电针调节Noggin表达对VD大鼠学习记忆过程中海马神经发生的.docx

1、电针调节Noggin表达对VD大鼠学习记忆过程中海马神经发生的“电针调节Noggin表达对VD大鼠学习记忆过程中海马神经发生的影响”申请书正文1、项目研究意义随着人类社会进入21世纪，人口老龄化更加明显，老年期痴呆成为一个严重的医学和社会问题，而受到世界各国的关注。在我国，血管性痴呆是老年期痴呆的主要类型之一，且其发病率有逐年上升的趋势。血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由脑血管因素导致脑组织损害引起的智能及认知功能障碍的临床综合征。研究显示1，约25的脑卒中患者伴有程度不等的智能障碍，严重者不仅影响患者的生存质量，而且增加了社会和家庭的经济负担。海马是目前公认与学习、记

2、忆等高级神经功能活动具有密切关系的重要脑区，而海马最受缺血低氧的损害造成神经结构和功能的异常改变，成为痴呆等疾病的主要病理基础。新近研究表明，新生及成年哺乳动物与人的海马区域存在着神经发生（神经干细胞，neural stem cell，NSC），为人们深入研究海马功能及防治缺血性神经疾病提供了新的研究途径。血管性痴呆是迄今为止唯一可以预防的痴呆类型，早期积极预防治疗具有可逆性。采用针灸促进海马内神经发生向神经元方向分化并在脑组织内整合，对海马神经可塑性进行调节，改善学习记忆功能，无疑对VD的基础与临床研究具有重大意义。干细胞是当前生命科学的研究热点，Science将干细胞研究评为21世纪最重要

3、的十项研究领域之首，为世人瞩目。正是因为干细胞的特殊科学意义及其在医学上的应用前景，世界各国对此都投入大量的人力、财力进行有关基础和应用的研究。随着我省经济的发展，人民生活水平的提高，老年人口不断增加，而老年期痴呆、脑血管病等重大疾病也因之而增多。从新的思路研究这些疾病的发病机理和探索有效治疗方法，势必为提高我省人口健康水平有积极的促进作用。本项目的研究也正是基于理念而申请的立项的。2、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系2.1 研究目标开展对实验性VD大鼠的发病机理研究，证实海马的神经发生障碍是血管性痴呆的病理基础。进行电针对拟VD大鼠的治疗观察，在肯定疗效的基础上，结合现代医学的研

4、究理论与技术，深入探讨针灸治疗血管性痴呆的海马神经发生作用机制。2.2 与申请者研究工作长期目标的关系申请者长期从事针灸治疗缺血性脑血管疾病的临床与作用机制研究，特别是对针刺治疗缺血性脑血管病的临床与实验有较深入的研究。申请者设计并实施完成2003年度广东省自然科学基金“电针对局灶性脑缺血大鼠内源性神经干细胞影响的研究”（No.31458，排名第二）；参与完成国家自然科学基金“针刺对局灶性脑缺血后突触可塑性促进作用的研究”（No.30271644，排名第五）和国家中医药管理局科研基金“针刺调节神经营养因子对缺血后脑可塑性促进作用的研究”（No.02-03JP36，排名第五）等项目。这为开展本项

5、目的研究在相关技术和实验经验等方面提供了有力的支持。在上述研究基础上，本项目拟通过电针调节神经诱导因子Noggin基因的表达以调控VD大鼠海马神经发生机制，探讨针灸治疗VD的作用机理，为探索新的临床治疗方法、提高疗效，提供具有指导价值的科学依据。3、项目研究内容，研究方案和进度安排3.1 研究内容本项目从中西医结合基础的角度，研究针刺治疗VD的海马神经发生机制，从调节脑与神经发育密切相关的神经诱导因子Noggin基因的表达为切入点，观察VD及电针治疗时海马神经发生的变化规律，新生神经细胞的增殖、迁移与分化，结合相应神经行为学的改变应用透射电镜从体视学角度证实其功能性突触的重建，探讨Noggin

6、等在治疗VD时对神经发生的影响作用。旨在阐明针灸治疗VD的神经生物学作用机制，为针灸治疗缺血性脑血管疾病提供科学依据。具体如下：1）观察VD大鼠造模后Noggin基因的表达情况，海马神经细胞丢失及病理形态学变化情况及齿状回（DG）神经发生的规律，电针治疗后三者的变化情况：a造模后不同时相Noggin的表达情况及电针干预后的变化；b造模后不同时相海马神经细胞丢失的情况与VD大鼠神经行为学及齿状回LTP之间的关系；c造模后不同时相海马齿状回（DG）新生神经细胞的变化规律及电针干预对其影响；d造模及电针干预不同时相上VD大鼠神经行为的变化及LTP的诱导情况。2）在上述研究工作的基础上，分析电针治疗V

7、D的可能的作用机制：a研究脑与神经发育的神经诱导因子Noggin与海马神经发生（增殖、迁移、分化及功能性突触的形成）的关系；b研究大鼠海马神经发生情况与VD神经行为学及CA3神经突触重建情况的内在关系；c证实电针治疗VD大鼠的机制是否通过影响海马神经发生而发挥作用。3.2 研究方案动物模型健康雄性老龄SD大鼠（1215个月），体重350500g。经Y-迷宫训练筛选后选择学习记忆成绩合格大鼠，按照Ohta等方法（Ohta H, et al. Brain Res, 1994; 653(1):231-234）永久性结扎双侧颈总动脉制作2-VO慢性脑灌注不足的拟VD模型。根据研究要求进行动物随机分组。

8、部分动物进行假手术，用于对照研究。治疗与干预方法电针干预：采用督脉腧穴百会、大椎，采用毫针（1寸，30）针刺接通电针治疗仪（G6805型）给予疏密波刺激（刺激参数：电流强度1mA，频率：515Hz/s，时间：20min）。部分实验中采用躯干背部肌肉丰厚处非穴点进行对照，以观察穴位的相对特异性；在动物造模后，每日电针治疗1次，分别连续给予治疗3d、1w、2w、3w、4w及8w。阳性药物对照（对部分VD模型进行对照）：改善脑循环药物：尼莫地平（12mg/kg，灌胃）。在动物造模后每日给药1次，分别连续给药3d、1w、2w、3w、4w及8w。Noggin反义mRNA侧脑室注射：以乌拉坦腹腔麻醉大鼠固

9、定于脑立体定位仪上，根据Pellegrino图谱，于侧脑室（AP:1.0, L: 1.5, H: 3.0）埋置不锈钢导管（外径0.7 mm，内径0.4 mm），以牙托粉固定于颅骨上，术后3 d 开始实验。进行侧脑室内注射时，将清醒大鼠固定于敞式装置上，在埋植的导管内插入注射内管，其下端超出套管0.5mm，另一端经塑料管与微量进样器连接，取反义寡核苷酸20g/d（上海生工合成），按组别不同时间每日一次连续注射，每次注射时间不少于2 min。实验结束后，注入2 %滂胺天蓝（ Pontamine sky blue），核对给药部位。指标检测与关键技术说明神经行为学观察：aY型电迷宫检查：用MG-2Y型

10、电迷宫（刺激电压：50V，延迟2s）筛选成绩合格动物。bMorris水迷宫检查：实验包括：定位航行实验：观察记录逃避潜伏期和游泳路径（搜索策略）。空间探索实验：观察规定时间内大鼠在池中的游泳路径（搜索策略）。脑组织取材：根据检测内容的不同，分别采用断头处死取脑和经心灌注固定取脑，HE及Nissl染色采用石蜡包埋切片，组化染色及原位杂交采用冰冻切片。原位杂交观测Noggin 在大鼠脑内的表达与分布：参照文献（蔡文琴，等实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术四川科学技术出版社，1994354-432）采用漂浮法进行Noggin mRNA 原位杂交组织化学染色（Noggin 基因的cRNA 核酸探针，购

11、自华美生物制剂公司；地高辛标记试剂盒抗地高辛抗体、碱性磷酸酶显色剂NBT/ BCIP均购自Rhoe 公司）。步骤简述：胃蛋白酶K37孵育、地高辛标记的探针42反应，碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体孵育，用NBT/BCIP显色，脱水、裱片、DPX封片。RT-PCR半定量检测Noggin的表达：分别取各组大鼠5只。海马总RNA提取按文献方法（Sambrook J, et al. Molecular cloning, a laboratory manualM. NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press USA,1989.343-362）进行。PCR上、下游引

12、物，通过网站（www.genome.wi. mit.edu）提供的引物设计程序（Primer 3.0）设计。反应液经96.63min 预变性后，9460s、5560s、7260s循环30 次，反应产物置2琼脂糖凝胶电泳，摄片，扫描半定量分析。免疫组化等方法观察海马神经发生情况：aBrdU标记方法：在大鼠处死的前3天开始，进行BrdU腹腔注射50mg/kg，每12h一次，连续注射4次，在最后一次注射后24h处死，进行各项指标检测。bBrdU组化染色前切片中DNA解链和变性的预处理：50formamide（甲酰胺）/2SSC中，置于64孵育箱，30min，入2N HCl中，37孵育30min，其余

13、漂洗过程略。cBrdU免疫组化染色方法观察海马细胞增殖情况：参照Okano等的方法（Okano HJ, et al. Dev Neurosci, 1996, 18: 199- 209）及BrdU（2351，Sigma公司）染色说明书方法加以改进，采用ABC法进行BrdU免疫组化漂浮染色。d免疫荧光双重标记及荧光显微镜观察海马神经干细胞的增殖迁移、分化及与Noggin受体共表达情况：用鸡尾酒法染色，首先切片与小鼠抗BrdU单克隆抗体孵育，继之用Cy3标记的羊抗鼠抗体处理；入兔抗GFAP（Sigma公司）或兔抗TuJl（Sigma公司）、兔抗Noggin受体抗体（Lab Vision公司）孵育，F

14、ITC标记的羊抗兔抗体孵育，甘油封片，荧光显微镜下观察计数、拍照成像。HE染色及Nissl染色观测海马病理形态及神经元丢失情况。透射电镜（突触体视学）观察海马CA3区神经突触结构变化及电针对其影响：按照Freddari方法（Freddari B, et al. Brain Res, 1993;628:193），计算突触的数量和突触连接带与测试线的交点数，定量分析突触的突触数密度；再以XY-生物图像分析仪对突触界面曲率、突触后致密物质等进行定量分析。机制探讨观察电针对VD大鼠海马神经发生的影响a在模型建立后及电针干预的不同时相分别给予BrdU在体标记增殖细胞，采用免疫组化染色法观测电针对海马神经

15、发生的全过程影响。b用BrdU + PSA-NCAM（多聚唾液酸化神经细胞黏附因子）对增殖细胞进行免疫双重荧光标记，采用激光共聚焦扫描显微镜观察电针对增殖细胞的迁移和突触形成的影响。c用BrdU + GFAP（GFAP，胶质纤维酸性蛋白，胶质细胞标记物），BrdU + TuJ1（-tubulin，早期未成熟神经元的标记物）或NeuN（神经细胞核抗原，成熟神经元标记物）对增殖细胞进行免疫荧光双重标记，采用荧光显微镜观察电针对增殖细胞分化的影响。通过侧脑室注射外源性Noggin mRNA反义寡核苷酸或Noggin因子受体抗体，观察神经发育诱导因子在电针治疗VD中对海马神经发生的影响。应用RT-PC

16、R技术对造模后和电针治疗不同时相上海马内Noggin的表达进行半定量分析，观察电针干预对Noggin表达的影响。采用免疫组化和原位杂交技术，观察神经发育诱导因子与新生神经细胞的分布与共存情况。采用透射电镜技术，观察VD模型与电针干预在不同时相上海马CA3区结合神经行为学观察情况证实突触的形成。统计学处理实验数据结果以xs表示，用SPSS12. 0 统计软件包进行方差分析，两样本均数间比较用t 检验，P 0. 05 有统计学意义。技术路线示意附：技术路线示意实验一：电针对拟VD大鼠的治疗效应及对VD大鼠海马神经发生、Noggin的影响实验二：Noggin对拟VD大鼠海马神经发生和电针干预过程中治

17、疗效应的影响3.3 进度安排第一年度（2006.1-2006.12）观察造模后及电针干预下VD大鼠海马神经发生的变化规律，以及针灸治疗效应：具体包括：建立拟VD模型，观察VD大鼠海马神经发生的改变情况（增殖、迁移、分化）及电针干预对其影响；观察电针治疗效应（神经行为学及海马病理改变，突触可塑性（透射电镜）的变化等）。第二年度（2007.1-2007-12）阐明脑与神经发育诱导因子Noggin基因的表达对VD大鼠海马神经发生的影响作用：通过侧脑室注射给予外源性Noggin 反义mRNA，观察Noggin对大鼠VD 模型及电针干预后海马神经发生的影响；在造模和电针治疗不同时相上观察海马内Noggi

18、n的表达分布情况并进行半定量分析，观察电针干预对Noggin表达的影响；采用免疫组化染色或原位杂交技术，观察神经发育诱导因子Noggin与新生神经细胞的分布与共存情况。第三年度（2008.1-2008.12）观察新生神经细胞的分化情况及功能性突触的建立，结合前述的研究结果揭示电针治疗VD的作用机制：对增殖细胞进行免疫荧光双重标记，采用荧光显微镜观察电针对增殖细胞分化的影响。在观察细胞分化情况的基础上，结合神经行为学及电镜的突触体视学研究情况，以证实新生神经元功能性突触的建立与形成。综合所有研究结果，对电针在治疗VD大鼠中对海马神经发生机制的影响作用进行分析，得出研究结论。根据研究工作的进展情况

19、，可适当调整上述实验或穿插结合。4、项目创新之处4.1项目创新之处创见性地提出“海马的神经发生障碍是血管性痴呆的病理基础，针灸治疗VD的可能是促进了海马神经发生机制而发挥作用”的研究假说，并通过实验研究加以证实。采用国际通用的VD大鼠模型，从神经发生的角度，系统观察血管性痴呆的发病及电针治疗后海马神经发生的变化规律，为深入揭示这一复杂疾病的发病机制做出积极的贡献。本研究通过电针调节神经诱导因子Noggin基因的表达以调控VD大鼠海马神经发生机制，探讨针灸治疗VD的作用机理，为探索新的临床治疗方法、提高疗效，提供具有指导价值的科学依据。4.2项目立题依据4.2.1 血管性痴呆（VD）的病理基础在

20、分析卒中后痴呆发生的重要危险因素中发现：缺血低氧性病变是卒中后痴呆发生的主要危险因素。海马是目前公认与学习、记忆等高级神经功能活动具有密切关系的重要脑区，而海马最易受缺血低氧的损害造成神经结构和功能的异常改变，成为痴呆等疾病的主要病理基础。影像学定量MRI研究认为，VD患者中存在海马或海马杏仁体复合体萎缩，推测是由缺血性损害所致2。Fein等3认为，皮质下缺血性血管性痴呆与海马及皮质萎缩有关，与腔隙性梗死的数目、部位、体积无关；且海马萎缩是病变严重程度最好的预测指标。4.2.2 海马神经发生现象及其与学习记忆的关系随着神经科学的发展，人们认识到成年中枢神经系统（central nervous

21、system，CNS）仍能不断地产生新的神经元，即在成年CNS仍有神经发生（neurogenesis）。大量证据表明，大脑终生具有神经再生的能力，而新生神经元可能具有拓展和修复学习记忆的重要功能4-6。目前，在成年哺乳动物脑内，人们了解比较多的神经发生区域有两个，即海马齿状回（dentate gyrus，DG）的颗粒下层（subgranular zone，SGZ）和侧脑室的脑室下层（subventricular zone，SVZ）。成年海马DG存有神经干细胞或神经元前体细胞，具有长期自我更新能力，是海马新生神经元的主要来源7,8。成年海马神经发生已在不同种属间得到了广泛证明，表明成年海马神经发

22、生在种属间高度保守，是生物界的普遍现象。学习记忆是大脑的高级功能。长期以来，已从众多角度对其机制进行了探讨，但有关学习记忆的机制研究仍未取得突破性进展。研究表明，成年动物海马新生细胞绝大多数具有成熟神经元的形态，且能够产生动作电位并形成功能性突触联系9。这些NSC经过迁移到达颗粒细胞层，发出的树突进入海马的分子层，它们的轴突则成为苔藓纤维通路的一部分，并与CA3区的靶神经元建立突触联系。CA3区是海马产生长时程增强（long-term potentiation，LTP）的主要部位，因而位于SGZ的神经发生对空间学习与记忆可能有重要作用。成年海马的神经发生与学习记忆密切相关。海马新生的神经元可能

23、参与记忆的形成与保存，一些促进成年海马神经发生的因素往往能够改善学习记忆功能，而抑制海马神经发生的因素可出现学习记忆等功能障碍10。Shors等5证明新生神经元对大鼠海马依赖型记忆（hippocampal-dependent memory）的形成不可或缺。研究用药物杀死增殖的细胞，发现新生神经元数目减少时导致海马依赖型记忆严重受损；停药后细胞增殖恢复，海马依赖型记忆明显改善。整个实验过程中，海马非依赖型记忆未受任何影响，成熟的海马神经元没有死亡，海马CA1区也未发生永久的神经生理学性质的改变。这些研究表明，海马新生神经元是相关学习记忆所必需。4.2.3 缺血性脑损伤与海马神经发生的关系海马是脑

24、组织对缺血高度敏感的脑区。缺血性脑损伤极易造成神经元丢失而导致脑功能缺陷11。Yagita等12发现，短暂性前脑缺血后，SGZ内增殖细胞的数量增加5.78倍，4周后大约70%表达神经元的表型，表明缺血可诱导海马内的神经发生。Iwai等13对短暂性全脑缺血后DG神经发生过程中细胞增殖、迁移和分化的关系进行了研究。结果发现，缺血后齿状回NSC的增殖开始于SGZ，然后迁移到颗粒细胞层并在此分化成神经元，另一部分新生细胞移行至DG门区分化为胶质细胞，而这三步主要在全脑短暂性缺血后2个月内完成。Nakatomi等6也观察到，在缺血性损伤脑组织，给予适当刺激和生长因子，则能诱导海马的NSC增殖分化成新的神

25、经元，从而改善学习记忆能力。4.2.4 神经诱导因子Noggin与海马神经发生的关系近几十年来研究者致力于神经诱导因子（Neural inducing facror，NIF）的寻找，目前已发现的NIF有Noggin、follistatin和chordin。其神经诱导作用可能是通过阻断骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）而发生14。实验表明，抑制BMPs信号就足以导致神经的发生15。所以目前研究认为：神经发生不是一个主动诱导的过程，而是阻断向表皮诱导信号BMPs而产生的内定过程。研究发现Noggin对神经发生有重要影响作用，脑缺血后的神经再生也可能与No

26、ggin的参与有关。Noggin是由室管膜细胞产生一种能与BMPs结合并抑制BMPs受体激活的多肽，它能通过抑制内源性BMPs信号通路而促进海马神经再生，同时抑制NSC向胶质细胞分化16。研究发现，从胚胎至成年的整个发育期，脑室下区均有Noggin与BMPs表达，且Noggin与BMPs之间的平衡对室下区NSC的增殖、分化、存活及新生神经元可塑性均有重要调控作用17。室下区细胞主要表达BMPs及其相应受体，而相邻的室管膜细胞则主要表达Noggin。BMPs通过促进胶质细胞的分化而抑制神经发生，而外源性Noggin蛋白则促进神经发生18。近年研究表明，Noggin基因作为重要的NIF表达在成年大

27、鼠海马与前皮质，并与空间学习记忆密切相关。由海马参与的Morris水迷宫训练能使海马DG的颗粒细胞层、CA3区及前皮质内Noggin mRNA阳性细胞数显著升高，侧脑室注射Noggin反义寡核苷酸可明显抑制该效应，并可引起大鼠空间学习记忆障碍，表现为空间记忆的获得困难和形成记忆的保留障碍19。4.2.5 研究假说与思路的确立目前，VD尚没有肯定的药物或手术治疗方法。预防中风被认为是减少VD发病率和死亡率最直接和实质性的方法。常用的治疗药物有血液流变学药物（己酮可可碱）、抑制细胞钙内流血管活性药物（尼莫地平）、阿司匹林、丙戊茶碱、纳洛酮及核苷嘧啶等。最近更多提到的乙酰胆碱酯酶抑制剂被推荐为治疗V

28、D的首选药物。但上述药物均存在着一定的毒副作用。采用针灸尤其是电针治疗VD有着良好的疗效，最近，彭唯娜等20对国内外关于电针治疗VD的文献中符合随机对照试验的临床研究，筛选出符合纳入标准的5个研究采用循证医学的方法进行了系统评价，电针治疗组有效率在7091之间，疗效均优于西药对照组。其评价结果显示：电针治疗VD安全、无不良反应，对改善整体功能和认知功能均较对照组有效，其中电针对整体功能改善的有效性较好。VD属于中医学“呆病”、“郁症”等范畴。病位在脑，病机主要为气血亏虚，肝肾不足，脑窍失于荣养，进而髓海失聪所致。灵枢海论提出：脑为髓之海，其输上在于华盖（百会），下在风府。难经二十八难云：“督脉

29、者上至风府，入属于脑。”百会与大椎均为督脉穴位，督脉与脑密切相关，百会为“三阳五会”，大椎为“诸阳之会”，针刺此两穴可以激发经气、疏通经络，使脑髓得气血之荣养而复聪。我们以往的研究以大椎、百会为主从临床和实验两个方面均证实电针可有效改善VD患者的症状、提高实验动物学习记忆的能力。海马在许多记忆过程中起重要作用，包括空间学习、对环境中物体的方位进行定位及将不连续的信息连接起来，这些功能的发挥可能与海马中大量新生神经元的出现及新突触的形成有关21。我们以往证实22,23：电针可促进脑缺血后内源性NSC的增殖和分化，电针治疗缺血性脑损伤的主要作用机制之一可能是通过激发NSC参与脑神经结构和功能的重塑

30、自身修复而实现的。大量的实验研究表明Noggin拮抗BMPs促进成年海马与SVZ的神经发生。Noggin作为一种重要的神经诱导剂，在神经发生过程中起着重要的调节作用。研究成年海马神经发生在电针治疗VD的作用机制，通过Noggin调控海马的神经发生参与学习记忆，将是针刺治疗VD机理研究的一个崭新领域。综上所述，本项目拟从中西医结合基础的角度，研究电针督脉腧穴百会、大椎治疗VD的海马神经发生机制，从调节脑与神经发育密切相关的神经诱导因子Noggin基因的表达入手，观察VD及电针治疗时海马神经发生的变化规律，新生神经细胞的增殖、分化，结合学习记忆的形态学基础神经突触的重建，以及相应神经行为学的改变，

31、探讨Noggin等在治疗VD时对神经发生的促进作用。旨在阐明针灸治疗VD的神经生物学作用机制，为治疗缺血性脑血管疾病提供科学依据。5、工作基础与工作条件5.1 工作基础本课题组主要成员长期从事针灸治疗缺血性脑血管病、VD、帕金森病的临床和实验研究，特别是对针刺治疗缺血性脑血管病的临床与实验有较深入的研究。曾参与完成国家自然科学基金“针刺对局灶性脑缺血后突触可塑性促进作用的研究”和国家中医药管理局科研基金“针刺调节神经营养因子对缺血后脑可塑性促进作用的研究”等项目。本课题申请者，在攻读博士学位期间以广东省自然科学基金项目“电针对局灶性脑缺血大鼠内源性神经干细胞影响的研究”（No.31458，排名

32、第二）；作为学位研究课题，研究证实：电针可促进脑缺血后内源性NSC的增殖和分化，内源性NSC参与了缺血新性损伤的脑神经结构和功能重塑自身修复。这为开展本项目的研究在相关技术和实验经验等方面提供了有力的支持。课题组主要成员，自1990年代起以大椎、百会等穴位为主从临床和实验两个方面均证实电针可有效改善VD患者的症状、提高实验动物学习记忆的能力；并证实其作用可能机制是多途径的。在上述研究基础上取得了多项相关研究成果：“电针对局灶性脑缺血大鼠脑内兴奋性氨基酸受体的调节作用”，2004年获浙江省科技进步二等奖；“脑靶向督脉导入Hup-A传递系统及改善痴呆动物记忆障碍研究”， 2003年获浙江省科技进步二等奖；“电针治疗血管性痴呆的实验研究”获2003年浙江省教育厅科技进步二等奖。且有在研相关课题浙江省自然基