微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案.docx

1、微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案 编码：表 一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草 起草人： 起草时期： 年 月 日2.验证小组成员： 3.验证方案审核部门审核人日 期生产部生产车间QCQA4.验证方案批准 批准人： 批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效

2、性和重现性。2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“ ”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。3.试验实施3.1试验前的准备3

3、.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。3.1.3试验样品： 批号： 批号： 批号： 3.1.4培养基：培养基名称培养基批号配制日期有效期至改良马丁琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基胆盐乳糖增菌培养基 营养琼脂培养基3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115高压蒸汽灭菌30min。3.1.6验证用微生物名称及其编号 实验菌株的来源：

4、菌株名称控编号大肠埃希菌CMCC(B) 44102Ec-金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26003Sa-枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63501Bs-白色念珠球菌CMCC(F) 98001Ca-黑曲霉CMCC(F) 98003An-编号由菌名首字母传代代数制备日期组成。3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法4.1菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在3035下培养1824小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在2328下培养2448小时。将黑曲霉接种至改良马丁液体培养基中，在2328

5、下培养57天。将上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌落数为50100cfu的菌悬液。4.2实验方法供试液的制备：取样品10g（ml）加入无菌PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇使分散均匀，用匀浆仪混匀，置45水浴使胶囊壳溶化混匀，制成1：10均匀的供试液。A样品试验组取1:10供试液（相当1g或1ml供试品）10ml，加至100ml稀释液中混匀，过滤并用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，在最后一次冲洗液中加入50100cfu菌液，滤完后，将接有细菌的滤膜取出，菌面向上（接触细菌和样品的面）贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养

6、基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。B菌液组取上述制备菌液各1ml加至100ml稀释液中混匀，过滤并用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，滤完后，将接有细菌的滤膜取出，菌面向上（接触细菌和样品的面）贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。C供试品对照组取上述1：10供试液10ml，加至100ml稀释液中混匀，过滤并用稀释液冲洗滤膜3次，每次100ml，滤完后，将滤膜取出，接触样品的面向上贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上；白色

7、念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。D稀释剂对照组取PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜3次，每次100ml，在最后一次冲洗液中加入50100cfu菌液，滤完后，将接有细菌的滤膜取出，菌面向上贴于已凝固的培养基上。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌贴于营养琼脂培养基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基平皿上。4.3培养 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在3035下培养48小时，将白色念珠菌、黑曲霉在2328下培养72小时，点计菌落数。5.试验结果5.1产品试验组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称产品试验组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄

8、球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉5.2供试品对照组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称供试品对照组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉5.3稀释剂对照组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称稀释剂对照组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉5.4菌液组微生物生长检查情况： 批号： 菌种名称菌液组计数结果（cfu/皿）平均值大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉6.回收率计算6.1稀释剂对照组菌回收率菌种名称批号菌落计数（cfu/皿）回收率稀释剂对照组菌液组大肠埃希菌平均值金黄色葡萄球菌平均值枯

9、草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=稀释剂对照组的平均菌落数菌液组的平均菌落数100%。6.2试验组菌回收率菌种名称批号菌落计数（cfu/皿）回收率试验组供试品对照组菌液组大肠埃希菌平均值金黄色葡萄球菌平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（试验组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数）菌液组的平均菌落数100%。7.结论：7.1经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为 %、 %、 %、 %、 %。7.2稀释剂回收率为 %、 %、 %、 %、 %。 以上验证结果证明，本品 采用上述方法进行微生物限度检查

10、。检验人： 复核人：8.验证结果评价分析质控部负责各项验证、试验结果记录，验证小组根据验证、试验结果进行评价，起草验证报告，报验证委员会。验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书。对验证结果的评审应包括：（1） 验证试验是否有遗漏；（2） 验证实施过程中对验证方案有无修改，修改原因、依据以及是否经过批准；（3） 验证记录是否完整；（4） 验证试验结果是否符合标准要求，偏差及对偏差的说明是否合理，是否需进一步补充试验。9.最终审批验证报告由验证组长审核后，报验证总负责人批准，并签发验证证书。验证报告 年 月 日至 年 月 日，验证小组根据批准的微生物限度检查方法（薄膜过滤

11、法）验证文件对微生物限度检查法进行了相关的一系列验证工作，达到了预期效果，滋将有关事项说明如下：1、 验证方案在实施过程中未做修改。2、 验证方案各项性能指标在验证中未作变动，误差在允许围。3、 验证过程中结果符合规定要求，记录完整属实。4、 验证结果符合设计要求和GMP原则要求，可以投入使用。5、 组分或检验条件改变时须重新验证。以上情况，请验证委员会审批！验证小组：年 月 日试验报告审批表验证名称微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证编号验证容审阅会签质量部审核人： 年 月 日验证委员会意见：批准人： 年 月 日验证证书 验证证书编号： 验 证 名 称： 有 效 期： 上述方法已按验证方案进行验证，各项验证结果符合标准要求，批准按此方法进行本品的控制菌检查。特发此证。 验证总负责人： 年 月 日 备注：