硫醇类荧光探针研究进展.docx

1、硫醇类荧光探针研究进展硫醇类荧光探针研究进展【摘要】 硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用，定量检测硫醇在生物化学和临床化学中具有重要的意义。荧光法由于其具有灵敏度高、能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪的优点，成为目前广泛采用检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。本文引用文献5篇，按荧光探针与巯基作用机理的不同分类，就近年来该领域的研究进展做了比较系统的评述，并展望了此类探针的发展趋势和应用前景。 【关键词】 硫醇，荧光探针，综述Abstract Thiols， which are components of many proteins an

2、d simple molecules， play an important role in the cellular antioxidant defense system. The quantitative determination of thiols is important in biochemistry and clinical chemistry. Fluorescent probes， which have its apparent advantages in sensitivity and， most importantly， in imaging thiols in vivo，

3、 even in single living cells， appear to be particularly attractive. In this review， we classify the fluorescent probes based on their different reaction mechanisms with thiols and summarize the recent progresses of thiols fluorescent probes with fiftyone references. Particularly， the research actual

4、ity， the developing trends and prospects in the future were also discussed.Keywords Thiols， fluorescent probe， review1 引 言硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用1。小分子硫醇包括半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（GSH）、硫辛酸和辅酶A;大分子硫醇包括含巯基的多肽、酶和生物膜。大量的生物现象被认为依赖于这些包含巯基的硫醇类物质，如氧化还原反应、甲基转移反应、二氧化碳固定反应以及辅酶A参与的反应等。谷胱甘肽（GSH）是细胞内含量最高的小

5、分子硫醇（110 mmol/L），它存在氧化型谷胱甘肽（GSSG）和还原型GSH的氧化还原动态平衡。大量资料显示1，谷胱甘肽在维持细胞的氧化还原动态平衡、氧化应激和在细胞的生长、功能中起着重要作用，而且谷胱甘肽的水平还与许多疾病和癌症有着直接的联系。因此，定量检测生物体系中硫醇的浓度在生物化学和临床化学中具有重要意义。目前已报道的用于检测硫醇的方法主要有：高效液相色谱法11、电化学法11、荧光法等。荧光法由于其探针特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的特点，更重要的是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。本文按荧光探

6、针与巯基作用机理的不同分类，就近年来该领域的研究进展做了比较系统的评述，并展望了此类探针的发展趋势和应用前景。 利用巯基的亲核性检测硫醇的荧光探针2.1 利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇的探针主要为氮取代的马来酰亚胺类衍生物。马来酰亚胺通常易与硫醇类化合物发生亲核加成反应，在室温下pH 58时几分钟即可完成。Kanaoka等发现氮取代的马来酰亚胺类的大多数化合物自身没有荧光或荧光很弱，当它与包含巯基的化合物反应后形成具有强荧光的加成产物1， 并于1970年开发了第一个比较实用的马来酰亚胺类荧光试剂1。试剂1是一个非常灵敏的检测巯基类化合物的荧

7、光试剂，缺点是激发和发射均处于紫外区，且水溶性差。经过对荧光发射团系统的研究后，Machida等 2又进一步开发了波长较长水溶性较好的试剂2。试剂2的激发和发射波长分别为400和 480 nm，该探针在设计时为了增加水溶性引入了极性的香豆素荧光团和二甲氨基基团。试剂1和2被称为Kanaoka试剂，通常被用作荧光探针来共价标记蛋白质中的巯基活性点。近年来，许多氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针被开发22，用来检测动物血清、肝脏、尿液等生物样品中的GSH、Cys等具有重要生物学意义的小分子硫醇。1995年Langmuir等2设计合成了5个以苯并香豆素（naphthopyranone）为母体荧光团的氮

8、取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针48，这些探针与一些小分子硫醇如GSH、Cys等在生理pH条件下立即反应，脂肪族胺、氨基酸和非硫醇蛋白不干扰测定。他们将这5个探针与广泛使用的硫醇类荧光探针32比较，研究了其与硫醇反应前后荧光量子产率的变化，结果显示其与硫醇反应后荧光量子产率显著增大（其中试剂8荧光量子产率变化最大，0.0120.66），是比试剂3（0.0210.13）更为灵敏的探针。Liang等组设计合成探针5maleimidyl2(mmethylphenyl)benzoxazole（MMPB）24，25，与其它马来酰亚胺类探针相比，由于MMPBGSH 和 MMPBCys 荧光性质的不同，该探针

9、可以实现对GSH和Cys的选择性响应。在激发和发射波长分别为299.2和355.8 nm时，MMPB可以选择性的检测GSH，在含有0.4倍的Cys的情况下对GSH的检出限可达3.231010 mol/L，其它氨基酸100倍存在时不干扰测定。该探针被成功用于人的血液、猪肝和猪心中GSH含量的测定；在激发和发射波长分别为305.6和425.6 nm时，MMPB还可选择性的检测Cys。在同时存在0.15倍的GSH的条件下对Cys的检出限可达6.21010 mol/L，其它氨基酸100倍存在时不干扰测定。该探针被成功用于蛋白质水解液、胱氨酸电解液和人尿液中Cys的测定，回收率高、重现性好。该探针虽然可

10、以实现对GSH和Cys的选择性响应，但激发和发射波长短，生物样品中背景荧光干扰比较大。该课题组2005年又设计合成了一个新的波长较长的荧光探针926，激发和发射波长分别为401和496 nm。试剂9用于检测Cys线性范围1.01086.0107 mol/L，检出限5.7109 mol/L；检测GSH线性范围6.01094.0107 mol/L，检出限5.64109 mol/L。试剂9被成功应用于检测人血清和血浆中的GSH，人尿液中的Cys，回收率96.2%103.0%。试剂9用于检测巯基类物质简单快速、可行性强，35 时15 min即可反应完全，且与前一个探针MMPB相比波长较长，可以极大的减

11、少生物样品中本体自发荧光的干扰。Matsumoto等27设计合成了基于PeT（光诱导电子转移）机理的绿色荧光探针omaleimideBODIPY（10），该探针的荧光被供体BODIPY到受体maleimide的激发态光致电子转移过程（dPeT）强烈猝灭，与硫醇类物质反应后荧光团BODIPY的荧光恢复，荧光增强350倍，反应前后荧光量子产率变化比较大（0.0020.73）。该探针是目前所见的马来酰亚胺类硫醇荧光探针中除荧光素马来酰亚胺（fluorescein5maleimide）外，唯一在可见光区激发和发射的探针，且信噪比远高于fluorescein5maleimide28（荧光增强倍数仅有十倍

12、，荧光量子产率变化为0.060.64）。 探针10可以用来清楚定量地标记极低浓度的牛血清蛋白（牛血清蛋白最低浓度为5 mg/L）。探针10由于激发和发射波长均处于可见光区，可以极大的减少生物样品中本体自发荧光的干扰，但是仍没有应用到细胞内进行检测。到目前为止，该类探针应用于细胞内成像的还未见报道。氮取代的马来酰亚胺基团对硫醇类物质选择性好、灵敏度高，是适于检测硫醇的活性基团。因此，改善传统荧光团，开发长波长、长寿命以及双光子激发的氮取代的马来酰亚胺类荧光分子探针，使其更适用于生物活体内检测硫醇或标记硫蛋白，是今后该类探针发展的一个重要方向。Ahn等29采用固相文库合成法合成出一系列的罗丹明类荧

13、光化合物，并从中筛选出可高选择性的与谷胱甘肽响应的荧光探针11。试剂11在生理条件下(pH 7.4 HEPES缓冲液中)与GSH发生亲核加成反应使荧光增强，30 min即可达荧光最高点。荧光最大增强11倍，荧光量子产率由0.033升高到0.28。GSSG无荧光增强现象，包含巯基的其它分析物（例如DDT、巯基乙醇、Cys）有荧光弱增强现象但是不影响测定。探针被成功应用于实时检测活的成肌细胞（3T3 cells）中的GSH浓度的变化，通过加入增加细胞内GSH浓度的硫辛酸和减少GSH浓度的NMM，发现荧光强度发生显著变化，证明其探针能够对细胞内mmol/L的GSH产生响应。2.2 利用巯基对缺电子芳

14、环的亲核取代反应（ArSN）检测硫醇Maeda等30以荧光素为母体荧光团，设计合成了2个荧光素磺酸酯的硫醇荧光探针12和13。2，4捕硝基苯磺酰基（DBS）强吸电子作用将荧光素的荧光猝灭，由于巯基的强亲核作用发生ArSN反应，磺酸酯键断裂，荧光团母体结构恢复，荧光增强。探针与GSH反应在37 生理条件（HEPES， pH 7.4）下，10 min即达到荧光最大值，探针12和13的反应速率分别为1.7102和1.4102 mol/(LS)，检出限可达pmol/L。探针虽然在水溶液中存在水解副反应，但对测定影响不大（37 生理缓冲液中1 h探针12和13分别仅水解0.7%和1.1%）。Zhang等

15、31设计合成了一个在可见区激发的荧光增强型的可选择性检测半胱氨酸（Cys）和同型半胱氨酸（Hcy）的探针14。该探针激发和发射波长分别为465和588 nm，荧光最大增强可达75倍。更为突出的是该探针可用作Cys和Hcy的裸眼探针，加入Cys或Hcy后溶液颜色发生明显变化（由黄绿色变为橘红色）（图1），其它18种氨基酸无明显颜色变化。探针利用巯基的亲核性，在温和条件下（25 ， V（甲醇）V（HEPES缓冲液，pH 70）=73）反应10 min即可完成。由于位阻效应，其它硫醇在此条件下几乎不发生反应。ACCM细胞激光共聚焦成像实验显示探针膜渗透性好，可以显示Cys和Hcy亚细胞分布。更为突出

16、的是该探针可用于双光子荧光成像，可以极大地减小对细胞的光损伤、提高光穿透的深度、降低细胞内本体自发荧光的干扰。Jiang等32利用荧光团NBDCl设计合成了一个利用磺酰胺检测硫醇的荧光探针15，由于烷基硫醇与苯基硫酚pKa的不同（分别为8.5和6.5），在中性条件下烷基硫醇几乎不能电离而苯基硫酚能够大部分电离，电离出的巯基负离子的亲核性远大于巯基。因此，该探针在中性条件下可以选择性的检测苯基硫酚，烷基硫醇不干扰。探针15由于分子内电子转移（ICT）使母体荧光团的荧光被猝灭。由于苯基硫酚中性条件下电离出的巯基负离子具有强亲核性，与2，4捕硝基苯发生ArSN反应使磺酰胺键断裂，ICT受阻荧光恢复。

17、该探针灵敏度高（与苯基硫酚反应可产生50倍的荧光增强），选择性好（半胱氨酸、谷胱甘肽、烷基硫醇以及其它具有亲核性的胺、氰根等不干扰测定），条件温和（室温下pH 7.3 磷酸盐缓冲溶液中10 min反应基本完成），是第一个可以选择性的检测苯基硫酚而烷基硫醇不干扰的荧光探针。由于苯基硫酚是一类高毒性的环境污染物，在石油和煤的精炼厂、橡胶和塑料工业中都会产生大量的苯硫酚污染物，因此能够选择性的检测高毒性的苯基硫酚在环境科学中具有重要意义。Bouffard等33开发了一个红色的荧光增强型的磺酰胺荧光探针16，由于ICT过程探针分子本身的荧光很弱，与硫醇反应后磺酰胺键断裂，吸收光谱红移158 nm，荧光

18、增强120倍。探针成功用于小鼠胚胎纤维原细胞（3T3 cells）成像，由于探针的发射波长位于近红外区（623 nm），该探针具有在小动物的活体内成像的潜能。探针缺点在于本体荧光团在水溶液中的荧光量子产率非常低，仅为0.01。该方法通过加入1%人血清蛋白将其荧光量子产率提高到0.24。Shibata等34设计合成了一个罗丹明磺酰胺测硫醇的荧光探针17。该探针基于罗丹明开环闭环结构的变化，探针本身无荧光，与硫醇类物质反应后磺酰胺键断裂，罗丹明110的强荧光结构恢复，荧光增强5800倍。探针17成功用于人乳腺癌细胞（HeLa cells）共聚焦成像，证明该探针膜渗透性好、可以对活细胞内硫醇浓度的变

19、化产生响应。3 利用巯基与二硫键的氧化还原反应检测硫醇的荧光探针生物体内存在巯基和二硫键的氧化还原动态平衡，因此可以利用巯基和二硫键的作用来设计检测硫醇的探针。Pullela等35利用荧光共振能量转移原理（FRET）设计合成了可用于细胞成像的检测巯基的荧光探针DSSA(18和19)。该探针以荧光素（D， donor）和罗丹明B（A， acceptor）作为荧光供受体对，中间以二硫键连接。由于荧光素的发射光谱和罗丹明的激发光谱的有效重叠，荧光素的荧光被猝灭，与硫醇反应后二硫键断裂，供受体荧光团分离，荧光素的荧光恢复，通过检测荧光素荧光强度的变化来检测硫醇浓度的变化。探针的优点在于还原电势低(Eo

20、=0.6 V)，不会引起细胞内的氧化损伤，探针被成功用于斑马鱼胚胎显微成像。Piggott等36利用FRET原理设计合成了FSSF（20），该探针根据荧光素本身发射光谱和吸收光谱的重叠，将两个荧光素分子作为供受体对，中间以二硫键连接，探针被成功用于检测GSH及谷胱甘肽还原酶(GR)的活性。该探针足够灵敏，用于活细胞中实时检测GSH、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽转移酶的活性是切实可行的。Pires等 37基于二硫键设计合成了探针21。探针由于形成内酯的非共轭结构本身无荧光，当与硫醇类物质反应后，硫醇还原二硫键使其断裂，暴露出强亲核性的巯基负离子，巯基负离子进攻邻近的氨基甲酸盐使酰胺键断裂，罗丹明11

21、0的强荧光结构恢复。为了证明氨基甲酸盐的稳定性，Pires合成了对照化合物22。实验发现，在试剂22的溶液中加入硫醇没有荧光增强现象产生，通过对照实验证明了与硫醇反应的官能团是SS键。探针21成功用于HeLa 细胞激光共聚焦成像，证明探针21膜渗透性好，可以对细胞内硫醇浓度的变化产生响应。MTT细胞毒性实验显示，细胞内21浓度为80 mol/L时，细胞仍可正常生长。4 利用醛基与氨基和巯基的共同作用检测含巯基的氨基酸和GSH利用GSH（23）中巯基和氨基共同与邻苯二甲醛（24）作用产生荧光化合物（25）的方法，是目前在食品、环境、医药卫生等方面比较常用的检测GSH的方法。该方法是1966年Co

22、hn和Lyle建立的38，其原理是在碱性介质中，GSH具有还原性的巯基和氨基与试剂24反应产生荧光化合物25，荧光激发和发射波长分别为350和420 nm，在0.0632.5 mol/L范围内荧光强度与谷胱甘肽浓度呈线性关系，反应在室温下，pH 8.0进行，反应时间15 min，产生的荧光化合物25在30 min内保持稳定，测定中氧化型谷胱甘肽，含硫氨基酸、肽、嘌呤等其它物质对GSH的测定没有影响。试剂24的缺点在于波长短，不适用于生物体内检测。在试剂24的基础上又发展了萘2，3捕甲醛26。试剂26与24相比优势在于激发和发射波长长，分别为472和528 nm。试剂26是HPLC、激光共聚焦、

23、流式细胞计数和毛细管电泳中常用的检测谷胱甘肽的荧光试剂3944。Rusin等4开发了可选择性检测Cys和Hcy的探针荧光素二醛27，探针与Cys或Hcy反应后荧光猝灭，紫外吸收光谱发生红移（最大可移动25 nm），溶液颜色发生显著变化（1.0103 mol/L Cys或Hcy，加入1.0106 mol/L pH 9.5的探针水溶液中，溶液颜色由黄色转为棕黄色，如图2B和图2C所示）。探针可以检测生理浓度范围内Cys或Hcy浓度（2.9 1062.5 103 mol/L）的变化，胺、氨基酸、其它的硫醇和蛋白质干扰很小。探针为检测血浆中的氨基硫醇提供了一种很好的荧光和紫外可见方法。丙胺(nprop

24、ylamine).Tanaka等46设计合成出荧光增强型醛基荧光探针28。该探针可在中性条件下选择性的检测Cys。根据探针浓度的不同，线性范围分别为20100 mol/L和100 mol/L5 mmol/L，反应时间为30 min。其它的氨基酸（包括甲硫氨酸、丝氨酸、赖氨酸、脯氨酸、组氨酸）和GSH不干扰测定。不足之处是探针的波长位于紫外区（激发和发射分别为250和380 nm）。GSH生物体内含量最高的小分子硫醇，Cys和Hcy都是生物体内重要的氨基酸，目前检测含巯基的氨基酸的荧光分子探针还比较有限，因此利用醛基对含巯基氨基酸的选择性，开发长波长的荧光增强型的高灵敏度的可用于活体内检测的荧光

25、探针是非常有意义的。5 其它机理检测硫醇Chen等4利用32 nm的金纳米颗粒（GNPs）与尼罗红（NR）的非共价吸附作用设计组装了硫醇传感器NRGNPs，NRGNPs可利用荧光法和比色法（团聚）选择性的检测硫醇。由于NR与GNPs之间发生了荧光共振能量转移，NR的荧光被GNPs强烈猝灭，NRGNPs的荧光非常的弱。利用巯基与GNPs的强相互作用，将GNPs表面吸附的NR置换出来，NR与GNPs分离，NR的荧光恢复。在pH 4.0时，NRGNPs溶液的荧光强度随硫醇浓度的增加而增强，而胺、酸、乙醇、牛血清蛋白和血色素加入时没有发生荧光增强现象。NRGNPs对半胱胺和同型半胱氨酸氨酸的检出限分别

26、为10.2和10.9 nmol/L，信噪比为3。虽然随pH的上升，方法的灵敏度有些降低，但在pH 4.09.0范围内该方法可应用于检测mol/L的硫醇。pH 4.0时加入带有负电荷的硫醇（如巯基丙酰甘氨酸），NRGNPs溶液的颜色不发生改变；而当加入中性硫醇（如巯基甘油）和带有正电荷的硫醇（如巯基乙胺）时，由于团聚，颜色发生显著改变（分别为紫色和淡紫色）（图 3）。基于此，NRGNPs可用作裸眼探针检测浓度大于1.0 mol/L的各类型的硫醇。 RosLis等4设计合成了水溶性的方酸衍生物29和30。该探针在水溶液中640 nm处本身具有强荧光，与硫醇发生反应后荧光猝灭； 乙醇、苯酚、胺、不含

27、巯基的氨基酸、以及强亲核试剂氰根都不干扰测定。探针29和30被成功用于检测血浆中氨基硫醇的总量。模拟谷胱甘肽过氧化物酶类似物Ebselen，将与巯基类物质发生特异性反应的硒氮键引入荧光染料，设计合成了一种以罗丹明6G为母体含有硒氮键的新型荧光探针(RhSe)31用于识别巯基类化合物。基于巯基的强亲核作用将硒氮键打断，从而恢复罗丹明6G的强荧光结构。通过测定探针荧光强度的变化，实现了其对含巯基类物质的定量检测。方法的线性范围为3.01091.2107 mol/L；检出限为1.4 nmol/L。HL7702人正常肝细胞及 HepG2人肝癌细胞内巯基类物质的荧光共聚焦成像实验表明：探针膜穿透性好，可

28、以对两种细胞内巯基类物质的含量差异产生响应（可以明显地看出肝癌细胞内硫醇的含量小于正常肝细胞），表现出良好的生物适用性。合成了一种新型的金属配位桥连不泛精32，用于检测血浆中谷胱甘肽的浓度5。金属配位桥连不泛精由于受Cu2+的顺磁性及螯合作用的影响，与没有配合Cu2+的主体桥连不泛精33相比，荧光强度减弱。而谷胱甘肽也可以与Cu2+产生配位作用，这种竞争配位作用导致主体桥连不泛精的荧光恢复。基于此建立了一种快速、简便的检测谷胱甘肽的方法。在室温下，pH 6.0的PBS缓冲条件下，方法的线性范围为0.3020.0 mol/L； 检出限为63.8 nmol/L，血浆中主要成分对测定不干扰。应用本法

29、测定人血浆样品中谷胱甘肽的含量，结果令人满意。Huang等5设计合成了一个长波长的硫醇荧光探针34。该探针本身无荧光，在生理温度的pH 7.0 TrisHCl缓冲溶液中与硫醇发生自发的不可逆的氧化还原反应，产物35在595 nm处发出强荧光。探针选择性好，生物体内的其它不含巯基的氨基酸和还原性物质与探针不发生反应，在1100 mol/L范围内荧光强度与硫醇浓度呈很好的线性关系。6 结束语硫醇是生物体内的重要活性物种，其浓度的变化与许多疾病有着直接的联系，实时准确地检测细胞中硫醇的含量，对于研究其在细胞中的功能和疾病的诊断具有重要意义。关于硫醇的荧光探针的研究，近年来发展极为迅速，特别是最近两年

30、研发出了11个性能良好的探针，其中有6个成功用于活细胞成像，但是在含活性氧和其它抗氧化剂的复杂生物体系中实现荧光探针对硫醇的高选择性识别（特别是对某一种硫醇分子的特异性识别）的问题仍需进一步探索。可以预计今后相关研究将会侧重于以下几个方面：(1) 目前检测硫醇的探针多为检测硫醇总量，对某一种硫醇分子特异性识别的比较少见，因此设计合成更多可以针对生物体内不同种类硫醇分子分析检测的特异性荧光分子探针是非常必要的；(2)利用荧光探针分析生物样品存在的一个重要问题便是如何消除生物基体背景荧光的干扰；生物基体背景荧光的寿命(一般在110 ns)和波长( 500 nm) 较短，故发展长波长及长荧光寿命的硫

31、醇探针是一个重要的研究方向；(3) 用荧光探针分析生物样品存在的另一个重要问题是光损伤，因此设计合成双光子或多光子激发的可用于细胞内硫醇检测的探针也是一个重要的发展方向。总之，在目前研究的基础上，寻找新的荧光染料和识别基团，研究更适合生物应用的高灵敏度、高选择性的探针是今后硫醇类荧光探针发展的主要方向。参考文献1 Zhang S Y， Ong C N， Shen H M. Cancer Lett， 2004， 208(2): 143153 Mudd S H， Levy H L， Skovby F. The Metabolic Basis of Inherited Disease， 6th Ed.， New York， McGraw Hill， 1989: 693734 Hwang C， Sinskey A J， Lodish H F. Science， 1992， 257(5076): 14961502 Hong R， Han G， Fern ndez J M， Kim B J， Forbes N S， Rotello V M. J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128(4): 10781079 Hassan S S M， Rechnitz G A. Anal. Chem.， 1982， 54