第三章主要生防微生物类群.docx

1、第三章主要生防微生物类群第三章 主要生防微生物类群(生防细菌、放线菌、真菌)一、生防细菌Maarten等(1997)报道常见的对植物病害有生防作用的细菌多集中在以下几个属： 假单胞杆菌属(Pseudomonas)包括荧光假单胞菌，土壤杆菌属 (Agrobacterium)，欧文氏杆菌属(Erwinia ),伯克氏杆 菌属(Burkholderia )，芽胞杆菌属(Bacillus)等。(1)荧光假单胞菌荧光假单胞菌(Pseudomo nas fluoresce ns)属于假单胞杆菌属，是植物根际有益微生物中种群数 量最大的一类革兰氏阴性菌，其营养需要相对简单、能够利用根分泌物中大部分营养迅速在

2、植物根 基定殖。同时因其中一些菌株具有促生和生防作用，使其成为最具有应用前景的植物根围促生细菌(Pla nt growth-promot ing rhizobacteria PGPR) 之一。近来年，国内外利用荧光假单胞菌防治土传病害的 研究和应用都取得很大的进展 (表1)。表1目前在美国上市的荧光性假单胞菌类 PGPRTable 1-1 Pseudomonas products for disease control in USA marketPGPR产品名防治对象应用作物制造/销售厂家荧光假单胞菌BlightBa n霜冻、解淀粉欧文杏、苹果、蓝莓、樱桃、Pla nt HealthA506氏

3、菌桃、李、马铃薯、草莓、Tech no logies番茄荧光假单胞菌ConquerPseudo monas蘑菇Mauri Foodtolassii荧光假单胞菌菌VictusPseudo monas蘑菇Sylva n株 NCIB2089tolassii丁香假单胞菌Bio-save100Botrytis cin erea果类(Bio-save100)Spaw nESC-10Bio-save-1000Peni cillium柑桔(Bio-save100)Laboratoryspp.,MucorEcoScie neepyroformis,GeotrcCorp.hum can didum丁香假单胞菌Bi

4、o-save110同上梨果类EcoScie neeESC-11Corp.1荧光假单胞菌的生防机制荧光假单胞菌作为 PGPR与植物间的相互作用十分复杂。研究表明其促进植物生长多数是以病原菌存在为前提，抑制病原菌对植物根系的危害，间接促进植物的生长。生防荧光假单胞菌的作用机理多种多样，就目前已经肯定的机理，包括抗生作用 、营养和位点竞争、诱导抗病性等等。(1)营养和位点竞争不同的作物根际为微生物提供的可利用营养不同。有益微生物和病原菌之间竞争有限的营养物质必然会影响病原物的生长和致病性。 Daniel等(1991 )获得了荧光假单胞菌的突变株 M114，它是蛋白酶缺失突变体，不能利用葡萄糖、海藻糖

5、、葡糖酸、果糖，甘露醇和甘油，而且对琥珀酸，苹果酸和延胡索酸的利用方面有缺陷。突变体 M114和野生型菌比较，在甜菜根际定殖能力无显著的差别。但与野生菌株相比， M114在甜菜的根际能够充分地利用各种不同的碳源营养。作物根际含有大量以植物和微生物不能利用的形式存在的铁元素。 在根际土壤中，Fe(OH) 3的溶解度非常低，有效铁Fe3*的浓度仅有10-17mol/L ,远远不能满足微生物正常的生长需要 (10-5-10-7mol/L)。因此，在微酸性、中性和碱性土壤中，有效铁 Fe3+浓度都满足不了微生物正常生长需要的有效铁含量。大多数的微生物都能产生一种低分子量的、与 Fe3+具有很高亲和力的

6、物质，称为嗜铁素(Siderophore)。Klopper等(1980)首次发现和证明了荧光假单胞产生的嗜铁素作为一种作用机制在生物防治中具有重要作用。其将荧光假单胞菌野生菌株与化学诱变获得的不产嗜铁素的突变菌株分别与病原物接种在 Fe3+贫乏的培养基中，发现野生菌株显著抑制病原菌的生长，而突变菌株对病原菌没有抑制作用。向缺铁介质中补加嗜铁素后，突变菌株则恢复了对病原菌的抑制作用。以上结论说明在铁胁迫条件下， 荧光假单胞菌通过产生嗜铁素， 在与病原物竞争铁营养的过程中占有优势，从而抑制了病原物的生长。此后许多研究表明在荧光菌对根际有害微生物，如小麦全蚀病菌(Gaeuma nnom yces g

7、ram inis var. tritici )、镰刀菌枯萎病菌(Fusarium oxysporium spp.)和腐霉根腐病菌(Pythium spp.)的生物防治中产生的嗜铁素都有抑制病原菌的作用。进一步研究表明，植物根际的荧光假单胞菌产生的嗜铁素与三价铁离子形成复合体，可被荧光菌和植物利用，而病原菌则不能利用，因此其不能获得生长需要的铁离子，种群数量减少，致病力降低，而间接的保护了植物健康的生长。根际生态位点的竞争是生物防治土传病害的另一个作用机制。大量研究证实，防病效果好的生防细菌，大多具有定殖能力强，能够分布于根的各个区域的特性。通过种 殖在植物根际，占领根际有效位点，对土传病害的防

8、治效果明显好于将有益菌接种在土壤中。用不产生冰核的突变菌株(Ice-mutant of Pseudomonas syringae)与产生冰核的菌株同时接种植物预防霜冻。试验结果表明：由于植物叶面的生态位点有限，非致病突变体的定殖减少了致病群体 的定殖，霜冻害有明显减轻。(2)诱导抗性诱导抗病性(induced resistanee) 是指利用物理、化学和生物方法，预先处理植物，诱导植物启 动自身的防御机制，增强对后续病原物的抵抗能力。荧光假单胞菌的一些菌株能通过诱导植物产生对病原物的抗性，或通过产生某些物质诱导植物产生抗性。van Peer等( 1991)用 P. fluoresce ns W

9、CS417r 和病原菌 F. oxysporum dia nthi 分别接种康乃馨(前者接种在根部，后者接种在茎部) ，WCS417r处理根部比茎部早接种病原物提前一个小时，枯萎病发病率从50%下降到20%，试验中WCS417r并未接触到病原物， 其对枯萎病菌的防治不是通过二者之间的竞争和拮抗作用，而是诱导了寄主植物的抗病性。同时，用恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌的 一些菌株处理青豆，黄瓜种子后，发现幼苗茎，叶上的病害症状都明显减轻，但在茎、叶部位并未 分离到原接种的菌株。 某些荧光假单胞菌产生 HCN也能诱导植物产生抗性，Voisard等人发现野生型P. fluoresce ns CHA0的HC

10、N-突变株失去了抑制烟草黑根腐病的能力。在烟草上已经确认 HCN有诱导抗病的能力。用棉花枯萎病菌的无毒菌株或弱致病性菌株进行预先接种， 24小时内即可表现交叉保 护效果，接种无毒菌株的同时诱导了对维管束的堵塞和类萜的合成，堵塞作用造成棉花植株组织中 病原菌数量的减少。目前，对植物根际有益菌诱导抗病性的研究结果表明：诱导抗病性的根际细菌在不同植物根际 的定殖没有专化型，而产生诱导抗病性则对植物存在较高的专化型。恶臭假单胞菌 WCS358r 和 WCS374r 诱导抗病性的植物种类明显不同， WCS358r 能够诱导拟南芥的抗病性，但对萝卜、康乃馨 无诱导作用。根际有益菌诱导抗病性与病原菌诱导抗病

11、性的机制明显不同。根际有益菌产生的脂多 糖、嗜铁素和鞭毛蛋白是诱导抗性的决定因子。( 3) 抗生作用产生抗生素抗生素是由微生物产生的具有生物学活性的物质，它在很低浓度下就能抑制或影响其它生物的 机能，从而对敏感微生物产生抑制或致死作用。大约在一百年前，欧洲科学家就发现了微生物间的 拮抗作用。自从 1877 年，巴斯德发现一种细菌抑制另一种细菌的拮抗现象后，世界各国对利用微生 物防治植物病害的研究发生了浓厚的兴趣。由于生防菌产生的抗菌素具备抑制病原菌微生物生长的能力，因此生防菌的拮抗作用在目前植 病生防菌筛选中是最重要指标，产生抗生素与否及其产量大小往往决定着一个生防菌株的命运。在 防治植物病害

12、中起着重要作用的荧光假单胞菌在其生长环境中能分泌多种胞外活性物质，具有拮抗 专化性，可以抑制不同种属的真菌和细菌，已在实际应用中取得了可喜的进展。假单胞杆菌属和伯克氏杆菌属在人工培养条件下产抗生素能力最强。生防假单胞杆菌能够产生 一到多种抗生素，例如： 2,4-二乙酰基藤黄酚 (2,4-diacetylphloroglucinol, 2,4-DAPG) ，吩嗪 -1-羧酸(phenazine-1- carboxylic acid, PCA) ，藤黄绿脓素 (pyoluteorin) ，硝吡咯菌素 (pyrrolnitrin) 和氰化物 (HCN) ，对疫霉菌、 青枯病菌等均有一定的抗生活性 4

13、 。在近二十年中， 由于分子生物学手段应用于 生防机制的研究，使微生物之间的拮抗作用成为生防机理研究中最清楚的部分。假单胞杆菌 Hv37a 产卵菌素 (oomycin)A 能力缺陷的突变株与野生菌株相比，防治棉花猝倒病的能力降低 50% 。同样， HCN 、 2,4-DAPG 、吩嗪、硝吡咯以及荧光假单胞菌产生的吩嗪 -1-羧酸可体外抑制小麦全蚀病菌 Gaeumannomyces graminis var. tritici的生长。Thomshow等(2002)研究还表明基因直接参与抗生素 的产生，通过采用高压液相色谱分析表明，在吩嗪产生菌定殖的小麦根部检测到了吩嗪，而在吩嗪 合成基因缺失的突变

14、体定殖的小麦根围没有检测到吩嗪，以上结论为荧光假单胞菌产生抗生素和它 直接参与病害的防治提供了证据。为了说明假单胞杆菌产生的 pyrrolnitrin 在防治猝倒病中的作用，Homma等(1994)将纯化的pyrrolnitrin施于种子表面，研究抗生素对病原及病害的抑制情况， 结果发现抗生素能够降低病害发生率 3050%，这与使用菌剂包衣的防病效果相当。进一步为抗生素在生防 菌防治病害中的重要性提供了直接的证据。 Shanahan等人从一株荧光假单胞菌中提纯出 2,4-DPAG ,这种物质能保护甜菜免遭 Pythiuim的侵染，Tn5突变的不产DAPG的突变体失去了抑制 Pythiuim的能

15、力。Keel等从另外一株荧光假单胞菌也分离到 2,4-DPAG，它能抑制烟草黑根腐病和小麦全蚀病。Raajmakers等(1999)采用HPLC和透射电镜分析和观察了荧光假单胞菌在土壤中产生抗生素 2,4-DPAG在抑制小麦全蚀病菌中的作用，结果证明 2,4-DPAG是荧光菌防治全蚀病的关键因素。2 影响根际定殖的因子决定假单胞菌在寄主根际定殖能力的相关因子的研究报道并不多，这与根际的复杂程度和接种 的生防细菌在根际的不稳定性相关。有研究结果表明，根分泌 在定殖中起一定的作用。大豆根部分泌的凝集素对假单胞菌有一定的专一性，其参与细菌对根分泌 物较多的位置表现凝集作用的趋性。生防作用、应用方法，

16、定殖影响因素(2)芽孢杆菌芽孢杆菌属(Bacill us)是一类好氧和兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。 由于能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性的芽孢 ,可忍受各种不良环境，如可以在pH为23的地方生存，也可以在温度高达80 C甚至以上的地方生长 ，南极寒冷的冰雪中也能见到他们的踪迹,在自然界分布较为广泛。芽孢杆菌属与人类关系极为密切 ，是越来越引起人们重视和研究的一个重要的微生物类群。芽孢杆菌属的一个重要特征是好氧生长。能够产生芽孢是芽孢杆菌定属的首要 特征。1芽孢杆菌的应用生物肥料 巨大芽孢杆菌等可降解土壤中难溶的含磷化合物 ，使之成为作物易吸收的可溶形态40、5

17、0年代，前苏联P. A蒙金娜就曾经使用过以巨大芽孢杆菌为主的混合菌制剂来分解土壤中的 有机磷化合物，并取得一定效果。自1958年Hino首次从日本土壤中分离到一株具有高固氮活性的 芽孢杆菌固氮菌株后，土壤中新发现的芽孢杆菌固氮菌株越来越多 ，国际上承认的固氮能力较高的需氧芽孢杆菌为多粘芽孢杆菌的一个变种 (亦称为固氮芽孢杆菌 Bacillus azotofixans)。此外，也有一些巨大芽孢杆菌、球形芽孢杆菌的部分菌株有一定固氮能力的报道生物农药 苏芸金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)最早在1905年日本死于猝倒病的家蚕体内发现并于1938年在法国首次成为商品。苏芸金芽

18、孢杆菌制剂已成为世界上产量最大的微生物杀虫剂。国 内外有许多关于枯草芽孢杆菌对植物病原真菌的抑制作用及防治实验的报道。2枯草芽孢杆菌的应用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn是一种嗜温的好氧性产芽孢杆状细菌 ，革兰氏反应阳性(G+ ),因能产生多种抗菌素和酶而被广泛地应用于酶的生产、食品加工和贮存、纺织、造纸、 医药及生物科学研究等领域。作为植物病原菌抗生体的 B. subtilis菌株,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力并能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖 ，有效抑制病菌生长。近年被引入植病生物防治领域其在控制病害发生、促进植株生长，提高作物产量等方面

19、显示出了广阔的应用前景(1)在根部病害防治中的应用Sharma和Jain(1978)用从生姜根围分离到的 B. subtilis 菌株防治由Fusarium f . sp. zingiberi引起的生姜黄花病防治效果达 19.4 %50 %,产量提高25倍以上，其防病促生效果优于同等条件下的Aspergillus niger 和 Memnoni ella echi nata 等真菌抗生体。 Cha ng 和 Kommedahl (1968) 用该类拮抗体菌 剂浸泡玉米种子，不仅防止了幼苗枯萎病的发生、促进了幼苗生长、产量明显提高 (其中感病品种的产量增幅大于抗病品种)，还有效地控制了仓贮期玉米

20、种腐，其效果与特效杀菌剂一克菌丹 (captan)相同。杨佐忠(1990,1999)用B. subtilis PRS5菌株制剂分别浸泡杉木种子和雪松种子以防治苗木根腐病(R. solani),分别获得了高达87.4 %和99 %的防治效果，苗木高生长亦分别增加38.6 %和17.7 %以上,苗茎明显增粗 ; 喷洒幼龄松苗有效地控制了猝倒病的发生 ; 喷洒水稻秧苗或浸泡玉米种子使由 R. solani引起的水稻纹枯病、玉米纹枯病(R. solani)和玉米小斑病(Helminthosporium maydis )分别减轻达 50 %81 %、37.2 %和37.3 % ,产量得以大幅提高。(2)

21、在枝干病害防治中的应用Hall 等(1986) 发现槭树干部组织中的天然 B. subtilis 分离物不仅能抑制轮枝霉菌 (Verticillium sp. ) 引起的槭树枯萎病 , 还可沿木质部上移 , 存活期长达 120天以上。 Cubeta 等(1985) 发现用 Bs1 菌 株孢悬液处理大豆种子后 , 引起其植株茎部病害的茎点霉菌 (Phomopsis sp.) 的存活率剧烈下降。向玉 英(1984) 的研究表明 ,B. subtilis 等细菌抗生体对杨树溃疡病菌 (Dothiorella gregaria )、腐烂病菌 (Cytospora chrysosperma ) 等的抑制

22、效果优于木霉 (Trichoderma spp.)禾口曲霉(Aspergillus terre ns) 等真 菌抗生体 , 其中对腐烂病菌的有效抑制期为 16 天左右。(3)在叶、花部病害防治中的应用Baker 等(1983) 在接种大豆锈病菌(Uromyces phaseoli var. typical)前,先用 B. subtilis APPL21 液 剂喷洒大豆植株 , 结果使该病菌的锈疱囊减少了 95 %以上,叶片上的锈孢子难以正常产生芽管 ,部分孢子的细胞异常突起 , 萌发率大为下降。此后 , 他们又分别用 APPL21 培养物和 PPL23 的培养物滤液防治 田间大豆锈病取得了良好

23、效果。 在Pinto川大豆品种上每周施洒 3次PPL23滤液较之每周施一次代森锰锌 (Mancozeb) 杀菌剂的防病效果更佳且能刺激植株生长。研究表明 , B. subtilis 拮抗体能在生长期 的杨树叶片上存活 3 4 个月 , 显示出在防治杨树黑斑病 ( Massonina populicola ) 和杨树炭疽病 (Gloeosporium tremulae )方面有较大的潜力.曾大鹏等(1987)用B. subtilis发酵液接种油茶花器(炭疽 病菌的主要携带器官 ) 成功地减少了炭疽菌 G. camelliae 对花器的侵染 , 显著降低了幼果的发病率 , 相对防效达 40 %70

24、 % , 提高油茶座果率 7.1 % , 保果率增高 11.9 %。(4)在收获后果品病害防治中的应用20 世纪 80 年代末期用 B23 菌株悬液进行工厂化桃子生物防腐处理控制桃子腐烂的效果与防治 该病的标准农药苯菌灵接近或相当。杨佐忠 (1993) 用 B. subtilis PRS5 菌株制剂防治由 Penicilliumitalicum和P. digitatum 引起的贮藏期柑橘腐烂病，在23 C28 C的恒高温条件下，分别使红桔、血橙 的腐烂率下降76. 19 %和50 %;朱天辉等(2000)用B. subtilis BS23菌株发酵液处理金花梨果腐病 (Botrytis cine

25、rea Pers. ) , 常温条件下的防腐效果达 49.85 %62.5 %。为实现果品的无公害防腐保鲜 , 生产绿色食品奠定了良好的技术基础。二、放线菌放线菌 (Actinomycetes) 属于原核生物， 广泛分布于自然界， 除少数厌氧或兼性厌氧的寄生类群外， 大多数是好气性的腐生菌。放线菌种类繁多，代谢功能各异，是一类有广泛实际用途的微生物资源。放线菌是抗生素等一系列生物活性物质的重要生产者。 目前世界上报道的上万种抗生素中， 70% 以上是由放线菌产生的，且临床上使用的抗生素有三分之二来自放线菌。放线菌产生的抗生素在农 作物病虫害生物防治方面也具有重要作用，如防治水稻纹枯病的井冈霉素

26、 (Validomycin) 、防治蔬菜真菌性病害的武夷霉素 (Wuyiencin) 、防治作物细菌性病害的中生菌素等农用抗生素已在生产上发挥了重要作用。(一)生物学形态 放线菌是真细菌的一个大类群，革兰氏阳性，在伯杰氏手册中属于厚壁菌门、放线菌纲。它们 是具有多核的单细胞原核生物。 比较原始的放线菌细胞是杆状分叉或只有基内菌丝 (substrate hyphae) 没有气生菌丝(aerial hyphae)。典型的放线菌除发达的基内菌丝外，还有发达的气生菌丝和孢子丝 (图3-1)。放线菌产生的孢子从形成方式上有外生的和内生的两类。大多数放线菌的孢子是外生的，它们 通常都是着生在气生菌丝的孢子

27、丝上，也有的是在基内菌丝的顶端形成。孢子丝上形成的孢子为横 隔分裂。放线菌的菌落形态随种类不同，一般有两种类型；一种类型的菌落为粘稠或粉浆状、粗糙或光 滑，表面很少有气生菌丝覆盖。另一种类型的菌落是由产生基内菌丝体和气生菌丝体或只产生基内 菌丝体的放线菌所形成的，这类菌落由于基内菌丝钻入基质内或紧贴培养基表面，比普通细菌的菌 落更致密坚实，常为革质、崎岖、多皱。放线菌有两种繁殖方式。 一种方式是通过形成无性孢子 (分生孢子、 孢囊孢子或游动孢子 )的方法进行繁殖。当成熟的无性孢子散落在适宜的环境里吸收水分、膨胀、萌发、长出 14根芽管，芽管进一步生长、分枝，形成菌丝体 (图 3-2)；另一种方

28、式是菌丝体的无限伸长和分枝，或者通过菌丝断 裂进行繁殖。(二)种类 放线菌在土壤和根际中是仅次于细菌的第二大类微生物，土壤和根际放线菌的优势种群为链霉菌属(Streptomyces)，根据培养特征可分为 12个类群。土壤和根际中常见的放线菌还有诺卡氏菌属(Nocardia ) 、小单胞菌属 (Micromonospora )、放线菌属 (Actinomyces)。1. 链霉菌属 (Stretomyces) 在固体培养基上生长时，形成发达的基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝生长 到一定时候分化产生孢子丝，孢子丝有直、波曲、螺旋形等各种形态。链霉菌的许多种类产生对人 类有益的抗生素。如链霉素、红霉素、四

29、环素等。2.诺卡氏菌属(Nocardia )在固体培养基上生长时，只有基内菌丝，没有气生菌丝或只有很薄一层 气生菌丝，靠菌丝断裂进行繁殖。该属能产生多种抗生素，如对结核分枝杆菌和麻疯分枝杆菌有特 效的利福霉素。3.小单孢菌属( Micromonospora )菌丝纤细，只形成基内菌丝，不形成气生菌丝，在基内菌丝上长 出许多小分枝，顶端着生一个小孢子。此属也是产生抗生素较多的一个属，如庆大霉素就是由该属 的绛红小单孢菌( M.purpurea )和棘孢小单孢菌 (M.echinospora )产生的。(3)应用方式及其生防作用 放线菌一般通过两种途径对靶标病菌发挥生防作用，它能够在寄主体外通过抗

30、生作用、竞争作 用、捕食和重寄生作用，降低病原菌的致病性、侵染效率以及接种体密度，导致病原菌群体密度以 及致病性下降；放线菌也可以在寄主植物组织内，诱发其产生抗性或者产生抑菌物质，影响病原菌 的繁殖、生长，最后导致靶标病菌死亡。1.抗生菌的直接利用用放线菌制成的活细胞制剂，具有无毒、无残留、不伤害非靶标微生物、与环境兼容性好、防 病持效期长等优点。 世界上己有许多利用抗生菌防治土传病害的成功事例， 如 1953 年从我国陕西省 泾阳县的苜蓿根土中分离获得的细黄链霉菌 (Streptomyces microflavus )，用其制成的“ 5406”抗生菌推广的面积最大。它在生长过程中能分泌数种不

31、同的抗生素， 抑制黄萎病菌(Verticillium spp.)、枯萎病菌(Fusariumspp.)、立枯病菌(Rhizoctonia spp.)、猝倒病菌(Pythium spp.)等多种植物病原菌的生长，并能分泌 激素促使植物细胞的分裂和伸长。通过拌种将“ 5406”抗生菌施于田间，具有防病、保苗和增产的效应。另一种放线菌的活体制剂 Mycostop ，是由芬兰的 Kemira(1989) 从泥煤中分离到的灰绿链霉菌 (Streptomyces griseovidis)的孢子和菌丝制成的制剂。主要用来防治一些常见的土传病原菌， 如腐霉菌、镰刀菌、疫霉菌(Phytophthora spp.)和丝核菌等。它还可用于控制温室中的观赏植物和蔬菜上的一 些常见病害，如由链格孢 (Alternaria spp.)、拟茎点霉(Phomopsis spp.)和灰葡萄孢(Botrytis spp.)等引起 的病害。 Mycostop 主要是通过种子处理、土壤喷洒或灌药等措施处理作物，它在植物的根部定殖、 生长和繁殖，从而阻止病原物的侵入，还可以产生激素促进寄主植物的生长，从而提高作物的产量， 对植物没有任何毒性。2. 抗生素的利用抗生素 (Antibiotics) 是微生物产生的、在低浓度下对其它微生物的生长有抑制或杀灭作用的一类