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1、LFY类基因在茎端分生组织形成及其活动中的作用LFY类基因在茎端分生组织形成及其活动中的作用Expression Pattern of LFY-like Gene and its Function in Shoot Apical Meristem Activity98级生命科学学院 细胞生物与遗传学系 刘曼摘 要 LFY类基因在植物形态建成过程中具有重要作用，根据其突变体的特征，曾一度被认为是在花分生组织和花序分生组织中特异表达的“分生组织特征决定基因”，控制花序分生组织向花分生组织的转变。但随着研究的深入，人们发现其在营养分生组织甚至胚胎发生过程中都有所表达。本实验试图通过启动子活动特点研究

2、、mRNA水平上原位杂交分析等各种方法，对其功能进行深入地探讨，以期全面地认识该类基因在植物发育中的作用。Abstract LFY-like genes play important role in plant development, when they were first isolated from mutants of Antirrhinum and Arabidopsis, they were thought to be “SAM-specific-determinating-genes”, regulating the transition from inflorescence t

3、o flower meristem. However, further research revealed that LFY-like genes activity can be found in embryogenesis, shoot apices and axillary buds at different stages as well as in flower primordial. We characterized LFY promoters activity and investigated LFY mRNA expression with Whole-mount in situ

4、Hybridization, in order to make their function clearer. 引言 植物形态建成有与动物形态建成完全不同的特点：其完成生活周期所需的地上部分基本器官类型都是由茎端分生组织（shoot apical meristem, SAM）的活动而逐步形成的。因此，茎端分生组织在植物形态建成中的重要性是不言而喻的。但长期以来，虽然人们始终在努力，而且近十年来出现了分离得到茎端分生组织活动相关基因等重大的突破1，可目前在茎端分生组织的形成变化及其终结方式等基本问题方面却仍然没有得到合乎逻辑的解释。根据突变体研究的早期结果，人们形成了目前占主导地位的观点，即茎端

5、分生组织在“胚胎发生”过程中形成，随后在“胚后发生”的过程中，被一些“分生组织特征决定基因”控制，逐步由“营养分生组织”改变为“花序分生组织”和“花分生组织”2。但随着研究的深入，人们逐渐发现，一些过去被认为是在“花分生组织”和“花序分生组织”中特异表达的“分生组织特征决定基因”，大部分都不用程度地在“营养分生组织”甚至“胚胎发生”过程中表达3-7。这些现象是现有的假说所无法解释的。显然，这些新的发现对现有的观点提出了不可回避的挑战。只有通过对这些基因表达特征及其功能的深入研究，我们才有可能真正从分子水平上逐步解释茎端分生组织形成、活动及其终结的分子机理并从中逐步揭示茎端分生组织在植物形态建成

6、中所扮演的角色。 LFY类基因正是上述基因中的一种。它的突变导致植物表型发生一系列的变化。在野生型植物体中应发育成花的部位，在lfy突变体中则发育出花序，或是仅由萼片和花瓣组成的异常花。而且LFY和APETALA1或APETALA2的双重突变体会导致植物的花完全丧失野生型花所具有的缩短节间、顶端有限生长等特点。根据以上种种现象，当LFY类基因从金鱼草和拟南芥的有关突变体中分离出来时，被认为其在植物发育中控制茎端分生组织从花序分生组织转变为花分生组织2，8。但随着该基因的同源序列从其他植物中被陆续分离，人们发现在烟草、凤仙花、豌豆、矮牵牛、水稻、松树等植物中，LFY类基因的表达并不局限于花分生组

7、织，而是广泛地存在于不同发育阶段的茎端分生组织3-6，9，10。更重要的是，后来的研究表明，即使在拟南芥中，LFY基因实际上在其早期的发育阶段，即在花序分生组织形成之前，已经在茎端分生组织中表达11。同时，转基因实验表明，LFY基因表达量越大，植物开花越早12，13。因此，对该基因的功能又有了一种新的认识，即它不仅决定花序分生组织转变为花分生组织，而且还影响开花的早晚。 白书农教授等在进行另一种拟南芥突变体emf的研究中，曾注意到LFY基因在植物早期发育阶段表达中的特点，并曾利用LFY:GUS转基因植物为材料，对其在植株“营养生长”阶段的表达特点进行过系统的研究白书农等，未发表资料，1998。

8、发现LFY基因的启动子不仅在种子萌发后不同阶段的茎端分生组织和幼小的器官原基中表达，而且在早期胚胎发生过程中也有表达。最为引人注目的是，LFY基因启动子的活动与由根外植体再生植株过程中茎端分生组织的形成及其活动存在直接的相关。据此白书农教授等提出，LFY基因的表达很可能与茎端分生组织的形成及其活动有关，而它表达量的增长水平和开花相关联。 但是，有研究表明，以GUS等报告基因所显示的启动子活动模式可能并不一定反映该启动子对其原有基因表达的时空调节模式。因为基因的表达不单需要启动子的活动，还和一些其他因子，例如内含子等有关。因此，要真正了解LFY基因在分生组织形成与活动过程中的表达特点，还应有对其

9、转录产物即mRNA进行原位检测的证据。本课题即是在本实验室过去工作的基础上，试图从正常植株与组培过程再生植株中LFY启动子活动方式的检测和LFY基因转录产物的直接检测两个方面，对LFY类基因早期表达特点及其可能的功能等关键问题进行进一步地探讨。本课题研究中主要涉及两种基因表达的检测技术。当研究LFY启动子活动方式时，我们采用报告基因的表达分析方法。报告基因通常编码一个在离体条件下易于检测的酶，或者编码可以在活体条件下进行组织化学定位的蛋白，这样就可以提供基因表达定量的和定性的信息。gusA基因是从大肠杆菌（Escherichia coli）中分离出来的，并且目前有一些基因盒可以允许在gusA基

10、因的附近插入启动子区，产生转录融合基因或翻译融合基因。我们实验所用的Plfy:GUS拟南芥和Plfy:GUS烟草、Pnfl:GUS烟草即是在gusA基因前插入LFY或NFL基因的启动子（Plfy或Pnfl），当Plfy或Pnfl活动时，带动gusA表达，利用一个简单的组织化学检测就可以精确地分析gusA融合基因的时空表达模式。用5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸（X-gluc）作为底物可以精确地进行GUS活性的定位，这一反应分两步进行：首先是切割葡糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。用GUS进行这类实验有如下优点：（1）在大多数植物组织中GUS活性

11、的本底低；（2）反应产物不扩散，在表达基因的植物细胞内积累；（3）通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。当然，也存在一些缺点：（1）组织化学染色后植物失去继续培养的可能，这样不能跟踪检测同一株植物不同时期的基因活动情况；（2）由于酶和产物非常稳定，因而不能真实的反映出GUS替代的那个蛋白在稳定状态下的丰度；（3）人们发现在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应中间产物渗漏的现象，但是，这可以通过在底物溶液中加入氧化剂高铁氰化钾或亚铁氰化钾或者二者都加（终浓度为5mmol/L），来使这种渗漏减至最少（Stomp 1990; Masarenhas和Hamilton 1992）；（4）同

12、所有的组织化学方法一样，其检测结果不是定量的。而且，最致命的缺点是，启动子的分析不一定总能反映基因的真实活动情况（如前文所述），这是在运用报告基因方法进行基因表达特征分析时必须注意的一个问题。当检测LFY基因的转录产物时，我们用到了原位杂交 （in situ Hybridization, 简称ISH）技术。该技术最早是由Gall和Pardue (1 969)及John等 (1 969)独立发明的。其基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则 （A-T, C-G）,将有放射性或非放射性标记的外源核酸 (探针：Probe )与染色体上经过变性后的单链DNA互补配对 ,结合成专一的核酸杂交分子 ,再经

13、一定的检测手段 ,将待测核酸在染色体上的位置显示出来。我们采用的mRNA水平的原位杂交技术，是将含有目的基因cDNA的质粒分别用限制性内切酶从目的片断的两端单切，使质粒线性化。然后从两端用不同的转录酶按照A-U, C-G的互补配对原则合成一段RNA片断，其中UTP上标记地高辛，这标记上的RNA片断即为探针。当目的基因表达时，mRNA能和反义探针特异性结合，在底物的作用下显色。而正义探针为负对照。由于 RNA原位杂交技术能够精确确定基因表达的时空分布，而植物基因的时空表达研究是探讨植物生长发育机制的重要手段，所以在以研究植物发育机制为主的本实验室，原位杂交成为一项主要的并十分关键的技术。 目前植

14、物研究中，原位杂交得到了越来越广泛的应用，主要有 3种方法 :一是常规组织切片RNA原位杂交，广泛适用于各种组织 ;二是大量细胞的整体RNA原位杂交 ,已应用于花粉管和藻类合子;三是微量细胞的整体RNA原位杂交 ,用于分离胚囊。我所使用的整体原位杂交技术，是一种较新的组织RNA原位杂交方法。该方法的实验材料是具有完整形态结构的植物器官或其组合，如花、花序等。该技术能够直接从整体结构上观察到基因表达的空间特征，具有易操作、周期短等特点，并避免了一般在切片上原位杂交所需的三维重构步骤。材料和方法1 实验材料1.1 植物材料野生型拟南芥种子（Columbia）Plfy:GUS转基因拟南芥种子（由De

15、tlef Weigel提供）野生型烟草种子（Nicotiana tabacun var. Wisconsin 38）Plfy:GUS转基因烟草种子（由本实验室毕业博士生刘复权构建、提供）1.2 菌种和质粒大肠杆菌DH5质粒：Pnfl:GFP (Kan R )Plfy:antiLFY(Kan R )PDW124-LFY (Amp R )以上质粒均由本实验室已毕业博士生刘复权构建，本实验室保存。 1.3 分子生物学和生化试剂各种限制性内切酶购自TaKaRa 公司，PCR试剂购自鼎国生物公司，原位杂交地高辛标记RNA探针试剂盒及杂交液（DIG easy Hyb）购自Roche生物公司，各种激素和抗生

16、素以及x-Gluc购自北京经科生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯。1.4 PCR引物 以GFP基因为模板的PCR引物由本人设计，上海生工生物工程公司合成。 5GFP (21bp):5-GGT GAA GGT GAT GCA ACA TAC-3 3GFP (18bp):5-GAA AGG GCA GAT TGT GTG-3 1.5 x-Gluc 染色液(1mL) N、N二甲基甲酰胺 50uL x-Gluc 0.5mg 100mM 磷酸缓冲液 pH7.0 980uL 5mM 铁氰化钾 10uL 5mM 亚铁氰化钾 10uL Triton x-100 1uL 1.6 植物叶绿素透明液 乙醇：乙酸=

17、9：1 1.7 培养基 1.7.1 拟南芥、烟草组织培养基 MS (含3%的蔗糖和0.75%的琼脂，调pH=5.8)愈伤组织诱导培养基（Callus-Inducing Medium, CIM）: B5+0.5mg/L 2,4-D + 0.05mg/L KIN (含2%的蔗糖和0.75%的琼脂，调pH=5.5)生芽培养基（Shoot-Inducing Medium, SIM）: B5+0.15mg/L IAA + 5mg/L2ip (含2%的蔗糖和0.75%的琼脂，调pH=5.5) 1.7.2 细菌培养基 LB培养基：每升培养基含5克酵母提取物，10克蛋白胨，10克氯化钠，pH=7.5，固体培养

18、基含1%琼脂 1.8 原位杂交所需试剂 PBS: 0.13M NaCl, 0.007M Na2HPO4 ,0.003M NaH2 PO4 , 0.27mM KCl, pH 7.4 PBT: PBS+0.1% Tween 20 固定液 (FB): PBT+0.08M EGTA, 5%多聚甲醛, 10% DMSO (pH 7.4) NTE: 500mM NaCl, 10mM Tris-HCl (pH7.5), 1mM EDTA 封阻液 (BS): PBT+ 2% BSA 渗入液 (SB): 100mM NaCl, 50mM MgCl2 , 100mM Tris-HCl (pH9.5), 0.1%

19、Tween 20 停止渗入液 (SSB): PBT+20mM EDTA 2 主要方法2.1 质粒载体构建部分2.1.1 原质粒的酶切将Plfy:antiLFY，Pnfl:GFP用XbaI和SacI双切，得到Plfy-载体和GFP片断。2.1.2 从凝胶中分离纯化DNA片段(1) 切下含有DNA片段的胶块，转移到1.5 ml 离心管中, 于70温育直至胶完全融化. 加1 ml 树脂(resin), 混合20秒.(2) 去掉注射器上的推进器，将Minicolumn安上。(3) 将树脂/DNA混合液移入注射管中，慢慢插入推进器，轻轻将悬浮液推进Minicolumn中。(4) 从Minicolumn去

20、掉注射器，取出推进器。再安注射管于Minicolumn上。加2m1的80%异丙醇于注射管中洗Minicolumn。插入推进器，缓慢将异丙醇推过Minicolumn。(5) 去掉注射器，将Minicolumn放在1.5ml离心管中，离心2分钟，使树脂/DNA干燥。(6) 将Minicolumn移入一个新的离心管，加50ul水或TE，放置1分钟，离心20秒，溶下DNA片段。(7) 仍掉Minicolumn.纯化的DNA储藏于4或-20。2.1.3 连接在冰上建立如下连接体系: 2*T4 DNA连接酶Buffer 5uL Plfy-载体 1uL GFP 3uL T4 DNA连接酶 1uL轻轻混匀后，

21、4连接过夜。 2.1.4 大肠杆菌DH5感受态细胞的制备(1) 从LB平板上挑取E.coli DH5单菌落接种于2mL LB液体培养基中，37振荡培养过夜，取100-200uL菌液于2mL LB中，37振荡培养2-3小时后全部转入100LB中，37振荡培养2-3小时至对数生长期(OD600=0.4左右)。 (2) 无菌条件下转入1.5mL Eppendorf，冰浴10min。(3) 4 4000rpm 8min，回收细胞。(4) 用400uL冰预冷的CaCl2 (0.1M)重悬沉淀，置于冰上15-30min。(5) 4 4000rpm 8min，回收细胞。(6) 用100uL冰预冷的CaCl2

22、 (0.1M)重悬沉淀，备用。 2.1.5 转化(1) 100uL感受态细胞中加入1.5uL质粒，轻轻旋转，混匀内容物，冰上 置30min。 (2) 42水浴90s，不要摆动试管。 (3) 快速将试管转移至冰上，冷却2min。 (4) 每管加入200uL LB，37振荡45min1hr。 (5) 涂板(Kan)。 (6) 至液体完全吸收后，倒置平板，37培养。 2.1.6 提质粒 用小量碱法提取质粒：(1) 取1.5mL菌液转移至Eppendorf管，于4，12000rpm离心30”。(2)吸去上清，空气干燥沉淀。沉淀悬浮于100ul溶液中（25mM Tris-HCl pH8.0, 10mM

23、EDTA, 50mM葡萄糖）中，振荡混匀室温放置5分钟。(3)假如200ul溶液（0.2M NaOH, 1%SDS），放冰浴中5分钟。(4)再加入150ul溶液（3M NaAc, pH4.8），放冰浴中5-10分钟，12000rpm 4离心5分钟。取上清加等量酚：氯仿，振荡，4，12000rpm 2分钟。(5)取上清加2倍体积乙醇，振荡，置2分钟。(6)4，12000rpm 2分钟，吸去上清，沥干。(7)加1mL 70%乙醇洗涤2次。(8)用50ul TE溶解（加入1ul Rnase）。 2.1.7 酶切鉴定及PCR鉴定 所用限制性内切酶及PCR引物如前2.1.1及1.4所述。 2.2 GUS

24、活性的组织化学定位部分 2.2.1 组织培养(1)将植物长出两周的主根切下成5-10mm的小段，转移至CIM中诱导其长愈伤。(2)三周后，将愈伤组织转移至SIM中诱导其长芽。(3)设未转基因植物作负对照，对照和处理之间的培养条件要完全一致。(4)不论在CIM中还是在SIM中，培养基要每1-2周续代一次，及时更新。(5)注意大量培养，在由CIM转移至SIM的同时，应保留一部分材料作CIM续代，以此作为SIM培养下的处理的另一种对照。(6)实验过程中特别要注意无菌操作！ 2.2.2 GUS活性检测(1)当植物的根在CIM中培养时，每隔2-3天作一次GUS组织化学染色进行跟踪监测。(2)当愈伤组织在

25、SIM中培养时，每隔一周左右作一次检测。等到长出再生芽和再生根时，切下芽和根分别作检测。(3)未转基因的对照必须和处理始终同步进行。(4)设置重复，至少3-5次。(5)具体方法：a. 无菌操作，将要检测的植物部位小心切下来，转入GUS染液，使材料和染液的体积比1:5。b. 真空处理2-10分钟。c. 放入37恒温箱中温育12-16小时。d. 待GUS渗入材料中后，材料转入透明液中透明，放置于室温下3小时。 2.2.3观察和照像 经透明处理后的植物材料在Motic 解剖镜下观察，有GUS表达的部位显 现稳定、不溶于透明液的蓝色。解剖镜上接理光XR-X 2000相机照相， 相片通过Acer Sca

26、nPrisa 640U型扫描仪输入电脑，由Adobe Photoshop 6.0 作适当处理。2.3 整体原位杂交2.3.1 探针标记 限制性内切酶消化质粒LFY：antisense BamH1Sense KpnI(1)37C 消化2小时，电泳检查线性化是否完全；(2)加等体积酚-氯仿，混匀；(3)12000转离心10分钟，收集上清，(4)加2倍体积无水乙醇（预冷），混匀，-20C，30分钟；(5)12000转离心10分钟，弃上清，(6)加70%乙醇（预冷），弃上清，(7)真空干燥，沉淀溶于10微升无菌水中；(8)电泳检测。体外转录(1)每个反应体系内含：模板4微升，5*缓冲液4微升，DTT2

27、微升，RNA Block 1uL，5*NTP 4微升，Polymerase 2微升，DEPC-H2O 3微升。37C 2小时。LFY： antisense T3Sense T7(2)Dnase I 于37C处理15分钟以除去模板，每个体系加 2.5微升的3M NaAc和75微升的预冷的无水乙醇，-20C 过夜，(3)4C 下离心15分钟，13000转；(4)70%预冷的乙醇沉淀一次，吹干后溶于50微升DEPC-treated H2O。碱性水解(1)50微升探针加50微升碳酸缓冲液，60C 水解，LFY45分钟， 每管加10微升5%乙酸，置冰上；(2)每管加11微升的3MnaAc，200微升预冷

28、无水乙醇，-20C 过夜；(3)4C 下离心15分钟，12000转；(4)70%预冷的乙醇沉淀一次，吹干后溶于50微升甲酰胺。2.3.2 原位杂交(1)固定FB 30min甲醇 2次 5min乙醇 4次 5min(2)杂交预处理乙醇 2次 2min1:1 乙醇:二甲苯 30min乙醇 2次 5min甲醇 2次 5min1:1 甲醇:PBT 10minPBT+5%甲醛 30minPBT 3次 2minPBT+40ug/mL 蛋白酶K 10-15minPBT+0.2% 甘氨酸 5minPBT 2次 2minPBT+5% 甲醛 30minPBT 4次 2min1:1 PBT:HS 10minHS 2

29、次 2min预杂交 2hr 60(3)杂交400uL HS + 3uL RNA probe + salmon tests DNA (100ug/mL)（探针和salmon tests DNA预先85变性5min）16-20hr 60(4)杂交后处理HS 2次 30min 551:1 HS:NTE 60minNTE 60minNTE 2minNTE+40ug/mL Rnase A 45min 37NTE 15min 37NTE 5次 15min1:1 NTE:PBT 20minPBT 2minBS 至少30min(5)检测anti-DIG抗体处理a. 等量混合固定后的和新鲜材料+少量冰冷90%丙

30、酮，液氮中磨成细粉b. 加入更多90%丙酮，使劲混合均匀，4储存过夜c. 13,000g 5min离心，弃上清。在少量90%丙酮中重悬沉淀，将沉淀分散于一滤纸上，风干d. 在30mg干粉中加入400uL BS和20uL anti-DIG Fab fragment，室温黑暗中24hre. 10,000离心3min信号检测BS 100uL中加入1uL e中上清，4过夜新鲜BS 10minPBT 4次 60minSB 2次 5min1mL中加入8uL Roche公司的nitro blue tetrazolium chloride + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosph

31、ate 5-60min黑暗中显色显色完毕后用SSB终止反应 (6)观察和照像用甘油:PBS 7:3 溶液封片，在OLYMPUS显微镜下观察并照像，相片通过Acer ScanPrisa 640U型扫描仪输入电脑，由Adobe Photoshop 6.0作适当处理。 实验结果1. 拟南芥中LFY启动子活动特点的验证 白书农教授等早年曾利用Plfy:GUS转基因拟南芥为材料，系统检测过在植物发育早期的SAM中和以根为外植体的植株再生过程中Plfy的活动特点。我首先重复了该实验，以便熟悉各个步骤和操作，同时也进一步验证该实验的可重复性。 实验方法如2.2中所述，结果见图1所示。早在幼苗长出的第二天，GUS活动就在SAM中表现出来（图1-A）。而在茎的其他部位、成熟的叶片和根中，没有Plfy的活动（图1-B）。为了避免SAM中已存在的GUS活性干扰，本实验以无GUS活动的根为外植体进行植株再生。当将根移入CIM中诱导愈伤时，第二天就在成熟根外周区域有细胞分裂的地方发现了微弱的GUS表达（图1-D）