生物与氧的关系必须在较高氧浓度下才能生长的微生物，氧的作用： 一是作为好氧呼吸的最终电子受体； 二是参与体内甾醇和不饱和脂肪酸的生物合成。虽然好氧微生物在利用氧进行好氧呼吸时会产生的有毒的过氧化物（例如把O2分解成H2O2），但因为细胞内具有相应的过氧化氢酶、过氧化物酶，可将H2O2再分解成H2O和O2，所以不会中毒。 好氧微生物需要的氧主要是溶解在水中的溶解氧（DO），DO受温度、大气压等因素的影响，若污水中含有机物，则DO更低。增大DO值的常用方法：通气（空气或纯氧）； 搅拌（实验室里可用摇床振荡）。2、兼性厌氧微生物与氧的关系因为既具有脱氢酶又具有氧化酶，所以，它们

27、既能在无氧条件又能在有氧条件下生存。在有氧条件下生长，氧化酶活性强，具备完整的呼吸链；在无氧条件下，细胞色素和电子传递体系的其他组分减少或缺失，氧化酶无活性。在无氧环境生活的兼性厌氧菌一旦进入有氧环境，则呼吸体系很快恢复。3、专性厌氧微生物与氧的关系分布：湖泊、河流和海洋的沉泥中；泥潭、沼泽、积水的土壤中；污水或污泥的厌氧处理系统中。根据对氧的敏感性，可分为：专性厌氧微生物：在绝对无氧的条件下生存，一遇氧就死亡，如所有产甲烷菌等；兼性厌氧微生物：在有氧的环境中，既不利用氧，也不会中毒，如大多数的乳酸菌。专性厌氧微生物生境中要杜绝氧的原因：（1）在有氧条件下，专性厌氧微生物代谢产生的NADH2和

28、O2反应生产H2O2和NAD+，由于其体内不具有过氧化氢酶，这样将被生成的H2O2杀死。（2）微生物还可由O2产生一种具有强氧化性的游离的氧原子O2，专性厌氧微生物不具有超氧化物歧化酶而被O2杀死。三、pH值pH值反映了溶液中氢离子浓度的大小。绝大多数微生物的生长pH都在5-9之间。三种基本pH值：最低pH值、最高pH值、最适pH值范围。微生物生长有最适pH值，微生物发酵也有其最适pH值。微生物生长的最适pH与发酵的最适pH往往不同。pH值的影响主要表现在：（1）pH值影响细胞膜的电荷分布，从而影响M.B对营养物质的吸收；（2）pH值影响酶的活性，从而影响代谢过程；（3）pH值还影响基质和产物

29、的解离，从而影响营养物质的吸收和代谢物质的排除。培养容器中的pH值并不是一成不变的，M.B的代谢活动能降低pH值两个单位；变化了的pH值又反过来影响M.B的生长和代谢。因此，需要采取措施控制培养液的pH值相对稳定。注意：虽然微生物外环境的pH值变化很大，但细胞内环境的 pH值却相当稳定，一般都接近中性。第五节 有害微生物的控制有我们生活的周围，到处都有微生物的存在，且形形色色，其中一部分是对人类有害的，它们通过气流、接触或人工接种等方式，传播到合适的基质或生物对象上而造成种种危害，如食品的霉变、实验室中微生物的污染，工业发酵中的杂菌污染；以及动植物受病原微生物的影响而患各种传染病等，对皮类有害

30、微生物，我们应采取有效措施加以控制或消灭。一、控制有害微生物的措施：（杀菌、抑菌）彻底杀灭-灭菌（杀菌、溶菌）杀灭部分杀灭-消毒抑制霉腐微生物-防腐抑制抑制宿主体内的病原菌-化疗分别介绍一下：灭菌：（Sterilization）采用强烈的物化因素使任何物体内外部的一切微生物及其孢子永远丧失生长繁殖能力。如各种形式的高温灭菌。灭菌又可分为杀菌和溶菌两种，前者菌体死，但形体在，后者化为乌有。消毒（Disnfection）是指采用一种较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一分对人体有害的病原菌的一种措施。如对皮肤、水果、饮用水等进行药剂消毒，对啤酒牛奶、果汁进行巴氏消毒。防腐：（Antisepsis）是指利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉变的措施。措施：