细菌分类学研究进展.docx

1、细菌分类学研究进展细菌分类学研究进展一. 分类学组成及各组成间的关系：1.分类学组成：分类学由鉴定、命名、归类三部分组成，也称之为分类学三大要素。2.三组成间的关系：3. 系统分类学(Systematics) 系统分类学=系统发育学(Phylogenetics) + 分类学(Taxonomy)二. 分类学发展的动向：1. 鉴定 1). 多相分类 多相分类是由Colwell等(1970)提出，以各类信息用于分类， 2). 数值鉴定与数值分类：数值鉴定 数值分类(Numerical taxonomy) 数值分类必需借助于计算机，所以又称计算机分类学(Computer taxonomy)。 2. 命

2、名 命名是分类学的重要组成部分。顾名思义是给细菌起名，但必须遵循国际细菌命名法规(International Code of Nomenclature of Bacteria)。法规规定了命名的严格方法和程序。法规目的在于名称的稳定和统一；主要的精神是法规的优先律，给予正确命名者优先杈；重要内容是模式(type)，即发表名称时所依据或具有代表性的菌株。 1). 分类单位的等级 2). 分类单元的命名 。 3). 命名的模式及指定 4). 名称的发表和优先权 3. 归类 归类时必须依据一定的分类体系。历来有很多的体系，每个体系各有特点：1). Bergey系统介绍2).苏联的Kapacunuko

3、b(1949)，以形态为主，主要用于放线菌早期分类。3).法国的Prevot(1961)，以生理为主，种的范围往往划得很小，厌氧菌分类常常用它。4).着重于医学细菌的鉴定有“医学细菌鉴定手册”和“临床微生物手册”，自1970、1974、1980、1985、1991和1995年已陆续出版了六个版本。三. 细菌分类学发展趋势： 由于其它学科渗入，从研究的深度和广度都有很大的发展，尤其是近十几年来，PCR技术，使得16s rRNA全序列分析广泛应用于不同分类阶元水平的亲缘关系的研究。鉴定方法发展，无疑使分类系统更趋客观。表现在：1. 宏观微观究更为透彻。2. 从表面内在 附件1 核酸技术附件2 细胞

4、组成分析技术附件3 微生物分类中系统发育分析技术细菌分类学研究进展二.分类学组成及各组成间的关系：1.分类学组成：分类学由鉴定、命名、归类三部分组成，也称之为分类学三大要素。鉴定是由未知菌与已知菌相比较，目的是能说出未知菌是A，而不是B或其它的已知菌；命名是对鉴定菌按命名法给予一定的名称，以示区别于其它；归类(分类)是给予鉴定物在系统中的地位，同时也探索各分类单位间的关系。2.三组成间的关系： 分类学令域 Taxonomy 图1 分类学三要素间的关系1)鉴定(Idenitification)：根据已有的数据库包括形态、生态、生理、生化、分子生物及基因等资料与未知的鉴定菌相比较。如相同或相似，则

5、给予已知的菌名；如不相同，则考虑新的分类单位。2)命名(Nomenclature)：给予新分类单位遵循国际命名法规(Internation Code of Nomenclature of Bacteria)命名。命名时首先将名称拉丁化，同时必需考虑名称的优先法在“Internation Journal of Systematic Bacteriology”(2000年改名为“Internation Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology”)杂志上发表，才能获得名称的有效性。3)归类(Classification)在经比较后，才能确

6、定鉴定物与其它分类单位关系的合理的地位。 3. 系统分类学(Systematics)的提出 在分类学的内容中已包含了系统发育，这个名词也早在协会的名称中出现，例国际系统细菌学委员会(International Committee on Systematic Bacteriology)，但实质性的含义直到九十年代Woese工作之后，才有可能真正的赋与。系统分类学=系统发育学(Phylogenetics) + 分类学(Taxonomy)细菌系统发育是指细菌进化的历史，细菌系统发育学是研究细菌自然的相互关系，并最终分析细菌的起源和进化的一门学科。 图2 系统分类学组成的内容 Molecular se

7、quences 系统发育学(Phylogenetics) Multiple alignments Phylogenetic inference系统分类学 Systematics Classification分类学(Taxonomy) Nomenclature Identification 以系统发育学为基础的分类体系，例“The Procaryotae”1ed .& 2ed.三.分类学发展的动向：鉴定 1. 多相分类 多相分类是由Colwell等(1970)提出，以各类信息用于分类，包括表型和基因型性状以及系统发育性状。它们间的关系可见图3 。各类性状阐明不同分类水平的问题，见图4 。历年来，

8、我们的分类都是采用多项分类，所用特征包括图 3 中所示，由于基因性状技术复杂，不可能普遍应用。因此，常常是在各项表型性状经过数值归类后，选出簇群的中心株或代表株再进行基因性状(DNA的GC含量、DNA/DNA或/和DNA/rRNA同源性测定)。例如，我们80年代进行的嗜热脂肪芽孢杆菌的表型群和基因型群间关系；90年代芽孢杆菌的分类研究都是用这种模式进行的。以后在实例中再详述。 图3 基因型与表型特性间的关系 总DNA 。G+Cmol% ，DNA/DNA杂交 碱基序列 。限制图谱(RFLP,PFGE,AP-PCR) LMW RNA图形 。基因大小 DNA片段： 。PCR建成的DNA指纹图 (RF

9、LP,RAPD,AFLP) 。DNA探针 。DNA 序列 m mR 。总细胞或细胞酶蛋白电泳图谱。酶图谱(多酶电泳) 细胞脂肪酸 形态 分枝酸 生理 极性脂肪 酶(MLEE,全细胞蛋白电泳) 醌 数值分类 细胞壁组成 血清 胞外多糖 图4 各类性状(信息)阐明分类单元的功能 科 属 种 株 性状(技术) 限制性片段长度多态(RFLP)表型(数值分类)DNA扩增(AFLP,AP-PCR,REP-PCR,RAPD)噬菌体和杀菌素分型血清学技术多位酶电泳(MLEE)全细胞蛋白电泳DNA-DNA杂交G + C克分子%化学分类指标细胞脂肪酸指形图谱细胞壁结构rRNA序列DNA探针DNA序列 2. 数值鉴

10、定与数值分类： 1) 数值鉴定 根据鉴定对象采用一定数目试验制成的试验卡(card)接种，适温培养一定时间后，将所得的结果以数字方式表达，并与数据库数据对照，而获得鉴定结果。使未知菌的鉴定更加简易、微量和快速，对满足临床需要提高了一大步。目前最常用的细菌编码鉴定系统有很多： (1) Micro-1D(肠杆菌科细菌微量鉴定系统) 包括15种生化反应； (2) Minitek鉴定系统 包括32种生化反应； (3) Minibact鉴定系统 用于肠杆菌细菌的鉴定，包括16种生化反应； (4) Bio-Test鉴定系统 用于肠杆菌细菌及非发酵菌的鉴定，包括24种生化反应； (5) Biolog鉴定系统

11、 有G- 和G+ 二种试验卡，根据鉴定菌选用，每个卡包括95个测定的96孔板，以所得结果与数据库对照，可得菌名，同时还可得到与相关菌的关系。 (6) API 鉴定系统(Analytic Products Inc的简称) 是目前国内外应用最广泛的一种，以鉴定菌种广泛和结果正确而著称。由法国生物梅里埃(bioMerieux)公司生产。用新型呈色(荧光)底物快速检验细菌的胞内或胞外酶。 胞内或胞外酶 色原(荧光)糖苷结合物 糖苷 + 色原(荧光) 胞内或胞外酶 色原(荧光)氨基酸结合物 氨基酸+ 色原(荧光)可分四类产品介绍 ：第一类 快速鉴定系统 只需2小时，例Rapiden2系列对沙门氏菌志贺氏

12、菌和耶尔森氏菌仅用3个生化反应就可鉴别；API NH系列对奈瑟氏菌和嗜血杆菌用12个生化反应就可鉴别。第二类 特定菌属(群)的鉴定系统 对肠杆菌的API 20E、对非肠道的G-杆菌的API 20NE、对厌氧菌的API 20A、对酵母菌的API 20C AUX、对棒状菌的API Coryne、对葡萄球菌和微球菌的API Staph、对链球菌及有关菌的API Strep、对弯曲杆菌的API Campy、对李斯特氏菌的API Listeria等用20个生化反应，一般在24小时，少数延长至2-3天，观察结果。第三类 ATB (Automatic Testing Bacteriology)系统 该系统是

13、将API手工方法电脑化，以减少人为读取误差和工作强度，可自动读取鉴定和药敏试验的结果，使用时需将鉴定板与自动化仪器结合起来。 系列名 用途 时间 鉴定种类 测定项目Rapid 1D 32 E 肠杆菌 4小时 73 32Rapid 1D 32 GN G-杆菌 24小时 98，只用电脑 32 Rapid 1D 32 C 酵母样真菌 1-3天 63 32Rapid 1D 32 Staph 葡萄球菌和微球菌 24小时 32 32 Rapid 1D 32 A 厌氧菌 4小时 76 32Rapid 1D 32 Strep 链球菌和有关菌 4小时 56 32 Fungus 真菌药敏测定 24小时 6种抗生素

14、UR 测定尿液菌群对 4小时 15 抗菌素敏感性 Staph 葡萄球菌 18-24小时 14 Pse 假单胞及有关菌 18-24小时 14 Strep 链球菌属 18-24小时 14 ANA 厌氧菌 18-24小时 14 GB 芽孢杆菌 18-24小时 14(7) 多邦公司新近推出的以分子生物学技术为基础的鉴定仪。(8) 惠普公司的以化学分类气相色谱技术为基础的鉴定仪。2) 数值分类(Numerical taxonomy) 数值分类必需借助于计算机，所以又称计算机分类学Computer taxonomy)。(1)Sneath(1958) 对数值分类学的基本原则作如下概括：i)一个分类群中的信息

15、量越大，即分类所依据的性状越多，其分类效果越好。ii)建立自然分类单元时，每个性状在计算中都是等重要的，这与传统分类完全不同的。iii)任何两个分类实体间的整体相似性，都是有每一对性状相似性计算而来的。iv)数值分类学是以表型相似性为基础的。(2)实践 可分成五个步骤：i)有用性状的选取 选取对操作分类单位 图5 实践的程序 (Operational Taxonomy Unite)有鉴别意义的性状。ii) 性状编码 性状编码是一个重要的步骤，对 两态性状十分简单：常用的阳性结果为“1”、 阴性结果为“0”。iii)相似性计算 在数值分类过程中，需要对全部菌株比较任意两者之间的相似程度，这是分类

16、的基础。相似性是通过相似系数计算而得，目前人们已设计了大量的相似系数，常用的有以下两种：Sokkal和Michener(1958)简单匹配系数： a +d Ssm= a+b+c+d Jacard(1901) 系数： a Sj= a+b+c“a”为两菌株均呈正反应的性状数；“b”为菌株甲呈正反应而菌株乙呈负反应；“c”为菌株甲呈负反应而菌株乙呈正反应；“d”为两菌株均呈负反应的性状数； IV) 聚类 聚类方式有：单链锁聚合、全链锁聚合、平均链锁聚合、中线链锁聚合、形心聚合、平方和增量法聚合和可变法聚合。常用的前三种，根据不同要求而选用。 V) 输出分类结果 (i) 树状谱(dendrogram)

17、 是表示分类结果最常用的方法之一，它反映了等 级分类中逐次聚合的全过程。 (ii) 三角距阵图(Similarity metrices) 是在树状谱的基础上表示分群关系的一种方法。命名命名是分类学的重要组成部分。顾名思义是给细菌起名，但必须遵循国际细菌命名法规(International Code of Nomenclature of Bacteria)。法规规定了命名的严格方法和程序。法规目的在于名称的稳定和统一；主要的精神是法规的优先律，给予正确命名者优先杈；重要内容是模式(type)，即发表名称时所依据或具有代表性的菌株。 1. 分类单位的等级 所有细菌都置于原核生物界(Procaryo

18、tae)，继之有门、纲、科、属、种，有的还有亚种、生物变种、血清变种、致病变种、噬菌体变种、形态变种及菌株等。以钩端螺旋体为例，列于表 1。 表 1 分类单元的等级 名 称 举 例 结尾 界(Kingdon) 原核生物界(Procaryotae)门(Phylum)或(Division) 薄壁菌门(Gracillicutes)纲(Class) 暗细菌纲(Scotobacteria)目(Order) 螺旋体目(Spirochaetales) -ales科(Family) 螺旋体科(Leptospiraceae) -ceae属(Genus) 钩端螺旋体属(Leptospira)种(Species)

19、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)生物变种(型)biovar(biotype)血清变种(型)serovar(serotype) 致病变种(型)pathvar(pathtype)形态变种(型)morphovar(morphotype)株(strain) 2. 分类单元的命名 所有分类单元的学名必须作拉丁文处理，采用双名法。属以上的名称都是名词、阴性、复数；种名是属名后接一单个的种的词所组成，可以是形容词，必须与属名的性别一致。后面是命名人的名字和名称发表的日期。例“Staphlococcus aureus Rosenbach 1884”意味着Rosenbach 在18

20、84年正式命名了金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)，属名和种名应以斜体字示明拉丁文。 3. 命名的模式及指定 对各种分类类目，每一个已命名的分类单元，应指定一个命名模式，亦称之模式(Type)是分类单元，永远和该名称联系在一起。模式不一定是该分类单元中最典型或最具代表的有效发表。 4. 名称的发表和优先权 发表名称有几种：合法发表，指与诸规则相符；有效发表，指科学界一般能得到的印刷材料；合格发表，指符合名称裁决委员会规定必须在IJSB(International Journal of Systematic Bacteriology)和IJSEM(Internationa

21、l Journal of Systematic and Evulotionary Microbiology)上的有效发表。 优先权 每个分类单元只有一个正确的名称，那就是符合法规的最早的那个名称，优先权以1980年1月1日以前发表的细菌名称优先权问题。已由国际系统细菌委员会下属的裁决委员会负责组织的一个特别委员会进行整理，最终以“细菌名称确认名录”在1980年IJSB上已公布。1980年以后的名称以在IJSB上发表的时间次序为准。归类 归类时必须依据一定的分类体系。历来有很多的体系，每个体系各有特点：1. Bergey系统介绍 细菌分类系统不少，在国际上应用最广泛和最具杈威性的是伯杰（Berg

22、ey）氏体系，代表著作伯杰氏细菌鉴定手册（以下简称手册）是由美国细菌学家协会所属的伯杰氏手册委员会主编的，自1923年第一版以来，相继于1925、1930、1934、1939、1948、1957、1974、和1994年5陆续出版九个版本;在19841989年期间出版四卷伯杰氏细菌系统学手册。历次版本的修改都反映各个时期细菌分类学发展动态。 细菌分类纲要根据1984年伯杰氏细菌系统学手册，将包括古细菌在内的整个细菌分成四个门、七个纲： 表2原核生物界（Procaryotae） 门I 簿壁菌门（Gracillicutes）指革兰氏阴性、薄壁类型的原核生物 纲1 暗细菌纲（Scotobacteria

23、） 纲2 无氧光细菌纲（Anoxyphotobacteria） 纲3 产氧细菌纲（Oxyphotobacteria） 门II 厚壁菌门 （Firmicutes）指革兰氏阳性、厚类型的原核生物 纲1 厚壁菌纲（Firmibacteria） 纲2 分枝菌纲 （Thallobacteria） 门III 软壁菌门 （Tenericutes）指无细胞壁、细胞柔软的原核生物 纲1 柔膜菌纲 （Mollicutes） 门IV 疵壁菌门 （Mendosicutes）指细胞壁中缺乏常规肽聚糖成分的原核生物 纲1 古细菌纲 （Archaebacteria） 分成部分(section)，随着各部分菌群研究深度不同，

24、而划分成的分类单位不同：有的部分 之下是目、科、 属 ；有的直接科,甚至属，这种情况也出现在1994年出版的“伯杰氏细菌鉴定手册（第九版）”。将细菌(包括细菌)分成35个群(group)，有的在群之下有亚群(subgroup)、部分(section)；有的直接是各个属。完全不同于以前版本中有完整的分类阶元一门、纲、目、科、属。 第I类（革兰氏阴性细胞壁的真细菌） 群 名 称 1 螺旋体 2 好氧/微好氧、运动、螺旋状/弧状的革兰氏阴性细菌 3不运动（或罕见运动）革兰氏阴性弯曲的杆菌 4 革兰氏好氧/微好氧的杆状和球状细菌 5兼性厌氧革兰氏阴性杆菌 6革兰氏阴性，厌氧，直、弯和螺旋状杆菌 7 同

25、化硫或还原硫的细菌 8 厌革兰氏阴性球菌 9 立克次氏体和衣原体 10 无氧光合细菌 11 产氧光合细菌 12 好氧化能自养菌及相关菌 13 出芽和/或有附着物的细菌 14 鞘细菌 15 非光合、不产子实体的滑行细菌 16 产子实体滑行细菌：粘细菌 笫II类（革兰氏阳性细胞壁的真细菌）菌群 群 名 称 17 革兰氏阳性球菌 18 产芽孢革兰氏阳性杆菌和球菌 19 规则、不生孢的革兰氏阳性杆菌 20 不规则、不生孢的革兰氏阳性杆菌 21 分枝杆菌 22-29 放线菌一 第III类（无细菌壁的真细菌）菌群 群 名 称 30 枝原体 第IV类（古细菌）菌群 群 名 称 31 产甲烷细菌 32 古生的

26、硫酸盐还原细菌 33 极端嗜盐古细菌 34 无细胞壁古细菌 35 极端嗜热和超嗜热代谢硫的细菌2.苏联的Kapacunukob(1949)，以形态为主，主要用于放线菌早期分类。3.法国的Prevot(1961)，以生理为主，种的范围往往划得很小，厌氧菌分类常常用它。4.着重于医学细菌的鉴定有“医学细菌鉴定手册”和“临床微生物手册”，自1970、1974、1980、1985、1991和1995年已陆续出版了六个版本。5.“原核生物(Procaryotes)”第一版于1981年由Starr等主编，它的分类排列类似伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)，如光合细菌、滑动细菌-等。在1991年由Balows等主

27、编第二版时，变化极大，完全遵照原核生物系统发育的顺序描述每个分支上细菌的属或更高的分类单元。这个原核生物系统发育是以Woese的16S rRNA序列同源性为基础。16S rRNA不仅建立了原核生物系统发育学，而且还证实了原核生物是由古菌和细菌两大群组成，二者间的亲缘关系不比它们之一与真核生物的关系更密切，表明生命是以三种形式存在，1990年Woese将三种生命形式分别定义为古菌域(Archaea)、细菌域(Bacteria)和真核生物域(Eucarya)。第二版内容分为六个部分：a)引言：包括微生物学的广泛性、原核生物的多样性、系统发育、分离鉴定、保藏和应用。b)包括以下章节：原核生物的生命周

28、期、习性、厌氧生长、互营作用、并在一系列章中介绍人们熟悉的表观特征群。c)按照系统发育学，介绍古菌和有关的属和目。d)按照系统发育学，介绍细菌域中的各个分支，是“原核生物”的主要内容。e)包括那些已建立了固定的共生作用的微生物。f)包括还未确定系统发育关系的菌群。四.细菌分类学发展趋势： 由于其它学科渗入，从研究的深度和广度都有很大的发展，尤其是近十几年来，PCR技术，使得16s rRNA全序列分析广泛应用于不同分类阶元水平的亲缘关系的研究。鉴定方法发展，无疑使分类系统更趋客观。方法学发展表现在：1. 宏观微观 由于电镜和化学分析仪表应用，使对细胞内部的结构和组成的比较才有了可能。例如：对细胞

29、壁的层次、形状；芽孢的表面结构；鞭毛着生部位；细胞核形态有无核膜特征，都已用于各阶元的分类单元：大至原核生物界(域)、细菌各纲的区别和小至新属、种的提出，无不与此有关。随着气相色谱和液相色谱在细菌鉴定中广泛应用，以细胞各部分的化学组成作为鉴定指标，形成化学分类法，结合分子生物学方法应用，使亲缘关系研究更为透彻。从形态特征来说，从群体 细胞 亚细胞；从生理特征看，从行为功能团(蛋白质) 分子(核酸)。所以综述鉴定方法从宏观向微观方展。2. 从表面内在 早期的分类体系中，形态特征比重大，从伯杰氏手册(第七版)以前的版本都是如此，形态特征占优势，而第八版由形态、生理、生化性状，开始出现基因组的特征，

30、 80年代出版的伯杰氏系统细菌学手册，基因性状普遍而增加，分类系统变化较大，尤其90年代，应用16S rRNA序列分析之后，高级分类单元都有重大的变化。也说明使分类系统也更趋于自然。附件1 核酸技术附件2 细胞组成分析技术附件3 微生物分类中系统发育分析技术细菌分类学研究进展一. 分类学组成及各组成间的关系：1.分类学组成：分类学由鉴定、命名、归类三部分组成，也称之为分类学三大要素。2.三组成间的关系：3. 系统分类学(Systematics) 系统分类学=系统发育学(Phylogenetics) + 分类学(Taxonomy)二. 分类学发展的动向：1. 鉴定 1). 多相分类 多相分类是由Colwell等(1970)提出，以各类信息用于分类， 2). 数值鉴定与数值分类：数值鉴定 数值分类(Numerical taxonomy) 数值分类必需借助于计算机，所以又称计算机分类学(Computer taxonomy)。 2. 命名 命名是分类学的重要组成部