现代分子生物学复习资料课件整理.docx

1、现代分子生物学复习资料课件整理第一章绪论分子生物学:从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学 ，主要指遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复）、基因的表达（转录和翻译）与调控。分子生物学研究内容 DNA重组技术（基因工程）1、可被用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽 ;2、可用于定向改造某些生物的基因组结构 ;3、可被用来进行基础研究 基因的表达调控1信号转导研究;2转录因子;3研究RAN剪接 生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） 基因组、功能基因组与生物信息学研究第2章染色体和DNADNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的

2、，故称半不连续复制在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。DNA的复制过程（大肠杆菌为例） 双链的解开;DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。 ori(或o）、富含A、T的区段 RNA引物的合成:DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。引物长度约为几个至10个核苷酸， DNA链的延伸 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称

3、为复制叉在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成5 3 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。复制的几种主要方式 P421、双链环状、型复制、双向等速2、滚环型：单向复制的特殊方式如：174的双链环状DNA复制型（RF)（1）模板链和新合成的链分开;（2）不需RNA引物，在正链3OH上延伸（3）只有一个复制叉;3、D环复制 单向复制的特殊方式如：动物线粒体DNA真核生物中DNA的复制特点1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子（约150bp左右）；2、复制叉移动的速度较慢（约50bp秒），仅为原核生物的110。3、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点

4、不再重新开始DNA复制；真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点4。、真核生物有多种DNA聚合酶。5、真核生物DNA复制过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。（真核冈崎片段长约100-200bp，原核冈崎片段长约1000-2000bp。原核和真核生物DNA的复制特点比较复制起点（ori）：原核一个，真核多个；复制子 ：原核一个，真核多个；复制子长度：原核长；真核短；复制叉：原核多个；真核多个；复制移动速度：原核较快；真核较慢；真核生物染色体在全部完成复制前，各起始点的DNA 复制不能再开始。而在 快速生长的原核生物中，复制起点上可以连续开始新的DNA复制。原核生物染色体的复制与细胞分裂

5、同步，可以多次复制；真核生物染色体的复制发生在S期，是细胞分类的特定时期，而且仅此一次。DNA修复系统 功能错配修复 恢复错配碱基切除修复 切除突变的碱基核甘酸切除修复 修复被破坏的DNADNA直接修复SOS系统 修复嘧啶二体或甲基化DNA，DNA的修复， 导致变异第3章生物信息的传递（上）转录录:生物体以DNA为模板合成RNA的过程 参与转录的物质原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板:DNA;酶: RNA聚合酶;其他蛋白质因子RNA合成方向：5 3与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链。结构基因：DN

6、A分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。转录单元（transcription unit）一段从启动子开始至终止子结束DNA序列。 RNA聚合酶原核生物RNA聚合酶（大肠杆菌为例）全酶=核心酶+ 因子大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析（看书）真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较（看书）RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别 RNA聚合酶 DNA聚合酶大小(M) 大，4.8105dol 小，1.09105dol引物 无 有产物 较短，游离 较长，与模板以氢键相连作用方式 一条链的某一段 两条链同时进行外切酶活性 无 5 3，3 5校对合成能力 无 有修复能力 无 有启动子定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并

7、启动基因转录的一段DNA序列。 TATA区：酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）TTGACA区：提供了RNA聚合酶全酶识别的信号转录起点：与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基真核有三种不同的启动子和有关的元件启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同真核生物启动子的结构：核心启动子（core promoter）和上游启动子元件（upstream promoter element，UPE）核心启动子：指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始上游启动子元件包括CAAT盒（C

8、CAAT）和GC盒（GGGCGG）等（CAAT：-70 - -80bpGGGCGG：-80 - -110bp)作用：控制转录起始频率。转录的基本过程：1、起始位点的识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。 RNA聚合酶全酶（2)与模板结合 2、转录起始 RNA链上第一个核甘酸键的产生RNA聚合酶全酶( 2 )与模板结合DNA双链解开在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物 3、RNA链的延伸亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。注意：9个核苷酸以前还在启动子区，容易

9、脱落，一旦形成9个以上的核苷酸并离开启动子区，转录正式进入眼神阶段。4、转录终止终止子（terminator）：位于基因的末端，在转录终止点之前有一段回文序列（反向重复序列）约6-20bp。真核生物终止: 由一段特定序列5AATAAA3和回文序列（反向重复序列）组成。分为两类： 强终止子内部终止子：不依赖Rho ()因子的终止。 弱终止子 需要因子（rho factor），又称为依赖性终止子（ Rho-dependent terminator）1)不依赖 因子的终止当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而

10、RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，RNA形成发夹结构；在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，RNA的3端为寡聚U终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度越长效率越高 2)依赖因子的终止 因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录增强子（P78）:概念：在启动区存在的能增强或促进转录的起始的DNA序列。但不是启动子的一部分。特点：1.远距离效应；2.无方向性；3.顺式调节；4.无物种和基因的特异性；5.具有组织特异性；6.有相位性；7.有的增强子可以对外部信

11、号产生反应。真核生物的转录过程(看书）1. 转录起始 真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。2. 转录延伸 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 3. 转录后加工 5端加帽;3端加尾 ；RNA的剪接;RNA的编辑 帽子结构功能：能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合；m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。多聚腺苷酸尾巴功能：提高了mRNA在细胞质中的稳定性。2.试比较原核和真核细胞的mRNA的异同.原

12、核生物原核生物mRNA 的半衰期短。许多原核生物mRNA以多顺反子形式存在。（单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。 多顺反子mRNA：编码多个蛋白质的mRNA）其5端无帽子结构，3端没有或只有较短的poly(A)。 SD序列：原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列的保守区。mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列 P85 原核细胞mRNA（包括病毒）有时可以编码几个多肽。 （本条供参考）原核生物常以AUG（有时GUG，甚至UUG）作为起始密码子（本条供参考）真核生物：其5端存在帽子结构。 绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾巴。（组蛋白除外） 以单顺反

13、子的形式存在其RNA最多只能编码一个多肽。 （本条供参考）真核生物几乎永远以AUG为起始密码子。（本条供参考）RNA合成与DNA合成异同点相同点：1、都以DNA链作为模板2、合成的方向均为53 3、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3,5-磷酸二酯键，使核苷酸链延长。不同点： 复制 转录模板 两条链均复制 模板链转录（不对称转录）原料 dNTP NTP酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶产物 子代双链DNA（半保留复制） mRNA， tRNA， rRNA配对 A-T；G-C A-U；T-A；G-C引物 RNA引物 无mRNA 3类内含子剪接 核酶的定义及发现第四章翻译：指将mRNA链上的核甘酸从一个特

14、定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。蛋白质合成的场所是 核糖体蛋白质合成的模板是 mRNA模板与氨基酸之间的接合体是 tRNA蛋白质合成的原料是 20种氨基酸三联子密码定义：mRNA链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核甘酸就称为密码子或三联子密码(triplet coden) 遗传密码的性质：1、 连续性：编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。 基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshift mutation)。从mRNA 5 端起始密码子AUG到3 端

15、终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框架(open reading frame, ORF)。2、简并性：由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymous codon）。编码某一氨基酸的密码子越多，该氨基酸在蛋白质中出现的频率就越高。Arg例外3、通用性与特殊性蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。4、摆动性：转运氨基酸的tRNA上的反密码子需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码子反向配对结合，在密

16、码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，这种现象称为密码子的摆动性tRNA的结构 1、二级结构：三叶草形 2、三级结构： “L”形 氢键 tRNA的功能1、解读mRNA的遗传信息2、运输的工具，运载氨基酸tRNA有两个关键部位： 3端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。 与mRNA结合部位反密码子部位tRNA凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码子相识别，把所带氨基酸放到肽链的一定位置。 tRNA的种类1、起始tRNA和延伸tRNA：能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA称起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。真核生物：起

17、始密码子AUG 所编码的氨基酸是Met，起始AA-tRNA为Met-tRNAMet。原核生物：起始密码子AUG 所编码的氨基酸并不是 甲硫氨酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA为fMet-tRNAfMet2、同工tRNA代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA。同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA合成酶识别（P119）。3、校正tRNA无义突变校正tRNA：可以通过改变反密码子区校正无义突变错义突变校正tRNA：通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质。无义突变：在蛋白质的结构基因中

18、，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。 错义突变：由于结构基因中某个核甘酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子，这种基因突变叫错义突变。GGA（甘氨酸） AGA（精氨酸）核糖体的结构与功能 1.核 糖 体是由rRNA（ribosomal ribonucleic acid）和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒，蛋白质肽键的合成就是在这种核糖体上进行的。2.核糖体的功能：合成蛋白质在单个核糖体上，可化分多个功能活性中心，在蛋白质合成过程中各有专一的识别作

19、用和功能。mRNA结合部位小亚基结合或接受AA-tRNA部位（A位）大亚基结合或接受肽基tRNA的部位大亚基肽基转移部位（P位）大亚基形成肽键的部位（转肽酶中心）大亚基蛋白质合成的过程(生物学机制）氨基酸的活化翻译的起始肽链的延伸肽链的终止蛋白质前体的加工肽链怎样进行进行终止的？ RF1：识别终止密码子UAA和UAG 终止因子 RF2：识别终止密码子UAA和UGA RF3：具GTP酶活性，刺激RF1和 RF2活性，协助肽链的释放 真核生物只有一个终止因子（eRF）核糖体循环步骤？蛋白质的运转机制1、翻译-运转同步机制2、翻译后运转机制(1)线粒体蛋白质跨膜运转(2)叶绿体蛋白质的跨膜运转3、核

20、定位蛋白的运转机制4、蛋白质的降解蛋白质运转的两种方式（蛋白质运转模式？怎样进行？）一.翻译-运转同步（co-translational translocation）： 是即将进入内质网的蛋白质的易位方式； 蛋白质正合成的时候就可与运转装置结合； 蛋白质合成时，核糖体定位于内质网表面，称膜结合核糖体(membrane-bound ribosome）。 分泌蛋白质大多是以同步机制运输的二.翻译后运转（post-translational translocation）：蛋白质翻译完成后从核糖体上释放，然合扩散至合适的靶膜并与运转装置结合。 蛋白质合成时，其核糖体不与任何细胞器相连，称游离核糖体(f

21、ree ribosome) 在细胞器发育过程中，由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的。参与生物膜形成的蛋白质，依赖于上述两种不同的运转机制镶入膜内。信号肽假说内容：（1）蛋白质合成起始首先合成信号肽（2）SRP（信号识别蛋白）与信号肽结合，翻译暂停（3）SRP与SRP受体结合，核糖体与膜结合，翻译重新开始（4）信号肽进入膜结构（5）蛋白质过膜，信号肽被切除，翻译继续进行（6）蛋白质完全过膜，核糖体解离第五章 分子生物学研究法基因操作：主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。基因工程：指在体外将核

22、酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。基因工程 所需元件：限制性内切酶;连接酶;载体;受体细胞常用的工具酶限制性核酸内切酶 切割DNADNA连接酶 生成3- 5磷酸二酯键DNA聚合酶 探针标记、补平3末端反转录酶 cDNA合成多聚核苷酸激酶 5磷酸化、探针标记末端转移酶 3末端多聚尾碱性磷酸酶 切除末端磷酸基限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。限制酶的命名命名原则：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序限

23、制性内切酶的特点：（1）. 限制性内切酶一般识别完全的回文结构，它具有两个基本特点： 能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对； 两条互补链的53的序列组成相同，即将一条链旋转180度，则两条链重叠。（2）. 识别-8个相连的核苷酸组成的特定核甘酸序列。（3） 切割方式有两种 错位切割，产生互补性的粘性末端。 错位切割所产生的DNA末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为黏性末端。带有相同黏性末端的DNA分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。 沿对称轴切割，产生平齐末端（4具有同裂酶:来源不同的限制性内切酶识别同样的核甘酸靶序列。 如：BamH I和Bst I

24、具有相同的识别序列GGATCC。（5） 具有同尾酶:来源各异，识别的靶序列也不同，但却产生相同的黏性末端，故同尾酶产生的黏性末端可以连接起来，但一般不能再被原来的任何一种酶所切割。 如：Taq I、Cla I和Acc I为一组同尾酶，其中任何一种酶切割DNA分子都产生5端CG凸出的粘性末端。目的基因的获得1）化学合成法：较短的基因（60-80bp） 用途：PCR引物;测序引物;定点突变;核酸杂交探针 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病

25、的目的。基因组文库和cDNA 文库基因库，也叫基因组文库， DNA文库（ DNA library)是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。将生物细胞基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。这样保存的基因组是多拷贝、多片段，当需要某一片段时，可以在这样的“图书馆”中查找（没有目录）。cDNA文库(P175):首先获得mRNA，反转录得cDNA，经克隆后形成文库。 cDAN文库和基因组文库的不同之处在于，cDNA文库除却了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分，便于DN

26、A重组的使用。其复杂性比基因文库低得多。 主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序，可根据克隆的cDNA分子的核酸序列直接推导出来。组建一个cDNA文库的步骤：1)分离表达目的基因的组织或细胞2)从组织或细胞中制备总体RNA和mRNA3）第一条cDNA链的合成，需要RNA模板，cDNA合成引物，逆转录酶，4种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液(Mg2+)等。4)第二条cDNA链的合成5) cDNA的甲基化和接头的加入6)双链cDNA与载体的连接据研究目的，选择克隆策略cDNA library =控制基因表达的调控序列；mRNA中不存在的特定序列cDNA library =蛋白质的氨基酸序列载体（Vector

27、）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。载体的条件分子小（10 Kb）； 有限制酶酶切位点 ； 可自主复制； 有足够的copy数 ；带筛选的标志用于原核生物宿主的载体：质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体用于真核生物宿主的载体：细菌人工染色体载体酵母人工染色体载体噬菌体PI载体和PACPlasmid：质粒是细胞染色体或核区DNA外能够自主复制的 很小的环状DNA分子 质粒载体特点1、 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2、至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。3、至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较

28、高的拷贝数。标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） 2）生化标记基因常用的遗传标记基因及其作用机制 1) 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 2) 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的内酰胺环，使氨苄青霉素失活。氯霉素抗性基因（ Cmlr ，Cmr

29、） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因Kanamycin，Neomycin和G418均可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。5）半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ） 半乳糖苷酶基因有1021 AAs（ 和链） lacZ（lacZ）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达半乳糖苷酶的-肽，产生有活性的半乳糖苷酶，在含有指示

30、剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZ -肽基因的结构，细菌内不能产生半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。半乳糖苷酶基因的优点: a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观； b. lacZ编码5-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性；c. lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大分子杂交： 是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的分子所处的位置的过程.分子杂交包括：DNA-DNA杂交（原位杂交、点杂交、Southern杂交），DNA-RNA杂交（Northern杂交）及蛋白杂交（Western 杂交）大多数的核酸杂交反应都是在固体支持物（滤膜）上进行的。采用滤膜进行核酸杂交是因为它们易于操作及保藏。 常用的滤膜有：醋酸纤维素滤膜、重氮苄氧甲基(DBM)-纤维素膜；氨基苯硫醚(APT)-纤维素膜，尼龙膜及滤纸等。Probe（杂交探针）：探针，是由放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记后，能与目的基因片段特异性杂交的已知序