中药中皂苷类化合物的抗氧化活性评价研究.docx

1、中药中皂苷类化合物的抗氧化活性评价研究中药中皂苷类化合物的抗氧化活性评价研究(作者： 单位： 邮编： )作者：王晶，刘春明，白鹤龙，李丽【摘要】 目的以人参、西洋参、三七中的皂苷类化合物为研究对象研究其抗氧化性能。方法采用 Photochemi-luminescenee (PCL)抗氧化活性体外评价体系为分析平台系统考察皂苷类化合物的抗氧化活性，并利用DPPH法进行对照评价。结果人参、西洋参和三七 95临 醇提取的皂苷类化合物均具有一定的清除自由基活性， 并且随着皂苷 含量的增加，其清除自由基能力增强。结论PCL法成功应用于皂苷类 化合物的清除自由基能力研究。【关键词】 人参；西洋参；三七；皂

2、苷类化合物； 抗氧化活性Abstract : ObjectiveTo explore the antioxidative activityof the saponins in Panax ginseng, Panax quinquefoljus and Panax notoginseng. MethodsPhotochemi-luminescenee (PCL) wasapplied to determine the antioxidative activity of the saponins for thefirst time, and DPPH method was developed f

3、or evaluat ing the scave nging activity of the extracts.Photochemi-lumi nesce nee (PCL) was applied to determ ine the an tioxidative activity ofthe saponins for the first time, and DPPHmethod was developed for evaluat ing the scave nging activity of theextracts.ResultsThe saponins of 95% ethanol ext

4、racts from Panax ginseng, Panax quinq uefoljus, Panax no tog inseng had obvious an ti-radical capacity, the efficie ncy in ereased withthe contents of major sap onins extracted frompla nts.C on clusi on PCL method is successfully applied to study the the an tioxidative activity of the sap onins.Key

5、words : Panax ginseng; Panax quinquefoljus; Panaxno togi nseng; Saponins; An tioxida nt现代研究发现很多疾病的发生与自由基反应有关。 活性氧自由基可直接或间接损伤 DNA导致DNA链断裂和染色体断裂1。因 此，研究清除氧自由基的物质是生命科学发展的必然趋势 24。传统中药在缓解衰老以及衰老性疾病的防治方面有着极为丰富的实 践经验，我国中草药资源丰富，因此从中草药中寻找低毒高效的抗氧 化剂是一个很好的途径。人参是具有极高药用价值的传统中药， 在中医治疗中常用于大补元气、调补五脏及延缓衰老，是一种重要的抗衰 老药

6、物，人参以及和它亲缘关系较近的西洋参、 三七的抗氧化作用已经被应用到食品和化妆品等领域。人参 Panaxginseng C.A.Mey.、西洋参 Panaxquinquefoljus L.、三七Pa nax notog in se ng (Burk) F.H.che n系五加科人参属中重 要的3种植物，是我国名贵中药材。三者主要的有效成分均为皂苷类 化合物，已有的研究表明，人参皂苷具有多种生理活性5,几乎可 作用于人体的各个生命系统6，7。研究发现人参皂苷类化合物具 有清除自由基的作用8，9，但是在自由基清除剂方面人参皂苷是 一种较弱的自由基清除剂，此特性在联合用药中有利于人参皂苷抗自 由基作

7、用的缓慢释放。近年研究中清除自由基的实验多采用 Fe nton、Haber-Weiss、DPPH法等紫外分光光度计法进行分析10，11，本 研究将光化学发光(PCL-photochemi-luminescenee)法应用于皂苷类 化合物的清除自由基能力分析。光化学发光(PCL)法是一种测定抗氧化剂和自由基的方法，其样品制备简单，分析时间短，试剂用量较少，不受温度和 pH值的影响，且由光化学法生成自由基，简单、快捷、可靠；并采用化学发 光法检测自由基，保证了极高的灵敏度。此法已成功测定了维生素片 剂的水溶性抗氧化能力12，此外这种方法在国内的应用报道还比 较少。采用不同体外抗氧化实验体系测定样品

8、时， 由于抗氧化作用 机制不同，有可能产生的结果也不一致，所以一般要求至少采用两种 方法来衡量样品的抗氧化活性13。本实验以人参、西洋参、三七 中的皂苷类化合物为研究对象， 采用Photochemi-luminescenee （PCL） 抗氧化活性体外评价体系为分析平台，系统考察皂苷类化合物的抗氧 化活性，并利用DPPH法进行对照评价，为应用一种较新的体外抗氧 化活性的方法提供实验数据。1材料与仪器实验所用液相试剂均为色谱纯试剂（CaledonLaboratoriesL Ltd 公司，加拿大），0.45卩m滤膜（安捷伦公司， 美国），其它试剂为分析纯 （北京化工厂），用于PCL分析的溶剂由An

9、alytikJena AG公司（德国）提供。二苯基苦基苯肼自由基 （1，1 -diphenyl- 2 - p icryhydrazyl ， DPPH-）购于 Sigma 公司（美国）。人参切片、西洋参切片、三七根部药材均购于北京同仁堂大药 房（长春分店），人参皂苷Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd和三七皂苷R1 对照品购于中国药品生物制品检定所。 Agile nt-1100 高效液相色谱（安捷伦公司，美国）；DU800紫外可见分光光度计（Backman公司，美 国）;旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；S180H超声清洗器（Elma 公司，德国）；BS124S电子天平（Sart

10、orius AG德国）；耶拿Photochem 抗氧化剂与自由基分析仪（AnalytikJena AG 公司，德国）。2方法2.1样品溶液的制备分别精密称取人参、西洋参、三七药材粉末（0.15 mm 粒径）1.006 3 ，1.004 7 ，1.002 7 g。用 30 ml，95%乙醇浸泡（2 h）超声提取30 min，提取3次。将乙醇提取液过滤，减压回收乙醇，浓缩至干，残渣用甲醇溶解过 0.45卩m滤膜，定容于10 ml容量瓶中，制得人参、西洋参和三七样品溶液。分别精密称取人参、西洋参、三七药材粉末（0.15 mn粒径）1.005 6 g、1.004 8 g 和 1.006 9 g。用 3

11、0 ml，95沱醇浸泡（2 h） 回流提取2h，提取3次。将乙醇提取液过滤，减压回收乙醇，浓缩 至干，残渣用甲醇溶解过0 .45卩m滤膜，定容于10 ml容量瓶中， 制得人参、西洋参和三七样品溶液。分别精密称取人参、西洋参、三七药材粉末（0.15 mm粒径） 1.007 8 g 1.0063 g 和 1.006 0g。用 30 ml，95%醇浸泡（2 h）60 C 水浴温浸提取2 h，提取3次。将乙醇提取液过滤，减压回收乙醇， 浓缩至干，残渣用甲醇溶解过 0.45卩m滤膜，定容于10 ml容量瓶 中，制得人参、西洋参和三七样品溶液。2.2高效液相色谱条件采用美国 Agilent1100系统，D

12、ADC极管 阵列检测器。Agile nt 1100 Series 自动进样器；Agile nt-C18 色谱 柱（4.6 mm x 250 mm 5卩m）（美国安捷伦），柱温35 C。采用二 元线性梯度洗脱，流速为0.5 ml /min，流动相组成为乙腈（A），0.05% 的磷酸水溶液（B），样品分析时间为50 min，样品进样量为10卩l， 检测波长为203 nm。流动相梯度：02 min，75%-75%B 250 min， 75%- 50% B2.3抗氧化活性的PCL法分析采用Photochem（Berlin,Germa ny超快速抗氧化剂和自由基全自动分析仪， 测定原理是由光化学法生成自

13、由基，并利用化学发光法检测自由基。发光氨 （Lumi nol） 是一种光致化学发光物质，通过测量反应所生成的光强度来测量自由 基的瞬间含量（光强与自由基含量成正比）14。在实验中使用有光 化学激发作用的光敏剂（Photosensitizer ，发光氨）激发反应分子， 使之在紫外灯的作用下以比正常条件下快 1000倍的速度发生氧化反应，迅速产生自由基。采用PCL-ACW-Kit方法测量人参、西洋参和三七提取物中水 溶性成分的抗氧化活性。首先，配置分析混合液为 1.0 ml反应缓冲液，包括 0.1 mol/L Sodium Carbonate （pH 10.5） 和 0.1 mmol/L Na2-

14、EDTA 1.5 ml ACW-diluent （water） ; 1 mmol/L Luminol （25 卩 l ），作为光敏剂激发反应分子，使其迅速产生自由基，同时又作为光 致化学发光物质。样品和标准品均为 10卩l。每个样品平行测试 2次。2.4抗氧化活性的DPPH法分析二苯基苦基苯肼自由基 （DPPH）是一种性质较为稳定的自由基，其溶液显紫色，在 515 nm处有最大吸收，当有自由基清除剂存在时，DPP H的单电子由于被配 对，其浓度减小而使其颜色变浅，吸光度值变小，这种颜色变浅的程 度与配对电子数成化学计量关系，因此可用比色法进行定量分析。清 除剂直接作用于 DPP H自由基，反应

15、时间短，用分光光度计即可测 定，该方法操作简单、直接、灵敏、快速，因此 DPPH分光测定法在 国内外广泛用于清除自由基物质性质的研究。取0.1 ml样品溶液，加入2 ml的60卩mol/L的DPPH溶液 混匀，放置30 min,以原溶剂调零点，在515 nm处测起吸光度为Ai ; 同法0.1 ml溶剂+2 ml DPPH溶液混匀测定吸光度极为 Ac; 0.1 ml 样品溶液+2 ml溶剂混匀测定吸光度极为 Aj。按下述公式计算其自由 基清除率。清除率(% = : 1- (Ai-Aj ) Aox 100%IP (%) = 1- (Ai-Aj ) /Ac100% 其中 Aj 反应样品 自身对吸光度

16、的贡献；Ai样品对DPPH乍用后的吸光度数值；Ac为 DPPH本身在测定波长的吸收。3结果3.1提取方法的确定人参、西洋参、三七的乙醇超声提取物以及 对照品的液相色谱图示于图1。分别采用3种提取方法提取3种药材 中的皂苷类化合物。结果见图2。对于3种药材，超声提取的效果均 较好，皂苷类化合物含量较高，且快速、安全、简便、溶剂消耗少， 常温提取其成分又不会被破坏，这一结果与文献所报道一致 15。3.2自由基清除作用的评价研究3.2.1自由基清除作用的PCL法评价研究通过采用PCL-ACW-Kit 方法测定不同物质的量(0, 0.5, 1, 2和3 nmol)的L-ascorbic acid（抗坏

17、血酸）得到标准曲线，即 Y 44.489X +5.3481, R2=0.990 8 。在实验中需要稀释样品溶液，以使滞后时间距落在标准曲线的线性范 围内。Photochem生标准曲线和测试样品的抗氧化活性都是自动进 行的，样品的抗氧化活性是用相当于 L-ascorbic acid的纳摩尔数来 计算。PCL法首次应用于皂苷类化合物的抗氧化活性研究。实验结果 表明，3种中药提取物清除自由基能力有所差别，其中三七和西洋参 提取物清除自由基能力比人参提取物强（见图 3）。不同提取方法对于提取物的清除自由基能力有较大影响，对于三七提取物的清除能力 来说，超声提取法回流提取法温浸提取法； 西洋参和人参提取

18、物的清 除自由基能力皆是回流提取法大于超声提取法，但是二者的差异不 大，而温浸提取法清除能力最弱。结果见图 3。3.2.2自由基清除作用的DPPH法评价研究采用上述的PCL法评 价了 3种中药提取物的清除自由基能力，为了参考比较，同时采用清 除DPPHI由基体外活性试验，对所提取的活性成分进行清除 DPPH1 由基作用的测定，对皂苷类化合物的清除自由基能力进行研究比较。 各提取物对DPPH自由基清除率如图4所示。实验结果表明，3种中 药的提取物对DPPH!由基的清除作用与PCL法评价的结果略有差别， 但大体趋势一致，三七提取物的清除能力西洋参提取物人参提取物， 但西洋参提取物清除自由基能力稍高

19、于人参， 相较于PCL法的评价结 果相差较小（见图34）。而不同提取方法对提取物的清除自由基的 影响与PCL法评价结果一致见图4。3.3提取物清除自由基能力的比较根据所测得到人参、西洋参、 三七中的主要皂苷的总量（见图2）。同时结合提取物对自由基的清除 实验，可以看出两个实验体系中所得到的提取物对自由基的清除效果 基本一致（见图34）。对于三七的提取物来说，其清除自由基的效 果随着皂苷含量的增加而显著增大， 对于提取的皂苷含量，超声提取 法回流提取法温浸提取法（见图 2），其清除自由基能力也是超声提 取法回流提取法温浸提取法（见图 34）。而西洋参和人参提取物的 皂苷含量和其清除自由基能力的趋

20、势略有差别。 实验结果表明，二者 都是超声提取法提取的效果要高于回流提取；但在清除自由基实验 中，回流提取法却表现出最好的清除自由基能力，超声提取法次之， 但二者的差别较小；而对西洋参和人参来说皆是温浸提取法的提取的 皂苷含量最低，其清除自由基能力也最弱。这可以说明皂苷的含量对 于自由基的清除能力有一定的影响，而之所以在西洋参和人参的提取 物中出现了皂苷含量与其清除自由基能力不相符的想象， 有可能是由 于回流提取法提取温度较高，提取的成分较复杂，对于自由基的清除 能力产生了一定影响，这有待于进一步的研究。4结论本实验采用超声、回流和温浸提取法对人参、西洋参和三七 中的皂苷类化合物进行提取，用高

21、效液相色谱技术定量分析了主要皂 苷的含量，同时结合PCL和DPPH青除自由基体外评价体系分析皂苷 类化合物的抗氧化活性，两种方法评价结果基本一致，实验结果表明, 人参、西洋参和三七的皂苷乙醇提取物均具有一定的清除自由基能力，皂苷含量高的提取物，其清除自由基能力较强。 PCL法可以应用于皂苷类化合物的清除自由基能力研究。【参考文献】1 Salem YH, Dulchavsky SA , Dutta S. Effect ofinhibition of Lipid peroxidation on myocardial oxidant damageJ .Surg.Res.1994, 56 (6) :

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