手足口病预防控制指南版.docx

1、手足口病预防控制指南版附件1 手足口病标本采集及检测技术方案一、采集标本的种类、保存和运输（一）粪便标本。采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4暂存12小时内送达实验室，-20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。（二）咽拭子标本。采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密

2、封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。4暂存并在12小时内送达实验室，-20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。（三）血清标本。各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集EV71 和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。将血清置于-20以下冰箱中冷冻保存。（四）疱疹液

3、。在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本4暂存立即（12h内）送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。（五）肛拭子标本。采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放

4、入装有35ml保存液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。（六）尸检标本。采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。（七）脑脊液标本。出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0-2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，

5、4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。依照人间传染的病原微生物名录，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。在上送标本的同时，需附带相关的手足口病病例临床标本采样登记表。二、标本采集注意事项在手

6、足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离到病毒即可诊断该病毒为病因。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含5%牛血清维持液。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。标本保存液的配置见下表：保存液Eagles液(MEM)80.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml胎牛血清5.0ml7.5%NaHCO3溶液3.5ml青、链霉素（各10000U/ml）10ml三、实验室检测操作流程（一）病

7、毒分离。1.试剂配置（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：生长液（GM）维持液（MM）Eagles液(MEM)86.5ml92.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5ml青、链霉素（各10000U/ml）1.0ml1.0ml（2）粪便标本和肛拭子的处理液完全PBS液中加入PS溶液，终浓度为青霉素100单位/ml，链霉素为100g/ ml。完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即为完全PBS工作液。A液：试剂品名加入量NACL8.00gKCL0.20gNa2HPO4(无水)0.91gKH2P

8、O40.12g用600800ml蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至1000ml，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液（不含钙、镁离子）。B液：试剂品名加入量MgCl2.6H2O0.10g溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。C液： 试剂品名加入量CaCl20.10g溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。2病毒分离细胞系许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CVA16）生长。对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CVA16等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系： RD细胞，来源于人横纹肌肉

9、瘤细胞。 HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。3标本的处理（1）粪便标本和肛拭子的处理操作步骤：1）在离心管上标记标本号；2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml；4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于20；5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；7）在生物安全柜中将每1份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处

10、理1次）；8） 1管粪便悬液冻存于20作为备份，另1管存于4-8以备接种。（2）疱疹液标本的处理疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离。（3）脑脊液标本的处理脑脊液标本通常直接用于病毒分离。（4）咽拭子标本的处理咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。4接种和观察（病毒分离）（1）通常使用ml的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液1.

11、5ml。显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。一个健康的单层细胞会在传代后48小时左右形成；（2）倒掉生长液（GM），换上1-1.2ml的维持液（MM）；（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36。（或者使用吸附的方法接种病毒：接种标本前，倒掉生长液（GM），每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度为36；吸附1小时后，换上1.5ml的维持液（MM）。同样每份标本需同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞。（

12、6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，25%; 2+, 25%-50%; 3+, 50%-75%; 4+, 75%-100%）；（8）如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化（3+ CPE），然后储藏在20以备二次传代；（9）第一代培养见可疑细胞病变时应继续传代，待细胞病变稳定出现后20或70冻存；（10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明

13、显的CPE出现，将病毒保存在20冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定；（11）如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。（注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代）；（12）盲传两代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；（13）注意：如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取100l阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应；（14）几个概念：A：毒性反应：如果在接种后1-2d内细胞快速凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而

14、导致的非特异性毒性反应。这些已接种标本的试管应在-20冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。 B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿或抗生素处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。这时已接种标本的试管应在-20冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7-10d。如果盲传两代后仍然没有产生CPE，那么认为

15、这个标本是阴性的。5病毒分离结果解释RD细胞支持HFMD的主要病原体CVA16和EV71等多种肠道病毒的复制，CVA16和EV71均能在RD细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。但相同滴度的CVA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CVA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CVA16早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CVA16一般要经过2次以上传代才出现明显的CPE。若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致HFMD的病原体

16、，如一些柯萨奇B组病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖。（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度。比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常用方法，该方法精确且具有型特异性。作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清中肠道病毒中和抗体的滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。但是，肠道病毒隐性感染也很常见，所以在评估检测结果时就要小心一些。在中和实验中，一般要用人肠道病毒参考毒株（即原型株，EV71原型株为BrCr

17、株，CVA16原型株为G-10株）或流行株，有时同时（或单独）使用临床分离株会有助于得到更准确的检测结果。使用对肠道病毒敏感的细胞，如RD细胞。用病毒（血清）稀释液（下面液体配制中的C液，可用维持液代替）稀释血清和制备病毒悬液，因为是用病毒来确定血清中抗体的滴度，所以要使用参考病毒（原型株），但有时使用所分离到的毒株（临床分离株）有助于得到更准确的检测结果，但分离株的滴度（100 CCID50/0.05ml）要事先测定。中和实验的检测原理：病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形态学变化，出现CPE，特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制CPE的出现。1液体配制A液：血清处理液：（1

18、00ml中含下列试剂成份） MEM 85ml 3% L-谷氨酰胺 1ml 7.5%碳酸氢钠 2ml 胎牛血清 2ml 青、链霉素（各10000U/ml） 10ml B液：细胞营养液：（按生长液配方配制，100ml中含下列试剂成份） MEM 85ml 3% L-谷氨酰胺 1ml 7.5%碳酸氢钠 2ml HEPES 1ml 胎牛血清 10ml 青、链霉素（各10000U/ml） 1ml C液：病毒（血清）稀释液：（按维持液配方配制，100ml中含下列液体） MEM 93ml 3% L-谷氨酰胺 1ml 7.5%碳酸氢钠 2ml HEPES 1ml 胎牛血清 2ml 青、链霉素（各10000U/m

19、l） 1ml2攻击病毒CCID50滴定和滴度梯度制备（1）将增殖后的病毒悬液冻融3次，然后在4、12000rpm条件下离心10min，取上清液分装于10支冻存管中，每管1.5ml，一般每管应在一次试验中用完，有剩余应高压后废弃；（2）加Eagle液10倍系列稀释为10-1至10-8病毒液，各加入细胞板内，每孔50l，每稀释度4孔细胞；（3）每孔加细胞悬液50l，同时设细胞对照（50l稀释液+50l细胞悬液）， 36培养7d，观察细胞病变；（4）按Behrens-Krber公式计算出分离病毒株的CCID50；log CCID50 = L-d (S-0.5)，其中：L = 实验中使用的最低稀释度的

20、对数值；d = 稀释梯度的对数值； S = 终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。（5）正式试验前应先滴定攻击病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID50的病毒载量；（6）按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即100 CCID50/0.05ml）；（7）取3支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中的C液）0.9ml；（8）用带滤芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液（即100CCID50/0.05ml）到第一支小试管中，换另一支ART吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至1 CCID5

21、0/0.05ml和0.1 CCID50/0.05ml。3稀释血清（1）发病1-3d内采取患者急性期血清，发病后2-4周采取恢复期血清，分别冻存在-20备检。（2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中的A液）0.3ml，加待测血清0.1ml，盖紧塞子，震摇混匀，放4冰箱过夜，即为1：4稀释血清。次日56、30min灭活。（3）打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器吸取处理过的血清0.1ml加入第一孔（即为1：16），吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔（

22、即为1：64），依次至1：1024，血清稀释的过程中不必更换吸尖。即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。（4）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。4病毒中和抗体测定的操作步骤：（1）取一块96孔板横向使用，每块板可以做8份（4对）待测血清，版面设计如下图所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀释度的待测血清0.05ml，不必更换吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀

23、释度的待测血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀释度的待测血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀释度的待测血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀释度的待测血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H1

24、1-H12）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml；（2）上述孔中分别加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为100 CCID50/0.05ml）；（3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36 CO2孵箱中孵育2h；（4）另取一块96孔板纵向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的C液）0.05ml，然后从0.1 CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4冰箱中

25、暂存；（5）在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2105个/ml，每块96孔板至少需要准备10ml；（6）孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36 CO2孵箱中孵育培养；（7）使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100 CCID50/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果（约57d）；（8）注意：如果病毒对照结果（病毒回滴）不在32320 CCID50/0.05ml的范围内，实验无效，

26、就要重复实验。5结果判定当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。对于HFMD的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清EV71或CVA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关

27、实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1:256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1:128判定为可疑阳性。（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。1RNA提取可使用多种商业化试剂盒来提取RNA，针对临床标本应选择质量较高的“用于临床标本病毒RNA提取的试剂盒”，也可使用全自动RNA提取仪进行提取。针对病毒分离物，核酸提取比较容易，大部分商业化RNA提取试剂盒都可有效的提取到RNA。RNA提取依据使用的试剂不同，严格按说明书进行操作。2逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）（1）引物序列合成国家脊灰实验室自行设计3对引物，分别为人肠道病毒通用引物、EV71特异性引物和CVA16特异性引物。各省

28、CDC依据引物序列在质量有保证的公司合成,引物合成后,需要做预实验，保证引物合成没有质量问题后,分发给地市级CDC。1）人肠道病毒（包括EV71、CVA16）核酸检测通用引物序列：PE2（上游）：5- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3PE1（下游）：5- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -32）EV71核酸检测引物序列：EV71-S（上游）：5- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3EV71-A（下游）：5- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -33）CVA16核酸检测引物序

29、列：CVA16-S（上游）：5-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3CVA16-A（下游）；5-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3（2）实验设计1）在PCR记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与PCR仪排列的顺序一致。2）标记好加标本和对照的PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。A：阳性对照：参比RNA，省级CDC提供（只是在初次使用，常规不建议使用，以防污染）。B：阴性对照：使用正常细胞RNA或临床标本肠道病毒阴性的RNA（每次实验要设立）。C：试剂对照：用去离子水代替标本（试剂初次使用时必须做）。（3）RT-PCR扩增反应和条件1）从临床标本或病毒中提取的RNA和各种RT-PCR试剂应该一直放在冰浴盒上；2）配下列试剂主溶液：10PCR Buffer5.0ldNTPs（2.5mM each）2.0l上游引物（0.1g/l）1.0l下游引物（0.1g/l）1.0lRNA酶抑制剂（RNasin,40U/l）0.5lTaq DNA聚合酶（5U/l）0.5lAMV逆转录酶（10U/l）1.0l模板RNA