16S信息分析报告2.docx

1、16S信息分析报告216srDNA 信息分析1.标准信息分析（初级）基本数据处理（使用内部撰写的程序对原始的测序数据进行基本处理）通过Illumina平台（ Miseq ）进行Paired-end 测序，下机数据经过去除低质量reads(Q20, 90%标准过滤 )，并 trim 掉 reads2 尾部 100bp 低质量序列；每个样品数据产出详细统计结果见下表：表 1-1 reads 数据统计：# Samples# HQ reads (total)# HQ reads (mean SD)CA17110,6516,509 2,175HC19163,6908,615 3,081LK13127,4

2、169,801 2,858Total49401,7578,199 2,992注：原来的样本中CA15 由于原始 Reads 数太少（只有23 条）而被删除，因此目前的样本总数为49 个去除 barcode 序列，引物序列及 tags 过滤通过 COPE软件（ Connecting Overlapped Pair-End，），利用重叠关系将双末端测序得到的成对 reads 组装成一条序列。利用内部编写程序去除两端 barcode 序列，引物序列。Paired End Reads 通过reads之间的overlap（ 19个碱基）关系拼接成Tags；然后去掉barcode 序列，引物序列。为了得到

3、高质量的Tags，将拼接的Tags 按照长度过滤，去嵌合体等的处理。(这里等的意思就是按照拼接条件过滤:1,碱基的ASCII value值低于33 的过滤掉。取19 个碱基，这19 个碱基相互匹配率低于98%的过滤掉。3.去掉引物序列的时候，允许一个错配，错配多于一个的过滤掉。)表 1-2 tags 的详细信息Sample IDRaw Tag NumFinal Tag numHC11756017,319HC296729,604HC31805317,826HC41218112,107HC51155811,477HC81148811,404HC91635416,095HC102158421,270

4、HC1179897926HC121156111,449HC132490924,660HC142297922,736HC152074720,549HC161485714,728HC172117121,002HC181070010,605HC191135911,247CA81620316,040CA101092510,560CA1182547,690CA1294799,053CA1479477,584CA1682218,093CA171066610,479CA181078710,651CA51634416,154CA960475,861CA131029010,1652高级信息分析OUT 及其丰度分

5、析OUT 统计拼接的 Tags经过优化后，在相似度下利用 qiime（）软件将其聚类为用于物种分类的 OTU(Operational Taxonomic Units)，统计各个样品每个 OTU 中的丰度信息， OTU 的丰度初步说明了样品的物种丰富程度。 49 个样品共产生 3029 个 OTU，其中 Singletons OTU （即丰度为 1 的 OTU）个数为 0，Non singletons OTU 个数为 3029 。表 4.样品 OUT 统计SampleNameOTUsTagsHC154117,319HC22699,604HC353017,826HC421512,107HC5206

6、11,477HC821411,404HC945516,095HC1060021,270HC1226211,449HC1329424,660CA1045310,560CA117107,690CA126509,053CA145197,584CA162408,093CA1733010,479CA1828910,651CA533616,154CA93475,861HC111427,926CA1326910,165表 5OTU 统计IndexOTU numNo. of OTUs3029Assigned to families1,708Assigned to genera1,172Assigned to

7、species314No. of OTUs per sample368 147Min no. of OTUs per sample127Max no. of OTUs per sample719OTU分布的韦恩图如下：在的相似度下，得到了每个样品的 OTU 个数，利用 R（）画图软件绘出 Venn 图可以展示多样品共有和各自特有 OTU 数目，直观展示样品间 OTU 的重叠情况。 结合 OTU 所代表的物种，可以找出不同环境中的核心微生物。图 2-1 OTU venn 分析。不同颜色图形代表不同样品或者不同组别， 不同颜色图形之间交叠部分数字为两个样品或两个组别之间共有的 OTU 个数。同理，

8、多个颜色图形之间交叠部分数字为多个样品或组别之间共有OTU 个数。 Venn 图容许 2-5 个样品或组别。OUT 水平的 PCA图如下： R（）画图软件PCA 分析 (Principal Component Analysis) ，即主成分分析，是一种分析和简化数据集的技术。主成分分析经常用于减少数据集的维数，同时保持数据集中的对方差贡献最大的特征。这是通过保留低阶主成分， 忽略高阶主成分做到的。 这样低阶成分往往能够保留住数据的最重要方面。通过分析不同样品 OTU（97%相似性）组成可以反映样品的差异和距离， PCA 运用方差分解， 将多组数据的差异反映在二维坐标图上， 坐标轴取能够最大反映

9、方差值两个特征值。 如果两个样品距离越近， 则表示这两个样品的组成越相似。 不同处理或不同环境间的样品可能表现出分散和聚集的分布情况，从而可以判断相同条件的样品组成是否具有相似性。图 2-2 基于 OTU 丰度的 PCA分析。 横坐标表示第一主成分，括号中的百分比则表示第一主成分对样品差异的贡献值；纵坐标表示第二主成分，括号中的百分比表示第二主成分对样品差异的贡献值。图中点分别表示各个样品。不同颜色代表样品属于不同的分组。2 .2 Core microbiome 分析图表都是通过 qiime （）软件得到的共有 OTU 数与样本数的关系：图 2-3 覆盖所有样本的微生物组。 横坐标表示样品占的

10、比率，纵坐标表示包含 OUT 的数目。这些样本的 core microbiome （即覆盖所有样本的微生物组）共包含 17 个 OTUs，其物种分类信息如下表 2-1。表 2-1 覆盖所有样本的 OTUsOTUTaxonomy levelTaxonomy name400850GenusStreptococcus437590GenusCapnocytophaga368428Speciesdispar645710GenusCampylobacter417699GenusFusobacterium395972GenusStreptococcus381841GenusStreptococcus1407

11、02GenusPeptostreptococcus413823GenusGranulicatella645697GenusCampylobacter414306GenusNeisseria260777GenusFusobacterium2008GenusNeisseria21908GenusNeisseria645708GenusCampylobacter414422FamilyGemellaceae1212 Genus Granulicatella生物多样性分析单个样品复杂性分析通过计算Shannon index, Chao1 index, Phylogenetic diversity (P

12、D, whole tree)和observednumber of species共四个指数来进行生物多样性分析。通过qiime （）软件计算样品的Alpha多样性值并用 R（）软件做出相应的稀释曲线，盒型图。稀释曲线是利用已测得 16S rDNA 序列中已知的各种 OTU 的相对比例， 来计算抽取 n 个（n 小于测得 Reads 序列总数） Tags 时各 Alpha 指数的期望值，然后根据一组 n 值（一般为一组小于总序列数的等差数列）与其相对应的 Alpha 指数的期望值绘制曲线。如样品有提供分组信息，且每组样品个数不小于差异分析。差异分析的检验方法为秩和检验，如果组数为3，将对组间的

13、Alpha 多样性指数进行2，采用两样品比较的 WilcoxonRank-Sum Test（ R 中的）；如果组数大于2，采用多样品比较的Kruskal-Wallis Test（ R 中的） 。最后利用Alpha多样性指数绘制盒形图。差异分析与作图均通过R 软件（）进行。基于 OTU 的结果， 我们计算了样品的 Alpha 多样性 （表 2-2）。Alpha 多样性是对单个样品中物种多样性的分析。 chao1 多样性估算指数是根据所测得的 tags 数和 OTU 的数量以及相对比例来表 2-2 样品的 Alpha 多样性预#Alphamean(CA)mean(HC)mean(LK)p-vaul

14、e(CA-Hp-vaule(HC-LKPvalue(KW)p-vaule(CA-LK)测C)chao1样observed_species品16.13.15.PD_whole_tree中2.shannon微生物的种类（Rarefaction 分析（样本不分组） ：图 2-4 单个样品内的 Alpha 多样性Rarefaction 分析（样本分组） ：图 2-5 每组样品内的 Alpha 多样性。 图中红色 ,黄色 ,蓝色线分别表示 CA, HC, LK组的 rarefaction 分析结果图 2-6 为组 Alpha 多样性盒形图 ，更直观显示组间 Alpha 多样性差异。 盒形图可以显示 5

15、个统计量（最小值，第一个四分位数，中位数，第三个中位数和最大值，及由下到上的 5 条线），异常值以“ o”标出。Alpha 多样性的比较，以 Shannon index 为例可以看出多样性 CALKHC，其中 CA/HC 有明显差异 (P=, Student s t test)，而 CA/LK, HC/LK差异不显著样品间复杂度比较分析Beta 多样性（ Beta diversity ）分析是用来比较一对样品在物种多样性方面存在的差异大小。本分析中通过 QIIME（）软件，采用迭代算法，分别在加权物种分类丰度信息和不加权物种分类丰度信息的情况下， 随机抽取各样品中 75% Reads单独进行差

16、异计算，迭代 100 次之后综合统计得到最终的统计分析结果表及PCoA 展示图。Beta 多样性热图使用 R（）软件中的 NMF 包的 aheatmap 进行作图。UniFrac 是通过利用系统进化的信息来比较样品间的物种群落差异。 其计算结果可以作为一种衡量 beta diversity 的指数， 它考虑了物种间的进化距离， 该指数越大表示样品间的差异越大。报告中给出的 UniFrac 结果分为加权 UniFrac（ weighted UniFrac）与非加权 UniFirac（unweighted UniFrac ） 2 种，其中 weighted UniFrac 考虑了序列的丰度， un

17、weighted UniFrac不考虑序列丰度。从下面盒形图看， CA组内的物种丰度最大。Weighted Unifrac Unweighted Unifrac图 2-7 Beta 多样性的盒形图Unifrac 距离的主坐标分析 (PCoA)如下：Weighted Unifrac Unweighted Unifrac图 2-8 Beta 多样性的主坐标分析 (PCoA)图 。 如果两个样品距离越近，则表示这两个样品的组成越相似。不同处理或不同环境间的样品可能表现出分散和聚集的分布情况，从而可以判断相同条件的样品组成是否具有相似性。图 2-9 UniFrac 距离分布heatmap 。通过对Un

18、iFrac 结果的聚类，具有相似beta 多样性的样品聚类在一起，反应了样品间的相似性。物种组成分析本分析中分组后各水平的分类比较柱形图是用 QIIME（）软件得到的，单个样品的群落分布柱形图和盒型图是根据 QIIME（）软件计算的结果用 R（）软件画的。样品的群落分布图，直观的反应各样品的群落组成。从门水平的群落分布图中可以看出，在这批样品中，占主要地位的门有 Firmicutes ，Proteobacteria。门(phylum)水平比较图 2-10 分组后门水平的分类比较 。从左至右分别为 CA,HC,LK的物种组成。图 2-11 样品的门水平群落分布图纲(class)水平比较图 2-1

19、2 分组后纲水平的分类比较。 从左至右分别为 CA,HC,LK的物种组成。图 2-13 样品的纲水平群落分布图属(genus)水平比较图 2-14 样品的属水平群落分布图含量最高的 25 个属的物种组成如下：可以看出，这些样本中含量最高的属为 Streptococcus, Neisseria, Neisseriaceae (family),Campylobacter, Bacillus, Gemellaceae, TM7-3多组样本的比较分析下面的表格都是通过 QIIME（）软件计算出的，热图是用 R（）软件画的。OTU水平的比较分析下表是在不同组样本间有显著差异的 OTUs（ P, Krus

20、kal-Wallis test），共 35 个OTUP valueCA_mean HC_mean LK_meanLineage1082539s_Streptococcus_infantis1034052s_Streptococcus_infantiss_Streptococcus_infantiss_Streptococcus_infantis561537s_Selenomonas_noxia2714267s_Prevotella_tannerae968675s_Haemophiluspara_influenzae168817s_Capnocytophaga_ochraceas_Campylo

21、bacter_rectuss_Actinobacillus_porcinus0o_Lactobacillaleso_Gemellales931950g_Streptococcus4320317g_Streptococcus4416763g_Streptococcus269907g_Prevotella324532g_Leptotrichia43057910g_Cardiobacterium4294954g_Capnocytophaga1010329g_Capnocytophaga10986550g_BacillusOTU19g_Abiotrophia4321136f_Streptococcac

22、eaef_StreptococcaceaeOTU2f_Pasteurellaceaef_Neisseriaceaef_Neisseriaceae1101669f_Gemellaceaef_Clostridiaceae851704f_Clostridiaceae1090059f_Carnobacteriaceae949789f_Carnobacteriaceae1065974f_CarnobacteriaceaeOTU100c_Bacillip_Firmicutes属水平的比较分析首先， PCA分析能够看出3 组样本之间有一定程度的差异：其次，通过 Kruskal-Wallis test 分析可

23、以找出在不同组间有明显差异(P的属如下（共19 个属或科）：CA_meanHC_meanLK_meanP valueg_Streptococcusg_Campylobacterg_Bacillus0f_Gemellaceaef_Carnobacteriaceaeg_Haemophilusg_Lautropiag_Abiotrophiag_Actinobacilluso_Bacteroidaleso_Lactobacillalesg_Enterococcus0f_Pasteurellaceaeg_Cardiobacteriump_Proteobacteriag_Stenotrophomonas0

24、g_Moraxella00g_Yersinia00f_Bacillaceae0为了直观，这些属比较的热图如下：可以看出，在 CA 组富集的属为 Campylobacter, Bacteroidales, Lactobacillales, Pasteurellaceae,Moraxella 等；在 HC 组富集的属为 Streptococcus, Gemellaceae, Lautropia, Abiotrophia ；在 LK 组富集的属为 Bacillus, Carnobacteriaceae, Haemophilus, Actinobacillus, Enterococcus, Cardiobacterium, Stenotrophomonas, Yersinia 等