整理plackettburman实验设计及响应值.docx

1、整理plackettburman实验设计及响应值每名环境影响评价工程师申请登记的类别不得超过2个。（1）非煤矿矿山的建设项目（注：对煤矿建设项目有单独特别规定）；（3）环境影响分析、预测和评估的可靠性；4.选择评价方法2）购买环境替代品。3.政府部门规章1.依法评价原则；三、安全预评价报告的基本内容规划编制单位对可能造成不良环境影响并直接涉及公众环境权益的专项规划，应当在规划草案报送审批前，采取调查问卷、座谈会、论证会、听证会等形式，公开征求有关单位、专家和公众对环境影响报告书的意见。（4）环境保护验收。谷胱甘肽高产菌株的选育及其培养条件的研究贾 建 萍 （浙江工业大学生物与环境工程学院 杭州

2、 310014）摘要：以编号为ZG346的酿酒酵母为出发菌株，通过紫外线和60Co射线诱变处理，运用推理育种技术，选育到一株抗氯化锌和乙硫氨酸的突变株0.5Eth400-5。该菌株经摇瓶发酵谷胱甘肽产量为166.0mg/l，较出发株提高350.0%，每克干细胞含谷胱甘肽19.8mg，较出发株提高318.6%。菌株经10次传代培养，谷胱甘肽产量下降10.7%，是一株性状较稳定可深入开发研究的优良菌株。在此基础上应用Plackett-Burman实验设计和响应面分析方法对菌体积累谷胱甘肽的培养条件进行了系统研究和优化，得到了1组优化的培养基。采用此优化培养基，谷胱甘肽产量达235.7mg/l，比优

3、化前提高45.4%。在优化的培养条件下进行5L发酵罐试验，谷胱甘肽产量达638.9mg/l。关键词：谷胱甘肽，酿酒酵母，菌种选育，优化BREEDING OF A GLUTATHIONE OVERPRODUCING STRAIN AND ITS CULTURE CONDITIONSJia Jian-Ping (College of Biology and Environment Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014)Abstract: A zinc chloride- and ethionine- resi

4、stant mutant 0.5Eth400-5 was obtained from its parent strain Saccharomyces cerevisiae ZG346 by UV and 60Co-ray treatment and rational screening. The glutathione productivity of the mutant reached 166.0mg/l by flask culture, which was 350.0% higher than that of the parent strain, and the glutathione

5、content in the dried cells reached 19.8mg/g, which was 318.6% higher than that of the parent strain. A descend of only 10.7% in the glutathione yield of the mutant was observed after ten times of subculture. Therefore, the obtained mutant is a relatively stable strain that is worthy to be studied fu

6、rther. Systematic studies were carried out on the optimization of compositions of medium for accumulating the largest amount of glutathione in the strain. This optimizing medium was formulated vas Plackett-Burman design and response surface analysis (RSA). The glutathione yield was 235.7mg/l under t

7、he optimum condition,which was 45.4% higher than that of non-optimized medium. The glutathione yield was 638.9mg/l under the optimum condition by 5L fermenter culture. Key words: Glutathione, Saccharomyces cerevisiae , Strain breeding, Optimization谷胱甘肽（Glutathione,简称GSH）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的活性三肽。它广泛

8、存在于动植物和微生物细胞中，是最主要的非蛋白巯基化合物，具有重要的生理功能。它可作为某些酶的辅酶，并对一些巯基酶有激活作用，是保护酶和其它蛋白质巯基的一种抗氧化剂，并且在氨基酸转运、维持红细胞膜的完整性、保护血红蛋白及解除毒物等方面具有重要的作用1。在临床上，谷胱甘肽是一种治疗肝脏疾病、肿瘤、中毒、白内障、衰老及变态反应的重要生化药物。近年来，随着谷胱甘肽更多的生理功能被发现，它在食品添加剂、临床医学和运动营养学上倍受关注，需求量不断增加。自谷胱甘肽首先由Hopkin2从酵母中提取出来以后，人们对它进行了广泛深入的研究。目前获得高纯度谷胱甘肽比较成熟的方法主要有溶剂萃取法和化学合成法。但这两种

9、方法存在着工艺繁琐、成本高、易造成污染等问题。因此，具有反应条件温和、成本低、反应步骤简单等优点的发酵法将是今后生产谷胱甘肽最有前景的方法，获得性能优良的高产菌株是发酵法生产谷胱甘肽的关键。目前已报道3，4，5能较多地积累谷胱甘肽的菌株主要有酵母和大多数革兰氏阴性菌，采用的菌种选育方法主要是传统的化学诱变法（亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等）和物理诱变法（紫外线和X射线）相结合，得到的突变株以1，2，4三唑和叠氮化钠抗性株、乙硫氨酸抗性株、甲硫氨酸敏感株、丙酮酸抗性株、二硫化四甲基秋蓝姆抗性株为主。但是利用射线对谷胱甘肽产生菌株进行诱变，同时获得氯化锌抗性标记的高产菌在国内尚未见报道。国内

10、对菌体积累谷胱甘肽的培养条件报道往往是采用单因素多水平的优化，未考虑碳源、氮源、无机离子等多因素之间的协同作用6。作者从实验室收集和保藏的200余株酵母中筛选到了一株具有一定谷胱甘肽生产能力的酿酒酵母，通过进一步紫外线和射线诱变，得到了抗氯化锌和乙硫氨酸的谷胱甘肽高产菌，同时应用Plackett-Burman实验设计和响应面分析方法对谷胱甘肽高产菌的培养条件进行了系统优化。本文报道该菌种的筛选与选育及培养条件的优化，拟为工业化应用奠定基础。1 材料与方法1.1 菌种来源酿酒酵母（S. cerevisiae），浙江工业大学微生物实验室收集和保藏。1.2 培养基及培养条件1.2.1 斜面培养基（完

11、全培养基）及培养条件：培养基：酵母膏3.0g，麦芽汁3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，琼脂20.0g，定容至1L水中，pH自然，1.0105Pa灭菌20min。培养条件：28，培养12d。1.2.2 平板选择培养基及培养条件：（1）ZnCl2选择培养基：斜面培养基+1360.0mg/l ZnCl2，pH自然，灭菌20min；（2）乙硫氨酸选择培养基：斜面培养基+600.0mg/l乙硫氨酸，pH自然，1.0105Pa灭菌20min。28，培养57d。1.2.3 种子培养基及培养条件：酵母膏3.0g，麦芽汁3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，定容至1L水中，pH自然，250mL三

12、角瓶装30mL培养基，1.0105Pa灭菌20min。28，摇床转速为200r/min，培养22h23h。 1.2.4 发酵培养基及培养条件：葡萄糖1.95%，糖蜜 1.95%，蛋白胨3.0%，CysHCl 9.810-2%，MgSO47H2O 0.5% ，甲硫氨酸4.810-2%，生物素24.0g，肌醇75.0mg，酵母膏0.5g，麦芽汁30mL，NH4H2PO4 5.510-1g，VB1 0.8mg，(NH4)2SO4 12.4g，K2HPO4 3.0g，FeSO4 3.010-3 g，ZnSO4 3.010-3 g，CuSO4 0.510-3 g，定容至1L水中，pH 5.0，250mL

13、三角瓶装30mL培养基，0.7105Pa灭菌30min。接种量为10%，28，摇床转速为200r/min，培养3d。1.3 诱变处理1.3.1 紫外线处理：取培养12d的新鲜斜面，用无菌生理盐水洗下菌体制成菌悬液，经玻璃珠振荡打散和脱脂棉过滤后得单细胞悬浮液，调整菌悬液菌数108个/mL左右，取3m L菌悬液至无菌的小平皿中，在15W紫外灯（距离30cm）照射下，磁力搅拌30S，菌悬液在无菌室红灯下适当稀释后涂平板，平板倒置于28恒温培养箱中培养57d。1.3.2 60Co射线辐照处理：采用培养好的新鲜试管斜面直接进行辐照。分别以0.5KGy、2.0 KGy剂量对试管中菌体进行60Co射线辐照

14、，用无菌生理盐水将经辐照处理后的斜面制成菌悬液，并经适当稀释后涂平板，平板倒置于28恒温箱中培养57d。 1.4 菌种诱变程序出发株紫外线辐照自然分离60Co射线辐照谷胱甘肽高产菌。1.5 分析方法1.5.1 胞内谷胱甘肽含量测定：ALLOXAN试剂衍生法，见文献7。1.5.2 生物量测定：取10mL发酵液，于4500r/min离心4min，收集菌体，经蒸馏水洗涤菌体两次，弃去上清液，湿菌体经105烘干至恒重后称重。2 结果2.1诱变出发株的确定经对本实验室收集和保藏的200余株酵母进行摇瓶初筛和复筛，其中ZG346号酿酒酵母谷胱甘肽产量和谷胱甘肽含量最高，其谷胱甘肽产量为36.9mg/l，谷

15、胱甘肽含量为4.7mg/克干细胞，确定以ZG346菌株作为诱变育种的出发菌株。 2.2 筛选平板中ZnCl2浓度的选择Zn2+是多种脱氢酶、脱羧酶和肽酶的辅因子8，是酵母生长所需的微量元素。在低浓度时有促进酵母生长的作用9，但高浓度的Zn2+对酵母有杀菌和抑菌作用。ZnCl2浓度与致死率的关系如图1所示，由图可见，培养基中ZnCl2的浓度与实验菌株的致死率之间存在着明显的剂量效应关系，随着ZnCl2浓度的提高，致死率逐渐提高。当ZnCl2浓度为680mg/l时致死率为80%，ZnCl2浓度超过2040mg/l时致死率100%，本文选取致死率为93.5%的ZnCl2浓度1360mg/l作为选择性

16、平板所用剂量。图1 ZnCl2浓度与致死率的关系Fig.1 The relationship between concentration of Zinc chloride and lethality2.3 诱变处理2.3.1紫外线诱变处理 对ZG346菌株采用紫外线诱变处理，将诱变处理后的菌悬液涂布于完全培养基和 ZnCl2选择培养基上，培养后从平板上挑选生长快、菌落大的单菌落各20个接种斜面，将各突变株与出发株分别接种至种子培养基和发酵培养基，发酵结束后测定生物量和谷胱甘肽产量，突变株的平均产量、最高产量、正变率及致死率结果见表1，随机挑选的部分突变株的摇瓶发酵结果见表2。表1 紫外诱变及其

17、ZnCl2处理对菌种GSH积累的影响Table1 The effect of UV and zinc chloride on glutathione accumulationStrainsGSH content (mg GSH/g dried cell)GSH yield(mg/l)Postive Mutant rate（%）Lethality（%）AverageMaximumAverageMaximumNo.346 UV resistant mutantUV-and Zinc chloride-mutant4.76.07.14.79.611.436.945.153.436.978.192.2

18、52.363.878.692.5表2 部分突变株摇瓶发酵结果Table2 The flask culture result of any strainsStrains Biomass（g/L）GSH yield（mg/l）GSH yieldIncrease rate（%）GSH content(mg GSH/g dried cell)GSH contentIncrease rate /(%)346UVZn10-3UVZn10-5UVZn10-11UVZn10-17UVZn10-22UVZn10-25UVZn10-297.88.111.97.49.38.26.07.436.992.236.061

19、.944.844.056.367.9150.0-2.566.321.319.252.784.24.711.43.08.44.85.49.49.2141.1-36.077.31.922.498.994.5表1结果可见，抗紫外线和ZnCl2的双抗突变株的谷胱甘肽平均含量、平均产量均高于出发株和抗紫外线单抗突变株，同时其正变率亦高于抗紫外线突变株，这表明应用ZnCl2作高产突变株的筛选剂筛选效果明显好于传统的随机筛选。由表2可见：（1）抗紫外线和ZnCl2突变株UVZn10-3谷胱甘肽含量和产量最高，每克干细胞内谷胱甘肽含量达11.4mg，较出发株提高141.1%，谷胱甘肽产量为92.2mg/l，较

20、出发株提高150.0%；（2）谷胱甘肽是胞内产物，一定的生物量是高产的前提。UVZn10-3菌株谷胱甘肽产量达92.2mg/l，其生物量只有8.2g/L，而UVZn10-5菌株生物量达11.9g/L，但谷胱甘肽产量只有36.0 mg/l，可见生物量与产量并不完全成正比。因此在菌种筛选时应选择谷胱甘肽含量高的突变株，再通过培养条件优化提高其生物量，从而达到提高产量的目的。为避免表型延迟现象引起的菌种不纯，进一步将紫外线、ZnCl2双抗突变株UVZn10-3进行自然分离，获得了谷胱甘肽产量比UVZn10-3菌株提高41.8%的纯化菌株H8。2.3.2 60Co射线诱变处理以H8为出发菌株，经剂量2

21、.0KGy、0.5KGy的60Co射线辐照处理后，将诱变后菌悬液涂布于完全培养基、氯化锌选择培养基、乙硫氨酸选择培养基上，挑选生长快、菌落大的单菌落各20个接种斜面，经摇瓶二级发酵后测定生物量和谷胱甘肽含量，结果如图2所示。 图2 60Co射线剂量和筛选平板对菌体积累GSH的影响Fig.2 The effect of 60Co-ray dosage and screening flat on glutathione accumulation Average GSH yield， Average GSH content， Maximum GSH yield， Maximum GSH conten

22、tA 0.5KGy60Co-ray irradiation, ethionine selective medium; B 2.0KGy60Co-ray irradiation, ethionine selective medium; C 0.5KGy60Co-ray irradiation, complete medium; D 2.0KGy60Co-ray irradiation, complete medium; E 0.5KGy60Co-ray irradiation, Zinc chloride selective medium; F 2.0KGy60Co-ray irradiatio

23、n, Zinc chloride selective medium由图2可见，在6组试验中，以0.5Kgy 射线辐照后涂布于乙硫氨酸平板上筛选出来的菌株结果最好，不光正变幅度大，正变幅度率也高。这是由于乙硫氨酸是谷胱甘肽的代谢类似物，抗乙硫氨酸突变株能有效解除菌体自身的反馈调节，因此，该筛选模式有利于选育正向突变株。经0.5Kgy 射线辐照后的突变株中，编号为0.5Eth400-5乙硫氨酸抗性突变株最优，该菌株谷胱甘肽产量为166.0mg/l，较原始菌株ZG346提高350.0%，每克干细胞内含谷胱甘肽19.8mg，较原始菌株ZG346提高318.6%。2.3.3 突变株稳定性考察用群体连续传

24、代及低温保藏定期传代的方法考察了0.5Eth400-5突变株高产基因的稳定性。如表3所示，菌株0.5Eth400-5斜面连续传10代，谷胱甘肽产量下降10.7%，生物量下降2.4%。同时将该菌株低温保藏于4冰箱中，每月传1代，共传4代，谷胱甘肽产量仅下降6.0%，说明该突变株具有良好的稳定性，但是对该菌株进行定期复壮也是很有必要的。表3 突变株稳定性考察结果Table3 The results of the stability of the mutantTimes of subcultureBiomass(g /L)BiomassDecrease rate (%)GSH yield(mg /L

25、)GSH yieldDecrease rate (%)0123456789108.48.48.38.38.38.38.38.38.28.28.20.01.21.21.21.21.21.22.42.42.4166.0163.5161.3160.0156.0152. 8151.4150.3149.0148.6148.21.52.83.66.08.08.89.510.210.510.7注：表中数据均取自三个平行实验的平均值2.4 培养条件的优化2.4.1种龄对菌体生长的影响图3为菌种种子培养的生长曲线。从图3可以看出种子培养到22h23h时，菌种处于对数生长的后期，所以合适的种龄为20h-22h。

26、图3 菌株0.5Eth400-5在种子培养基中的生长曲线Fig.3 The growth curve of strain 0.5Eth400-5 in the seed medium2.4.2碳源对菌体积累谷胱甘肽的影响改变发酵培养基中不同碳源，保持其他成分不变，在相同培养条件下摇瓶发酵，测定谷胱甘肽产量，结果见表4。从表4可以看出有机复合碳源产谷胱甘肽的能力好于单一碳源，其中以1.5%糖蜜和1.5%葡萄糖复合的碳源最有利于菌体积累谷胱甘肽，此时谷胱甘肽产量为172.2mg/l，比单一葡萄糖高35.5%，比单一糖蜜高19.4%。表4 碳源对菌体积累谷胱甘肽的影响Table 4 Effect o

27、f carbon sources on glutathione accumulationCarbon sourcesGSH yield (mg/l)CategoryConcentration(%)molassesmolasses +glucosesaccharoseglucoseglucose+ saccharose3.01.5+1.53.03.01.8+1.2144.2172.2159.7127.1163.2注：表中数据均取自三个平行实验的平均值2.4.3 氮源对菌体积累谷胱甘肽的影响为了研究氮源对菌体积累谷胱甘肽的影响，分别选取了几种常用的无机和有机氮源进行研究，结果见表5。由表可见，有机

28、氮源蛋白胨产谷胱甘肽的能力明显好于无机氮源，以蛋白胨为氮源，谷胱甘肽产量达161.1mg/l，比(NH4)2SO4高10倍，比(NH4)2HPO4高2倍，比尿素高4.7倍。表5氮源对菌体积累谷胱甘肽的影响Table 5 effect of nitrogen sources on glutathione accumulationNitrogen sourcesGSH yield (mg/l)CategoryConcentration(%)Peptone(NH4)2SO4NH4Cl(NH4)2HPO4urea3.03.53.03.52.0161.114.60.053.728.2 注：表中数据均取自

29、三个平行实验的平均值2.4.4培养基的初始pH对菌体积累谷胱甘肽的影响将发酵培养基用1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液调成不同pH，分别对培养基pH4.5到pH7.0每隔0.5个单位进行初始pH对谷胱甘肽积累的影响试验。结果（图4）表明，菌株积累谷胱甘肽的能力以酸性条件下为宜，在pH5.0条件下谷胱甘肽含量最高，含量达163.5mg/l。图4 培养基的初始pH对菌体积累谷胱甘肽的影响Fig.4 Effect of initial pH on glutathione accumulation图5 培养温度对菌体积累谷胱甘肽的影响Fig.5 Effect of temperature

30、 on glutathione accumulation2.4.5培养温度对菌体积累谷胱甘肽的影响将发酵培养基pH值均调至5.0，分别从24到32每隔2进行了培养温度对谷胱甘肽积累的影响试验，试验结果如图5所示，在26-28之间，温度波动对菌体积累谷胱甘肽的影响小于5%，以28为该菌体积累谷胱甘肽的最适培养温度，谷胱甘肽含量为163.35mg/l，当温度超过30时谷胱甘肽含量明显下降，这可能与谷胱甘肽易在高温下被氧化的性质有关. 2.4.6接种量对菌体积累谷胱甘肽的影响将新鲜培养20h-22h的种子液分别以6%，10%，14%，18%接种量接种于初始pH值为5.0的发酵培养基中，于28培养72h后测定谷胱甘肽的含量，结果表明（如图6所示），以10%的接种量最佳。图6 接种量对菌体积累谷胱甘肽的影响Fig.6 Effect of inoculum size on glutathione accumulation2.4.7溶氧对菌体积累谷胱甘肽的影响 酵母产谷胱甘肽是一个需能耗氧过程，所以有必要考察通气量对菌体积累谷胱甘肽的影响。在250 mL三角瓶中分别装入20mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL的发酵培养基，在其他条件一致的情况下进行发酵试验，结果如图7所示，菌体积累谷胱甘肽适宜的装量为250m