细胞生物学 10第十章 细胞增殖及其调控.docx

1、细胞生物学 10第十章 细胞增殖及其调控第十章 细胞的增殖及其调控细胞增殖是生命的基本特征，种族的繁衍、个体的发育、机体的修复等都离不开细胞增殖。一个受精卵发育为初生婴儿，细胞数目增至1012个，长至成年有1014个，而成人体内每秒钟仍有数百万新细胞产生，以补偿血细胞、小肠粘膜细胞和上皮细胞的衰老和死亡。细胞增殖是通过细胞周期（cell cycle）来实现的，而细胞周期的有序运行是通过相关基因的严格监视和调控来保证的。细胞无限制增长对个体来说意味着癌症，个体无限制繁殖对地球来说意味着灾难。一个大肠杆菌若按20分钟分裂一次，并保持这一速度，则两天即可超过地球的重量。第一节 基本概念一、什么是细胞

2、周期细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。可分为四个阶段（图10-1）：G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期，只有在这一时期H3-TDR才能掺入新合成的DNA中；G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。图10-1 细胞周期可划分为四个阶段从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓

3、细胞。休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人了成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。二、细胞周期时间的测定标记有丝分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是

4、对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。有关名词：TG1：G1期的持续时间TG2：G2期的持续时间TS：S期的持续时间TM：M期的持续时间TC：一个细胞周期的持续时间PLM：标记的有丝分裂细胞所占的比例TDR：胸腺嘧啶核苷，是DNA的特异前体，能被S期细胞摄入，而掺进DNA中。通常使用的是3H或者14C标记的TDR。测定原理（图10-2）： 待测细胞经3H-TDR标记后，所有S期细胞均被标记。 S期细胞经G2期才进入M期，所以一段时间内PLM=0。开始出现标记M期细胞时，表示处于S期最后阶段的细胞，已渡过G2期，所以

5、从PLM=0到出现PLM的时间间隔为TG2。 S期细胞逐渐进入M期，PLM上升，到达到最高点的时候说明来自处于S最后阶段的细胞，已完成M，进入G1期。所以从开始出现M到PLM达到最高点（100%）的时间间隔就是TM。 当PLM开始下降时，表明处于S期最初阶段的细胞也已进入M期，所以出现LM到PLM又开始下降的一段时间等于TS。 从LM出现到下一次LM出现的时间间隔就等于TC，根据TC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1长度。事实上由于一个细胞群体中TC和各时相不尽相同，第一个峰常达不到100%，以后的峰会发生衰减，PLM不一定会下降到零，所以实际测量时，常以（TG2+1/2TM）-TG

6、2的方式求出TM。图10-2 细胞周期各阶段的时间与PLM的关系三、细胞同步化细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化，前者称自然同步化，后者称为人工同步化。（一）自然同步化1多核体如粘菌只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。数量众多的核处于同一细胞质中，进行同步化分裂，使细胞核达108，体积达56cm。疟原虫也具有类似的情况。2某些水生动物的受精卵如海胆卵可以同时授精，最初的3次细胞分裂是同步的，再如大量海参卵受精后，前9次细胞分裂都是同步化进行的。3增殖抑制解除后的同步分裂如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。

7、（二）人工同步化1选择同步化1）有丝分裂选择法：使单层培养的细胞处于对数增殖期，此时分裂活跃，MI高。有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低，此时轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，则可获得一定数量的中期细胞。其优点是，操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害，缺点是获得的细胞数量较少。（分裂细胞约占1%2%）2）细胞沉降分离法：不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，因此可用离心的方法分离。其优点是可用于任何悬浮培养的细胞，缺点是同步化程度较低。2诱导同步化1）DNA合成阴断法：选用DNA合成的抑制剂，

8、可逆地抑制DNA合成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度ADR、GDR和TDR，均可抑制DNA合成使细胞同步化。其中高浓度TDR对S期细胞的毒性较小，因此常用TDR双阻断法诱导细胞同步化：在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TDR，（Hela，2mol/L；CHO，7.5mol/L）。S期细胞被抑制，其它细胞继续运转，最后停在G1/S交界处。移去TDR。洗涤细胞并加入新鲜培养液、细胞又开始分裂。当释放时间大于TS时，所有细胞均脱离S期，再次加入过量TDR，细胞继续运转至G1/S交界处，被过量TDR抑制而停止

9、。优点是同步化程度高，适用于任何培养体系。可将几乎所有的细胞同步化。缺点是产生非均衡生长，个别细胞体积增大。2）中期阻断法：利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较少。优点是无非均衡生长现象，缺点是可逆性较差。第二节 有丝分裂一、细胞分裂的类型细胞分裂(cell division)可分为无丝分裂(amitosis)、有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis)三种类型。无丝分裂又称为直接分裂，由R. Remark（1841）首次发现于鸡胚血细胞。表现为细胞核伸长，从中部缢缩，然后细胞质分裂，其间不涉及纺锤体形成及染色体变化，故称为无丝分裂。无丝

10、分裂不仅发现于原核生物，同时也发现于高等动植物，如植物的胚乳细胞、动物的胎膜，间充组织及肌肉细胞等等。有丝分裂，又称为间接分裂，由W. Fleming (1882)年首次发现于动物及E. Strasburger（1880）年发现于植物。特点是有纺锤体染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于高等动植物。减数分裂是指染色体复制一次而细胞连续分裂两次的分裂方式，是高等动植物配子体形成的分裂方式。二、有丝分裂有丝分裂过程是一个连续的过程，为了便于描述人为的划分为六个时期：间期（interphase）、前期(prophase)、前中期(premetaphase)、中期(metapha

11、se)、后期(anaphase)和末期(telophase)。其中间期包括G1期、S期和G2期，主要进行DNA复制等准备工作。（一）前期前期（图10-3）的主要事件是：染色质凝缩，分裂极确立与纺锤体开始形成，核仁解体，核膜消失。图10-3 前期两个中心体向两极移动（图片来自http:/www.wadsworth.org/）前期最显著的特征是染色质通过螺旋化和折叠，变短变粗，形成光学显微镜下可以分辨的染色体，每条染色体包含2个染色单体。早在S期两个中心粒已完成复制，在前期移向两极，两对中心粒之间形成纺锤体微管，当核膜解体时，两对中心粒已到达两极，并在两者之间形成纺锤体，纺锤体微管包括：着丝点微管

12、（kinetochore mt）：由中心体发出，连接在着丝点上，负责将染色体牵引到纺锤体上，着丝点上具有马达蛋白。星体微管（astral mt）：由中心体向外放射出，末端结合有分子马达，负责两极的分离，同时确定纺锤体纵轴的方向。极体微管（polar mt或overlap mt）：由中心体发出，在纺锤体中部重叠，重叠部位结合有分子马达，负责将两极推开。有两类马达蛋白参与染色体、分裂极的分离，一类是dynein，另一类是kinesin。植物没有中心粒和星体，其纺锤体叫作无星纺锤体，分裂极的确定机理尚不明确。（二）前中期指由核膜解体到染色体排列到赤道面(equatorial plane)这一阶段（图

13、10-4）。纺锤体微管向细胞内部侵入，与染色体的着丝点结合。着丝点处的分子马达使染色体向微管的负端移动。在光镜下可以看到，此时染色体也就是既向一极移动也向另一极移动，是以振荡的方式移向纺锤体中部的。其原因是姊妹染色单体的着丝点都结合有微管和分子马达。图10-4 左，前中期； 右，中期（图片来自http:/www.wadsworth.org/）（三）中期指从染色体排列到赤道面上（图10-4右、10-5），到姊妹染色单体开始分向两极的一段时间，纵向观动物染色体呈辐射状排列。染色体两边的牵引力就像拔河一样达到平衡。图10-5 中期，右图显示与染色体联接的微管（图片来自http:/www.wadswo

14、rth.org/）（四）后期指姊妹染色单体分开并移向两极的时期，当子染色体到达两极后，标志这一时期结束（图10-6）。图10-6 后期姊妹染色单体分离（图片来自http:/www.wadsworth.org/）图10-7 后其A染色体分离，后期B两极延伸后期可以分为两个方面（图10-7）：后期A，指染色体向两极移动的过程。这是因为染色体着丝点微管在着丝点处去组装而缩短，在分子马达的作用下染色体向两极移动，体外实验证明即使在不存在ATP的情况下，染色体着丝点也有连接到正在去组装的微管上的能力，使染色体发生移动。后期B，指两极间距离拉大的过程。这是因为一方面极体微管延长，结合在极体微管重叠部分的马

15、达蛋白提供动力，推动两极分离，另一方面星体微管去组装而缩短，结合在星体微管正极的马达蛋白牵引两极距离加大。可见染色体的分离是在微管与分子马达的共同作用下实现的（图10-8）。后期A，B是用药物鉴定出来的，如紫杉酚（taxol）能结合在微管的(+)端，抑制微管(+)端去组装，从而抑制后期A。动物中通常先发生后期A，再后期B，但也有些只发生后期A，还有的后期A、B同时发生。植物细胞没有后期B。图10-8 马达蛋白和微管系统共同协作，使染色体分离（五）末期图10-9 末期末期（图10-9）是从子染色体到达两极，至形成两个新细胞为止的时期。末期涉及子核的形成和胞质分裂两个方面。1、子核的形成末期子核的

16、形成，大体经历了与前期相反的过程，即染色体解聚缩，核仁出现和核膜重新形成。核仁由染色体上的核仁组织中心形成（NORs），几个NORS共同组成一个大的核仁，因此核仁的数目通常比NORs的数目要少。前期核膜解体后，核纤层蛋白B与核膜残余小泡结合，末期核纤层蛋白B去磷酸化，介导核膜的重新装配。2、胞质分裂虽然核分裂与胞质分裂（cytokinesis）是相继发生的，但属于两个分离的过程，例如大多数昆虫的卵，核可进行多次分裂而无胞质分裂，某些藻类的多核细胞可长达数尺，以后胞质才分裂形成单核细胞。动物细胞的胞质分裂是以形成收缩环的方式完成的（图10-10），收缩环在后期形成，由大量平行排列的肌动蛋白和结合

17、在上面的myosin II等成分组成，用细胞松驰素及肌动蛋白和肌球蛋白抗体处理均能抑制收缩环的形成。不难想象胞质收缩环工作原理和肌肉收缩时一样的。图10-10 动细胞的胞质收缩环动物胞质分裂的另一特点是形成中体。末期纺锤体开始瓦解消失，但在纺锤体的中部微管数量增加，其中掺杂有高电子密度物质和囊状物，这一结构称为中体。在胞质分裂中的作用尚不清楚。图10-11 植物细胞成膜体的形成植物胞质分裂的机制不同于动物，后期或末期两极处微管消失，中间微管保留，并数量增加，形成桶状的成膜体(phragmoplast)。来自于高尔基体的囊泡沿微管转运到成膜体中间，融合形成细胞板。囊泡内的物质沉积为初生壁和中胶层

18、，囊泡膜形成新的质膜，由于两侧质膜来源于共同的囊泡，因而膜间有许多连通的管道，形成胞间连丝。源源不断运送来的囊泡向细胞板融合，使细胞板扩展，形成完整的细胞壁，将子细胞一分为二（图10-11）。第三节 减数分裂减数分裂（Meiosis）的特点是DNA复制一次，而细胞连续分裂两次，形成单倍体的精子和卵子（图10-12），通过受精作用又恢复二倍体，减数分裂过程中同源染色体间发生交换，使配子的遗传多样化，增加了后代的适应性，因此减数分裂不仅是保证生物种染色体数目稳定的机制，同且也是物种适应环境变化不断进化的机制。减数分裂可分为3种主要类型：配子减数分裂（gametic meiosis），也叫终端减数分

19、裂(terminal meiosis)，其特点是减数分裂和配子的发生紧密联系在一起，在雄性脊椎动物中，一个精母细胞经过减数分裂形成4个精细胞，后者在经过一系列的变态发育，形成成熟的精子。在雌性脊椎动物中，一个卵母细胞经过减数分裂形成1个卵细胞和2-3个极体。孢子减数分裂（sporic meiosis），也叫中间减数分裂(intermediate meiosis)，见于植物和某些藻类。其特点是减数分裂和配子发生没有直接的关系，减数分裂的结果是形成单倍体的配子体（小孢子和大孢子）。小孢子再经过两次有次分裂形成包含一个营养核和两个雄配子（精子）的成熟花粉（雄配子体），大孢子经过三次有丝分裂形成胚囊（

20、雌配子体），内含一个卵核、两个极核、3个反足细胞和两个助细胞。合子减数分裂（zygotic meiosis），也叫初始减数分裂(initial meiosis),仅见于真菌和某些原核生物，减数分裂发生于合子形成之后，形成单倍体的孢子，孢子通过有丝分裂产生新的单倍体后代。此外某些生物还具有体细胞减数分裂（somatic meiosis）现象，如在蚊子幼虫的肠道中，有一些由核内有丝分裂形成的多倍体细胞（可高达32X），在蛹期又通过减数分裂降低了染色体倍性，增加了细胞数目。减数分裂由紧密连接的两次分裂构成。通常减数分裂I分离的是同源染色体，所以称为异型分裂（heterotypic division）

21、或减数分裂（reductional division）。减数分裂II分离的是姊妹染色体，类似于有丝分裂，所以称为同型分裂（homotypic division）或均等分裂（equational division）。和有丝分裂一样为了描述方便将减数分裂分为几个期和亚期（图10-13）。图10-12 黑圆角蝉的精子发生图10-13 减数分裂模式图一、间期有丝分裂细胞在进入减数分裂之前要经过一个较长的间期，称前减数分裂间期(premeiotic interphase)或前减数分裂期(premeiosis)。前减数分裂期也可分为G1期、S期和G2期，在G1期和S期把麝香百合的花粉每细胞在体外培养，则发

22、现细胞进行有丝分裂，将G2晚期的细胞在体外培养则向减数分裂进行，说明G2期是有丝分裂向减数分裂转化的关键时期。和有丝分裂不同的是，DNA不仅在S期合成，而且也在前期合成一小部分。D. E. Wimber和 W. Prensky（1963）认为合线期-粗线期合成大约2%的DNA。Y. Hotta等人（1966）在百合属（Lilium）和延龄草属（Trillium）中发现，粗线期合成大约0.3%的DNA。称为合线期DNA（zyg-DNA）或粗线期DNA(P-DNA)。这些DNA的合成可能与联会复合体的形成有关。二、分裂期（一）减数分裂I1、前期I减数分裂的特殊过程主要发生在前期I，通常人为划分为5

23、个时期：细线期（leptotene）、合线期（zygotene）、粗线期（pachytene）、双线期（diplotene）、终变期（diakinesis）。必须注意的是这5个阶段本身是连续的，它们之间并没有截然的界限。1）细线期: 染色体呈细线状，具有念珠状的染色粒。持续时间最长，占减数分裂周期的40%。细线期虽然染色体已经复制，但光镜下分辨不出两条染色单体。由于染色体细线交织在一起，偏向核的一方，所以又称为凝线期(synizesis)，在有些物种中表现为染色体细线一端在核膜的一侧集中，另一端放射状伸出，形似花束，称为花束期(bouquet stage)。2）合线期：持续时间较长，占有丝分裂

24、周期的20%。亦称偶线期，是同源染色体配对的时期，这种配对称为联会(synapsis)。这一时期同源染色体间形成联会复合体(synaptonemal complex，SC)。在光镜下可以看到两条结合在一起的染色体，称为二价体（bivalent）。每一对同源染色体都经过复制，含四个染色单体，所以又称为四分体（tetrad）。3)粗线期：持续时间长达数天，此时染色体变短，结合紧密，在光镜下只在局部可以区分同源染色体，这一时期同源染色体的非姊妹染色单体之间发生交换的时期。在果蝇粗线期SC上具有与SC宽度相近的电子致密球状小体，称为重组节，与DNA的重组有关。4）双线期：联会的同源染色体相互排斥、开始

25、分离，但在交叉点(chiasma)上还保持着联系。双线期染色体进一步缩短，在电镜下已看不到联会复合体。交叉的数目和位置在每个二价体上并非是固定的，而随着时间推移，向端部移动，这种移动现象称为端化(terminalization)，端化过程一直进行到中期。植物细胞双线期一般较短，但在许多动物中双线期停留的时间非常长，人的卵母细胞在五个月胎儿中已达双线期，而一直到排卵都停在双线期，排卵年龄大约在12-50岁之间。成熟的卵细胞直到受精后，才迅速完成两次分裂，形成单倍体的卵核。在鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及无脊椎动物的昆虫中，双线期的二价体解螺旋而形成灯刷染色体，这一时期是卵黄积累的时期。5）终变期

26、：二价体显著变短，并向核周边移动，在核内均匀散开。所以是观察染色体的良好时期。由于交叉端化过程的进一步发展，故交叉数目减少，通常只有一至二个交叉。终变期二价体的形状表现出多样性,如V形、O形等。核仁此时开始消失，核被膜解体，但有的植物，如玉米，在终变期核仁仍然很显著。2、中期I核仁消失，核被膜解体，标志进入中期I，中期I的主要特点是染色体排列在赤道面上。每个二价体有4个着丝粒、姊妹染色单位的着丝粒定向于纺锤体的同一极，故称联合定向(co-orientation)。3、后期I二价体中的两条同源染色体分开，分别向两极移动。由于相互分离的是同源染色体，所以染色体数目减半。但每个子细胞的DNA含量仍为

27、2C。同源染色体随机分向两极，使母本和父本染色体重所组合，产生基因组的变异。如人类染色体是23对，染色体组合的方式有223个（不包括交换），因此除同卵孪生外，几乎不可能得到遗传上等同的后代。4、末期I染色体到达两极后，解旋为细丝状、核膜重建、核仁形成，同时进行胞质分裂。5、减数分裂间期在减数分裂I和II之间的间期很短，不进行DNA的合成，有些生物没有间期，而由末期I直接转为前期II。（二）减数分裂II可分为前、中、后、末四个四期，与有丝分裂相似。通过减数分裂一个精母细胞形成4个精子。而一个卵母细胞形成一个卵子及2-3个极体。三、联会复合体联会复合体（synaptonemal complex,

28、SC)是减数分裂合线期两条同源染色体之间形成的一种结构，它与染色体的配对，交换和分离密切相关。SC是同源染色体间形成的梯子样的结构。在电镜下观察，两侧是约40nm的侧生组分(lateral element)，电子密度很高，两侧之间为宽约100nm的中间区(intermediate space)，在电镜下是明亮区，在中间区的中央为中央组分(central element)，宽约30nm。侧生组分与中央组分之间有横向排列的粗约710nm的SC纤维，使SC外观呈梯子状（图10-14）。图10-14 一种昆虫的联会复合体长期以来人们认为SC将同源染色体组织在一起，使伸入SC的DNA之间产生重组，但实验

29、证明不仅SC的形成晚于基因重组的启动，而且基因突变不能形成SC的酵母中，同源染色体间照样可以发生交换。现在一般认为它与同源染色体间交换的完成有关。在磷钨酸染色的SC中央，还可以看到呈圆形或椭圆形的重组节(recombination nodules,RNs)，RNs是同源染色体发生交叉的部位，RNs上有基因交换所需要的酶。从形态学来看，SC形成合线期，成熟于粗线期，并存在数天，消失于双线期。联会复合体的形成与合线期DNA(Zyg-DNA)有关，在细线期或合线期加入DNA合成抑制剂，则抑制SC的形成。第四节 细胞周期调控一、研究背景 Rao和Johnson(1970、1972、1974)将Hela

30、细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)，这种现象叫做早熟染色体凝集(premature chromosome condensation)。G1期PCC为单线状，因DNA未复制。S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。图10-15 不同形态的PCC不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着M期细胞

31、具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)。早在1960s，Yoshio Masui发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂(Germinal Vesicle Breakdown，GVBD)，后来Sunkara将不同时期Hela细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现G1和S期的抽取物不能诱导GVBD，而G2和M期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子(MF)。后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的MF。这类物质被统称为MPF。1960s Leland Hartwell以芽殖酵母（图10-16）为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28基因，在G2/M转换点发挥重要的功能。Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。图10-16 裂殖酵母细胞周期1970s Paul Nurse等人以裂殖酵母（图10-17）为实验材料，同样发现了许多细胞周期调控基因，如：裂殖酵母cdc2、cdc25的突变型和在限制