整理植物内生菌分离处理方法.docx

1、整理植物内生菌分离处理方法d植物内生菌分离处理方法文献材料前处理第一次消毒第二次消毒（含三消）处理对照培养基刘明志，2011南方红豆杉的老树皮、幼茎、叶截成23 cm长的小段，去除树皮层75%酒精中浸泡30 s01%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗35次研磨成匀浆液，倾倒于PDA上 切成05 cm左右的块，接种于有100 mg L1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。每皿10块 刘金花2011黄花蒿的根，茎，叶叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口）将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min1%的次氯酸钙溶液浸泡1min,用无菌水冲洗5次置于含双抗的VA培养基平板培养待切口处长

2、出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离宋培勇2011珙桐茎、叶和叶柄将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次75%酒精浸泡 1 min 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次,取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照平放于 NA 平板上, 28 C培养 23 d孙传伯2011台湾7303毛豆全株采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分, 并用无菌纸吸干水分,切取支根110 cm长的小段, 须根切成 115 cm的小块用 75% 酒精浸泡 5m in、7m in、

3、10m in分别用 0.1% 升汞溶液处理 4 m in、6 m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复 3次。最后用无菌水冲洗 4次,。最后用无菌水冲洗 4次将组织块在研钵中充分研磨成匀浆最后一次冲洗液涂 3种不同培养基平板, 26 28e 下培养2 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗 4次,取上清液涂抹于培养基上。以无菌水冲洗为对照试验。取上清匀浆涂抹于 3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复 3次, 然后将培养皿置于26 28e 恒温箱中培养2 3d, 观察培养出的菌落形态张鑫2011植物圣罗勒的健康叶

4、子将叶子用流水冲洗 10 min1% 的 次 氯 酸 钠 中 浸 泡 10 min0 02 mol / L、pH 7 0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次加无菌水将材料研磨涂布培养李铭,2011石耳目地衣为了诱导产孢，黑化菌株在光照/黑暗( 12 h 12h) 条件下，于2%的 PDA培养基上，18 下培养 3 个月刘杰凤2011健康的小白菜，染病的小白菜根，茎，叶流水冲洗干净，剪成小段75酒精中浸泡3 min10次氯酸钠浸泡茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min无菌条件下用适量的PBS缓冲液捣碎以最后一次的漂洗液作对照，30 下

5、培养一个星期搅拌后静置3 min，取上清液05 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行朱士茂2011新采集的银杏枝条，叶子和根在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成 3 4cm 长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中（1），根的表面灭菌: 0. 1%的土温 20 消毒 1min，无菌蒸馏水冲洗 2 次。（2）枝，叶和叶柄： 75% 的乙醇消毒 30s，无菌蒸馏冲洗 3 次(一）,根：75%的乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗 2 次，0. 1% 升汞消毒 5min，无菌蒸馏水冲洗 5 次。(二）枝，叶和叶柄：0. 1% 升汞消毒 7min，无菌蒸馏水冲洗 5

6、次 茎，将其表皮剥离，用无菌小刀纵切表皮取其中间的部分，然后将其切成 0. 5cm 0. 5cm 大小第二节安全预评价叶和叶柄，用研钵将叶磨碎 ( 内放石英砂和生理盐水) 然后用无菌移液管吸取0. 2ml 放入培养皿中 将以上接入的每种平皿按相同的方法接入 5min 后用无菌镊子取出;用无菌蒸馏水冲洗已表面灭菌后的材料，然后将此液体移入培养基中，培养观察。环境影响的经济损益分析，也称环境影响的经济评价，即估算某一项目、规划或政策所引起的环境影响的经济价值，并将环境影响的经济价值纳入项目、规划或政策的经济费用效益分析中去，以判断这些环境影响对该项目：规划或政策的可行性会产生多大的影响。对负面的环

7、境影响估算出的是环境费用，对正面的环境影响估算出的是环境效益。KB 培养基: PL 培养基:一、环境影响评价的发展与管理体系、相关法律法规体系和技术导则的应用PDA 培养基:肖淑贤2011.长势好、无病害的植株在自来水中冲洗干净采用升汞、乙醇、H2O2、次氯酸钠等表面消毒剂进行消毒，无菌水冲洗直接切取植物组织或榨取植物组织汁液稀释一、环境影响评价的发展与管理体系、相关法律法规体系和技术导则的应用王剑峰4.建设项目环境影响评价文件的分级审批2011（一）环境影响经济损益分析概述取生长 15 天马铃薯第五章环境影响评价与安全预评价无表面灭菌方法环境影响经济损益分析一般按以下四个步骤进行：2.早期介

8、入原则；马铃薯内生菌单菌落的分离取生长 15 天马铃薯 LK99 组培苗,剪成长度约 1.0 cm 的带腋芽茎段接种于 PSA 培养基上,分别于光下(28、2200Lx、16hr 光/8hr 黑暗)或 28暗培养,3 天后光下和黑暗条件下组培苗周围的培养基上出现黄色菌块,挑取黄色菌块,用稀释涂布法66分离单菌落。李晓红影响支付意愿的因素有：收入、替代品价格、年龄、教育、个人独特偏好以及对该环境物品的了解程度等。不同表面消毒方法对核桃叶内生菌分离效果的比较内容残缺）熊亚南2011刺五加植株流水冲洗去土，根，茎，根茎等部 流水冲洗去土按根，茎，根茎等部进行分割，每段长10cm左右，按下列程序表面消

9、毒：无菌水冲洗 95%酒精漂洗1min6%的Naclo浸3min75%的乙醇漂洗0.5min 无菌水漂洗3次进行分割，每段长10cm左右同样处理的 材料不做切割直接滚印于对照平板，并去最后一次漂洗的无菌水平板涂布，置相同条件下培养，无菌长出即为表面消毒彻底。NA培养基。将上述处理过的材料韧皮部与木质部无菌分离，韧皮部切成约0.5cm0.4cm的薄片，然后将薄片直插入和水平贴附两种方式置于分离平板上，25-28暗箱培养，带材料边缘有菌苔长出后转接与纯化平板划线法分离纯化，镜检验纯后转接到斜面。邓正山2012健康的大蒜鳞茎用纯净水冲洗干净依次用体积分数的乙醇浸泡的氯化汞表面消毒，再用无菌水漂洗次杨

10、明琰2012新鲜的杜仲 将新鲜植物材料用自来水冲洗外表面直至干净，晾干。用无菌刀将样品切割成左右的小段的酒精溶液中浸泡，用无菌水冲洗样品表面次再在的次氯酸钠溶液中浸泡，用无菌水冲洗样品表面次用镊子及解剖取其韧皮部，切除两端后切成大约的小段漂洗液检验法：把最后一次漂洗材料的无菌水涂布于平板上，恒温培养。组织印迹法：将上述表面灭菌处理的完整枝段压入平板内，使表面灭菌材料与培养基接触后，移去植物材料，恒温培养。组织压入法：将灭菌材料不经切割直接贴于培养基表面，恒温培养将小段，贴于培养基的表面，每皿放块材料，于恒温培养箱内培养。待菌丝从植物组织长出后，从边缘挑取菌丝移至另一平板上进行纯化胡秀荣2011

11、采集健康的柑橘植株放线菌：先在自来水下冲洗掉样品表面的泥土，再用超声波清洗放线菌：然后用99%乙醇处理1min，3%次氯酸钠处理5min放线菌：最后用99%乙醇再处理30s放线菌：灭菌好的材料用无菌刀切成1cm1cm小块，置于分离培养基表面放线菌：将最后一次处理植物样品的清洗液涂在ISP2培养基上，用以检测表面灭菌的效果熊党生2012取新鲜健康的葛根的根、茎、叶分别用水冲洗干净，用滤纸吸干水分无菌水冲洗 2 遍，先用体积分数75% 酒精浸泡 3 5 min( 叶子 3 min，茎 4 min，根 5min) ，无菌水冲洗 3 4 遍用 0 1% 升汞浸泡 2 4min( 叶子 2 min，茎

12、3 min，根 4 min) ，无菌水冲洗 4 5 次在无菌的条件下，用灭过菌的手术剪刀将植物根、茎、叶剪成小段，从中间剪开后，分别置于含有葛根浸出夜的 PDA 琼脂培养基上，置于生化培养箱中培养一段时间将上述经过表面消毒后未作任何处理的材料直接置于平板中，27培养，结果材料周围未见任何菌长出，证明所分离的菌株为葛根的内生菌。挑取内生细菌到牛肉膏蛋白胨培养基中，挑取内生真菌的菌丝到 PDA 培养基中纯化数次，将纯化好的菌种接种到斜面培养基上保存备用张彦涛2012白蜡、茅草、射干、罗布麻、蓼草、胡杨、怪柳。取采集的新鲜样品，用蒸馏水将植物表面洗净干后分别取其根、茎、叶，在 75% 乙醇消毒液中浸

13、泡 35min3% 次氯酸钠浸泡 5min，75% 乙醇浸泡5min。最后用无菌水冲洗 34 次将样品在灭菌的研钵中研磨，加适量无菌生理盐水研磨至匀浆状最后一次冲洗的无菌水涂布平板做空白对照（分离培养基）取 1mL 液体分别按照 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次梯度稀释，并分别涂布平板，37恒温培养 2d。红树林内生放线菌文件不完整李雁津2012完整交城骏枣,用自来水清洗表面后再用无菌水冲洗,晾干称重后浸入30%的乙醇中3 min浸入2.6%的次氯酸钠溶液中5 min浸入30%的乙醇中30s进行表面消毒,最后用无菌水冲洗5次,晾干用无菌剪刀将枣果去皮,果

14、肉剪碎,加入无菌生理盐水研磨取最后一次淋洗水150微升涂于LB平板上,28C培养72小时,检测表面灭菌效果。将碾磨液分别涂布于胰酶大豆琼脂培养基(TSA)、任氏培养基(R2A)、金氏培养基(KMB)、肉汁胨培养基(BPA)、 LB培养基、酵母膏蛋白胨琼脂培养基(YPM)、无氮培养基,28C培养箱中倒置培养3-7天。张慧茹2012挑选新鲜、生长旺盛的葎草，用保鲜袋包装用自来水冲洗干净，置无菌操作台中紫外灯照射 5 min 后晾干。用 75%酒精进行全草消毒1 min升汞消毒时间分别为：根65 s、茎 50 s、叶 35 s。再用无菌水冲洗干净将上述组织块剪成 0.5 cm0.5 cm大小分别取各

15、种组织最后一次冲洗的无菌水，涂布于营养琼脂平板上；将表面消毒处理过的完整的根、茎、叶各组织贴压在PDA 培养基平板内；在超净工作台内放置一敞开的PDA 平板。将上述 3 种对照平板置于 28 恒温培养箱内培养 7 d，用于检查表面灭菌效果。置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，28 恒温培养箱中培养约 57 d，待内生菌长出后，挑取单个菌落进行纯化，PDA 培养基斜面保菌。李勇2011健康人参自来水将人参根表面粘连的土壤清洗，再用无菌水冲洗 1 次依次用70% 乙醇浸泡 3 min2. 6% 次氯酸钠浸泡 5 min，再用 70%乙醇浸泡 30 s。最后用无菌水淋洗 5 次将无菌人参根剪成碎

16、块，放入无菌研钵中，加入适量无菌石英砂和生理盐水( 0. 85%) ，充分研磨，梯度稀释 1 万倍取最后一次淋洗液 150 L 涂平板，28 培养 3 d，观察平板上是否有菌长出。取 200 L 稀释液至细菌分离培养基，涂布均匀。25 恒温培养 7 d，记录每个平板上的菌落形态及菌落数，纯化培养。林娜2012随机挑选100g 左右根、茎、叶、果实洗净风干75% 乙醇分别浸泡 2、3、1、1 min，无菌水冲洗6 次，无菌滤纸吸干01%HgCl2分别浸泡50、60、40、40 s，无菌水冲洗 6 次加无菌石英砂研磨，梯度稀释至 10 3，每一稀释梯度涂布10 个分离平板每个样品都取最后一次无菌水

17、洗液涂于相应平板上，以检测表面消毒是否彻底定期观察分离平板，挑取单菌落划线纯化于牛肉膏蛋白胨斜面上。张鑫2012无纹背苔藓取苔藓叶片用无菌水洗净紫外先线（功率18QW）照射6min（苔藓叶正反面个照射30min）灭菌然后用75%的酒精漂洗15min ，用无菌水冲洗3次，再利用酒精灯火焰进行表面灭菌将验证表面无菌的叶子于无菌碾钵中碾磨，用无菌水梯度稀释将表面灭菌的叶子直接贴于固体PDA和LB培养基表面，28 培养3-4h，观察叶子周围是否长菌，以检验鲜苔表面灭菌是否彻底。各取200微升稀释液涂布于固体PDA和LB培养基进行内生菌的分离。根据菌落形态，颜色等特征初步判断处分理出菌落的中类，并按常规

18、的方法挑取菌落保存。蓝江林2012香蕉，处于成果期的健株和病株各 1 株将样品用自来水冲洗干净，吸干水分，称重先用75%酒精浸泡 40 s 左右，用无菌水充分淋洗再用10% KClO3溶液浸 8 min，无菌水反复淋洗，无菌滤纸吸干根部选取根尖和根基部分;假茎部从茎基部到茎顶端等分为 5 段，每段随机取样; 叶片根据生长的位置分为上部、中部和下部叶片，每部分取叶基部中部和叶尖部分以组织消毒后无菌水淋洗的最后淋洗液作为对照, 涂 NA 平板培养，如长菌落, 则判定研磨液所培养的菌落为非内生菌, 丢弃; 若对照中无菌落, 则基本可判定研磨液中长出的菌落可能是内生菌，纯化后保存待用。在无菌研钵中充分

19、研磨匀浆，无菌水梯度稀释至 102、103和 104，取 200 L 稀释液涂布于 NA平板上，每梯度 3 个重复，静置 20 min 后，30倒置暗培养 24 48 h。史应武2012新疆醉马草将醉马草的根、茎、叶( 包括叶鞘) 、种子分别用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗一次; 在 75% 的0乙醇浸泡 30s 将醉马草的根、茎、叶( 包括叶鞘) 、种子分别用自来水冲洗干净然后在 0. 1% 的升汞中浸泡 1 min; 无0菌水淋洗 5 次，在无菌条件下晾干 取最后一次淋洗水涂于 LB 平板上，28 培养 72 h，检测表面灭菌效果马赟2012阿尔泰虫草取阿尔泰虫草用水粗洗再用乙醇擦洗2mi

20、n然后在 0. 1% 氯化汞溶液中消毒 3 min，无菌水冲洗 4 6次将虫草切成 0. 1 0. 5 cm 长的小段将小段接到马铃薯培养基( PDA) 、LB 培养基培养刘明志。南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。热带亚热带植物学报，2011，19(4):360364剥取红豆杉的老树皮，截成23 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用01%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗35次。用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成05 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。每皿放置10块，依次编号，置于25恒温培养

21、箱中培养。幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25恒温培养箱中培养。1刘金花。黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。，（）：黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。待

22、切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 813将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次, 平放于 NA 平板上, 28 C培养 23 d。取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照。 内生菌分离和纯化。将 NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离 1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。毛豆内生菌的分离及生物

23、学特征观察。(2011)10- 0026- 02 （1） 从供试材料上取植物组织 1. 0 g, 用 70% (体积分数 )酒精浸泡 30 s, 用无菌水漂洗后, 置于 1% (体积分数 )次氯酸钠水溶液中表面消毒 3- 5m in(其中叶片和花消毒 3 m in, 茎和果消毒 5m in), 再取出植物组织用无菌水冲洗 3次. 样品晾干后分别置于无菌研钵中加 5 mL 无菌水研磨成浆状, 静置 10- 15 m in后, 每一样品各取上层澄清液 50 LL 分别涂布在培养基 ( NA、KB和 TSA ) 平板上, 每种培养基涂布 3皿, 28 e 黑暗培养48- 72 h, 计算每一平板的菌

24、落数. 表面消毒后, 在研磨前取 50 LL 无菌水冲洗液涂布平板;或是通过组织印迹试验, 将最后一次清洗的植物组织在培养基平板上印一下, 按上述条件培养 48 h, 观察有无菌落产生, 以验证采用该消毒方法是否能杀死供试材料表生微生物. 根据菌落形态、颜色等挑取单菌落, 划线分离、纯化后保存、备用.在融化并冷却至 45 e 的NA 培养基中加入待测病原菌的悬浮液, 其中每 100 mL 培养基加 1 mL 细菌悬浮液, 倒入平板. 采用点接法将内生菌接种于 NA平板上, 每个平板上等距离点接 5株不同的内生细菌菌株, 每组进行 2次平行试验, 在恒温箱中 28 e 下培养, 2 d后观察有无

25、抑菌圈生成. （2）采用组织切块法, 进行表面消毒,再用灭菌的蒸馏水清洗, 检验灭菌效果。内生细菌的分离前,将采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分,切取支根 110 cm 长的小段, 须根切成 115 cm的小块, 进行组织表面清毒, 棉花根部切段后经无菌水冲洗 3次,用 75% 酒精浸泡 5m in、7m in、10m in后, 然后分别用 011% 升汞溶液处理 4 m in、6 m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复 3次。最后用无菌水冲洗 4次, 最后一次冲洗液涂 3种不同培养基平板, 26 28e 下培养2 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花

26、根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗 4次,取上清液涂抹于培养基上。以无菌水冲洗为对照试验。培养 2d后观察灭菌效果, 直到彻底表面灭菌, 再进行最后的内生菌分离。将组织块在研钵中充分研磨成匀浆,取上清匀浆涂抹于 3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复 3次, 然后将培养皿置于26 28e 恒温箱中培养2 3d, 观察培养出的菌落形态。（3） 再将材料放进经过紫外线消毒的超净工作台内, 切割成小段, 按常规无菌操作进行表面消费处理: 75% 乙醇浸泡 3 min y无菌水冲洗 3 遍 y011% 升汞浸泡 8 m in y 无菌水冲洗 3 遍。将上述处理过的材料经滤纸吸干水

27、分后, 在无菌条件下切成015 cm015 cm 的小块, 放置于新鲜的 PDA 平板培养基上, 每个平板放置 4 块, 28 e 恒温培养 3 7 d。待切口边缘长出真菌菌丝, 及时转接至新鲜 PDA 培养基上培养, 采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。同时, 以消毒后不做切割的材料作为空白对照, 同样条件下观察是否有菌长出, 结果对照材料周围无任何菌长出, 证明表面消费彻底。212 内生真菌的鉴定: 采用真菌学插片培养方法,对分离获得的见血封喉内生真菌进行显微形态特征( 菌丝、孢子形态等) 的观察、分类鉴定。分类检索参照文献报道 8。213 内生真菌的发酵上清液制备: 将分离得到的菌株, 切取黄豆

28、粒大小的菌丝块, 接种于 PDB 培养基中。1 L 三角瓶装 400 mL 培养液, 室温, 164 r/ min振荡培养7 d, 同时以纯培养基作空白对照。无菌条件下取发酵液 15 mL 于离心管中, 12 000 r/ min 离心 30 min 后取上清液, 用 012Lm 微孔滤膜滤过除菌, - 20 e 保存备用。214 抑菌活性测定: 采用杯碟法测定样品抑菌活性。金黄色葡萄球菌和 MRSA 采用 NA 培养基, 白色念珠菌采用 YPD 培养基。将金黄色葡萄球菌、M RSA 和白色念珠菌分别制成一定浓度的菌悬液( 1105 1107cfu/ m L) , 用棉签将其均匀涂布在供试无菌

29、培养皿中, 制成含菌平板, 然后在每个平板放入 3 个牛津杯, 分别取样品 200 微升 加入其内, 同时以发酵纯培养基作阴性对照。金黄色葡萄球菌和M RSA 在 37 e 下恒温培养, 白色念珠菌在 28 e 下恒温培养。24 h 后观察结果, 测量并记录抑菌圈直径。每个样品做 3 个重复, 以抑菌圈直径的平均值为试验结果 4张鑫，生菌的分离方法及其次级代谢产物研究,(2011)02-0023-04 内从药用植物圣罗勒的健康叶子上分离出4 种内生细菌 OS 9、OS 10、OS 11和 OS 12。他们首先将叶子用流水冲洗 10 min，随后 于 1% 的 次 氯 酸 钠 中 浸 泡 10

30、min，再 用0 02 mol / L、pH 7 0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次，每次洗后取 100 L 漂洗液转移到装有 5 mL肉汤培养基的离心管中，经过 48 h 震荡培养( 条件是 200 rpm，28 ) ，检测样品表面消毒是否彻底。分离过程为选用紫外线和75%酒精作为表面消毒剂，经过多次消毒，加无菌水将材料研磨后，再将研磨液涂布。5李铭, 石耳目地衣(2011) 02-0014-07无6刘杰凤, 小白菜内生菌的分离及菌核菌拮抗菌的筛选 （2011）132676-04 健康的小白菜 ，染病的小白菜。采回的植株用流水冲洗干净，剪成小段，75酒精中浸泡3 min，再用10次氯酸钠浸泡一定时间：茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min，表面消毒检测至漂洗液无菌落长出为止，一般为34次。在无菌条件下用适量的PBS