细胞培养试题.docx

1、细胞培养试题细胞培养填空题1什么是无血清培养基？与普通培养基有什么区别？参考答案： 无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。添加组分可能包括纤连蛋白、层粘连蛋白等贴壁因子、胰岛素、转铁蛋白、硒等。 填空题2谷氨酰胺溶液和碳酸氢钠的配制方法是什么？参考答案： 以0.2mol/L的L-谷氨酰胺配制为例：称取L-谷氨酰胺2.92g，加注射用水100ml，充分搅拌混匀。用0.2m滤膜正压过滤除菌。溶液应在4下避光保存，2周内使用。以7.5

2、%NaHCO3的配制为例：称取NaHCO37.5g溶于100ml蒸馏水中过滤除菌。 填空题3什么是个性化培养基？它有什么优点？参考答案：根据细胞类型、培养方式和生产工艺等特点所定制的培养基，即个性化培养基。个性化培养基在国外生物制药企业被普遍采用，个性化培养基可以为细胞生长提供充足的营养物质，能提高细胞的生长速率、培养密度、以及延长细胞维持时间；也可以为细胞生长提供均衡的营养供给，减少细胞有害代谢物质的积累，降低对细胞生长的危害；同时对贴壁细胞而言，能增加细胞的贴壁性，并降低培养过程中剪切力对细胞的损伤；个性化培养基可以根据各户的特殊需求减少或不使用动物源成分，从而使生物制品安全性更有保障。填

3、空题4碳酸氢钠在室温条件存放是否稳定？参考答案：碳酸氢钠白色粉末，或不透明单斜晶系细微结晶。比重2.159。无臭、味咸，可溶于水，微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微碱性，受热易分解，在65以上迅速分解，在270时完全失去二氧化碳，在干燥空气中无变化，在潮湿空气中缓慢分解。填空题5GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？参考答案：GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽，是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，Glut

4、aMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。填空题6购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？参考答案：研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。但对于DMSO敏感的细胞，还是复苏细胞时，用离心去除DMSO比较好。填空题7培养细胞时应使用5%还是10%CO2，或者根本没有影响？参考答案： 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的

5、CO2浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g 时，则应使用5%CO2培养细胞。 填空题8如何消除组织培养的污染？参考答案： 当重要的培养细胞污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染

6、的实验步骤。1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0mg/ml。3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23代。5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6）重复步骤4。7）在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被消除。 填空题9为什么要在溶解的一周内使用贮存在4冰箱中的液体胰蛋白

7、酶溶液?参考答案：胰蛋白酶在4就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。填空题10细胞株参考答案：通过选择法或克隆法形成法从原代培养物或细胞系中获得特殊性质或标志，并保持这些特性的培养物。填空题11简述细胞计数步骤。参考答案： 1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml4大格细胞总数/410000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散

8、不好，需重新制备细胞悬液。 填空题12简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程。参考答案： 通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段：原代培养期：也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。.传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。一般情况下，正常体细胞在传代10-5

9、0次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。衰退期：处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。以上特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。每代贴附生长细胞的生长过程：游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6

10、24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度限制 填空题13细胞培养中血清的主要作用是什么？参考答案： （1）提供基本营养物质；（2）提供贴壁和扩展因子（3）提供激素及各种生长因子；（4）提供结合蛋白（5）对培养中的细胞提供某些保护作用 填空题14简述消毒灭菌的常用方法、要求条件及主要应用范围。参考答案： 物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿。消毒时间：30min（至少）；紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由产生的臭氧来完成。紫外灭菌以后，最好

11、过一个小时再进去。过滤：0.22m（适用于液体）湿热（高压蒸气灭菌法）15磅，121，20min各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：培养用液、橡胶制品 10磅10分钟布类、玻璃制品、金属器械等 15磅20分钟干烤：160，2小时（适用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打开箱门，以防冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。化学消毒灭菌法：75%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。12新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。细胞培养中最常用的抗生素是青霉素（常用浓度是100u/ml）与链霉素（100g/m

12、l）。不要在原代培养中加入抗生素。 填空题15收集细胞时一般常用的转速和时间是多少？参考答案：转速：1000r/min；时间：5min填空题16运送细胞的比较简便的方法是哪一种，简述其过程。参考答案： 一是用液氮或干冰保存运输，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦；二是充液法运输，比较简便。充液法运输操作如下：选生长状态良好的细胞，待达80%或90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部（过满易污染），保留少许空间，塞紧瓶塞，空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落；妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影

13、响；到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置37培养，次日传代。 填空题17简述台盼蓝排除检测法原理参考答案： 原理：由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。最常用的为“台盼蓝排除检测法”活体染色与细胞计数：将1滴细胞悬液（贴壁细胞可经0.25胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液）与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。注意事项：台盼蓝染细胞时，时间

14、不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰实验结果。 填空题18细胞汇合(Confluent)参考答案：指细胞增殖生长相互连接成片占据所有底物面积现象。填空题19细胞富集参考答案： 当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。 填空题20消化液参考答案：在原代细胞培养和细胞传代时，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA），其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。填空题21全能干细胞参考答案：如ES细胞。全能干细胞可

15、以分化成人体的各种细胞，这些细胞构成人体的各种组织和器官。更多内容请访问睦霖题库微信公众号填空题22试述细胞培养的基本概念、原理、优缺点及实际意义。参考答案： 1）概念：细胞（组织）培养是指从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。2）原理及优缺点：细胞培养是将确定所选组织用剪碎的小组织块或分离的单个细胞进行培养，这种培养失去了原有组织类型及某些生化特征，但它们可以增殖，特性化，获得遗传背景相同的群体，可以保存。3）实际意义：组织（细胞）培养对医学、生命科学的意义培养的组织器官或细胞，能再一定范围和程度上反映生命活动

16、规律和机体功能特点。培养的细胞为生命科学和生物医学各种研究奠定了物质基础。如药物筛选，疗剂评价，新生物制品研发，研究病毒及其他微生物，发现新的传染因子，组织工程中的支撑技术等。细胞培养技术已经成为商品化生物技术产品的核心。如目前可提供的产品，病毒疫苗：口蹄疫、狂犬疫苗和乙肝疫苗等；非抗体型免疫调节剂：干扰素、白介素和集落刺激因子等；多肽生长因子：表皮生长因子和神经生长因子等；酶类：组织型纤溶酶原激活剂；激素：EPO和促黄体生成素等；杀虫剂：杆状病毒；肿瘤特异抗原；癌胚抗原；通过杂交瘤生产的各种单克隆抗体；细胞本身（如干细胞）；皮肤重植等。4）组织（细胞）培养的局限性：细胞（组织）培养，包括器官

17、培养终归是离体培养，缺少生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医学生物实验过程及对结果的评估都必须考虑这些。 填空题23简述体外培养用液的种类及用途。参考答案：主要包括：培养液（维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养时最重要的条件。）、缓冲液（中和培养液中的酸性物质）、平衡盐溶液（配抗生素、消化液、洗涤细胞等）、消化液（分离细胞）、血清、pH调整液和抗生素等其它常用液。填空题24与胚胎干细胞相比较，成体干细胞有哪几个特点？参考答案： （1）成体干细胞体积小，细胞器稀少，RNA含量较低，在增殖过程中处于相对静止状态，在组织结构中位置相对固定。（2）成体干细胞数量很少，其基本功能是

18、参与组织更新，创伤修复及维持机体内环境稳定。（3）成体干细胞常处于一个有干细胞细胞基质、对干细胞的增殖和分化起调控作用的各种信号分子的特定微环境或称生物位中，干细胞是自我复制还是分化为功能细胞，取决于所在的微环境和自身的功能状态。（4）成体干细胞没有确定的来源。 填空题25简述干细胞研究的主要内容与问题。参考答案： 1.主要内容1）干细胞的分离与鉴定2）干细胞的自我更新3）干细胞的定向分化4）干细胞的临床应用2.问题1）胚胎干细胞建系及定向诱导成组织细胞的分子机制；2）成体干细胞横向分化的条件；3）各种组织的成体干细胞库的建立及临床治疗试验；4）细胞移植的免疫排斥问题。 填空题26简述原代培养

19、、传代培养、二倍体细胞、克隆细胞株的概念。参考答案： 原代细胞：直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。传代细胞：初代培养细胞从第一次传代培养后具有增殖能力的细胞群。二倍体细胞：细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同的细胞群。克隆细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单个细胞增殖形成的细胞群。 填空题27简答基因转导的目的和用途，并列举细胞内基因转导的常用方法。参考答案： 将外源性基因（或基因组DNA）导入细胞的技术称为基因转导。目的：使外源基因能整合入受体细胞基因组中。用途：研究基因表达、结构和功能。培养细胞是最适宜的对象。

20、基因转导，尤其对于检测癌基因，更为常用。常用方法：染色体转导、细胞融合技术、磷酸钙法、电击法、脂质体法、显微注入法、逆转录病毒介导法、转基因技术（生殖细胞）等（1）染色体转导细胞融合技术染色体转导（2）基因转导基因转染：磷酸钙法、电击法、脂质体法、显微注入法、逆转录病毒介导法等转基因技术（生殖细胞） 填空题28简述软琼脂法细胞克隆形成实验的步骤及应用。参考答案： （1）用蒸馏水分别制备出1.2和0.7两个浓度的低溶点琼脂糖，高压灭菌后，维持在40中不会凝固。（2）取对数生长期细胞，0.25胰酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作做细胞计数，用20胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1106细胞

21、/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。（3）按1：1比例使1.2的琼脂糖和2DMEM培养基混合后，取3ml混合液注入直径6cm平皿中（10cm平皿中加710ml），冷却凝固，可作底层琼脂，置CO2温箱中备用。（4）按1：1比例让0.7的琼脂糖和2DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2ml的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2的琼脂糖底层平皿中，逐渐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37、5CO2温箱中培养1014天。（5）把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。应用：常用于检测肿瘤细胞和转化细胞系 填空题29简述MTT试验原理、试验步骤及应用。参考答案： 试验原理

22、：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色甲攒颗粒（formazan），并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值试验步骤：（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD（5

23、70nm），记录结果。（5）绘制曲线：以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制生长曲线。应用：MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等 填空题30常用哪些方法检测培养细胞的核酸及蛋白质？参考答案： （1）DNA检测方法：聚合酶链反应（PCR）、Southern Blot、基因长度多态性（RFLP）检测；（2）RNA检测方法：RT-PCR、Northern Blot；（3）蛋白质检测方法：细胞内蛋白质含量的测定、Western Blot、ELISA、荧光抗体法、组化法 填空题31常用培养细胞的生物学活性检测方法有哪些？参考答案： （1）细胞计数（2）细胞活性的检查

24、（3）细胞生长曲线（4）细胞克隆形成试验（5）软琼脂集落形成试验 填空题32简述贴壁细胞传代培养法的过程。参考答案： （1）弃去培养瓶中的培养液（2）加入1-2ml0.25的胰蛋白酶液（以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。（3）吸去胰蛋白酶液，加入培养液。（4）用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。（5）吸取1/31/4细胞悬液，接种于新的培养瓶内。（6）加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。（7）将后者放入培养箱中培养。 填空题33干细胞有何特性，如何分类？参考答案： 特性：具有自我更新能力有无限增殖潜能可分化成特定组织细分类：按分化能

25、力，分全能、多能、专能性干细胞。全能性干细胞，又称胚胎干细胞，如受精卵。多能性干细胞，又称为成体干细胞，如囊胚中的内囊细胞。专能干细胞，如造血干细胞 填空题34细胞培养的基本方法有哪几种？参考答案： （1）初代细胞培养：贴壁细胞初代培养、组织块培养法、悬浮细胞的初代培养；（2）传代细胞培养：悬浮生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代、贴壁生长细胞传代；（3）球体细胞培养；（4）悬浮细胞培养：成批培养、连续培养、微载体细胞培养法 填空题35简述细胞冻存、复苏和运送的方法。参考答案： （1）细胞冻存方法：预先配制冻存液（含20%血清培养基、10%DMSO）；取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入新鲜培养液

26、，低速离心5分钟；弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液，分装至冻存管中。密封后标记冻存细胞名称，日期，细胞状态也可标记，冻存者姓名。（细胞冻存是慢冻的过程：41小时，-201小时，-80过夜，液氮中保存）（2）细胞复苏方法（快融）：从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中，使其融化（1分钟左右）。5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。低速离心10分钟。去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。（3）细胞运送方法：冻存运送：液氮中；充液法：细胞传代后贴壁，瓶内充满培养液，密闭封口，保温携带。 填空题36制备单细胞悬液的方法主要有哪些？参考答案： （1）悬浮细胞的分离方法是离心法，最

27、简单方法是采用1000r/min的低速离心10min。（2）实体组织材料的分离方法有机械分离法和消化分离法，机械分离法包括切割分离法（组织培养法）和机械挤压分离法；消化分离法包括胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和胶原酶协同用法、EDTA消化法。 填空题37进行细胞培养的基本条件包括哪些？参考答案： （1）无污染的环境。无毒和无菌培养环境是保证培养细胞生存的首要条件。（2）适宜温度。人体细胞的适宜温度为36.5+0.5，偏离时，会影响细胞代谢，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力比对高温强。（3）气体和pH值。开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般置于95%的空气加5%CO2混合气体环境中。

28、O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。多数细胞缺氧不能生存。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，作用是维持培养基的pH值，细胞要求7.2-7.4。（4）营养物质。包括糖，无机盐，氨基酸，维生素，促细胞生长因子等。牛血清是提供生长因子和细胞所需物质的来源。（5）渗透压。260-320mOsm/L培养基 填空题38体外培养包括几类？什么是组织培养技术？参考答案：体外培养包括组织培养、细胞培养、器官培养三类；组织培养技术是指：从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。填空题39试述原代细胞培养的基本概念

29、、原理、优缺点及实际意义。参考答案： 1）概念：一般指细胞从组织中分离在体外生长至传代之前的细胞培养。这种培养通常是异质性，生长缓慢，但比较能代表原组织的类型并表达原组织特性。缺点是在培养过程中会失去许多原组织的细胞。2）原理及优缺点：细胞培养是将确定所选组织用剪碎的小组织块或分离的单个细胞进行培 养，这种培养失去了原有组织类型及某些生化特征，但它们可以增殖，特性化，获得遗传 背景相同的群体，可以保存。培养选材一般来自胚胎组织；因此比成体组织更易生存和生 长。这主要是因为胚胎组织有更多的胚胎组织干细胞（ESC），它们具有更高的自我更新和 多能分化的能力。3）实际意义：组织（细胞）培养对医学、生

30、命科学的意义培养的组织器官或细胞，能再一定范围和程度上反映生命活动规律和机体功能特点。培养的细胞为生命科学和生物医学各种研究奠定了物质基础。如药物筛选，疗剂评价，新生物制品研发，研究病毒及其他微生物，发现新的传染因子，组织工程中的支撑技术等。细胞培养技术已经成为商品化生物技术产品的核心。如目前可提供的产品，病毒疫苗： 口蹄疫、狂犬疫苗和乙肝疫苗等；非抗体型免疫调节剂：干扰素、白介素和集落刺激因子 等；多肽生长因子：表皮生长因子和神经生长因子等；酶类：组织型纤溶酶原激活剂；激 素：EPO和促黄体生成素等；杀虫剂：杆状病毒；肿瘤特异抗原；癌胚抗原；通过杂交瘤 生产的各种单克隆抗体；细胞本身（如干细胞）；皮肤重植等。4）组织（细胞）培养的局限性：细胞（组织）培养，包括器官培养终归是离体培养，缺少 生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医学生物实验过程及对结果的评估都必 须考虑这些。 填空题40试述“克隆”的基本概念并举例说明其在细胞培养工作中的实际意义。参考答案： 1）克隆：指通过一定方法获得由单