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1、植物生理研究技术兰科植物菌根及其共生真菌的初步研究wk兰科植物菌根及其共生真菌的研究概况XYZ2011兰科(Orchidaceae)植物种类繁多，分布广泛，是被子植物中的大科之一，是除菊科植物外的、最兴盛复杂的一类植物，全世界约有6个亚科725属近2500030000个原生种和大量的变种、品种，广泛分布于除两极和极端干旱沙漠地区以外的各种陆地生态系统中。包括了许多的著名药用植物和珍贵花卉，因而长期以来受到人们的普遍关注，科学家、园艺工作者也从各个角度对兰科植物进行了大量的研究。兰科植物的生活习性分为地生、附生和腐生。地生兰和附生兰为绿叶兰，腐生兰是非绿叶兰且在其生活史中仅开花期为地上生的，有些

2、产于澳大利亚干旱地区的腐生兰花甚至在地下完成其整个生活周期。兰科植物具有三大特点：第一、其花形状奇特，色彩艳丽，芳香宜人，授粉机制独特而复杂；第二、种子细小，仅具未分化的原胚；第三、在其生活史中，与真菌共生形成菌根。有关兰科菌根的研究，尤其是对植物种子萌发、早期生长及真菌在这一过程中的作用的广泛研究，使种子在人工控制条件下的共生与非共生萌发成为可能，为自种子培育兰科植物新品种提供了手段和依据，为研究兰科植物和真菌间的相互作用机制提供了较为理想的材料和方法。但是，对兰科植物菌根真菌的种类及成年兰根中植物与真菌的关系研究相对较少，本世纪80年代后对兰科菌根真菌的分类研究有了一些较为出色的工作。 本

3、世纪初，法国的Bernard和Burgeff真正揭开了兰科菌根之谜，认识到许多兰科植物没有菌根就不能正常的生长发育，甚至许多兰花的种子没有菌根真菌的感染就不能发芽。随后，国外开展了许多有关兰科菌根真菌在种子萌发方面的研究，主要集中在真能否促进种子萌发方面。七十至九十年代，对某些兰花的种子与菌根真菌共生萌发形成原球茎过程中的相互作用机制从结构方面作了较详细的论述，为自种子培育兰科植物新品种提供了手段和大量依据，但在菌根真菌的应用上，则以我国在天麻生产上的应用最为成功。另外，兰科植物菌根真菌的分类研究长期以来一直是一个令人困扰的问题，一方面，兰科菌根真菌除少数能形成产孢结构或有性子实体外，多数处于

4、不育的菌丝阶段，缺乏稳定的形态学和培养特征，另一方面，有关兰科菌根真菌分类的资料也较少。对菌根真菌种类的了解、种的确定是研究兰科植物菌根的一个基本环节。80年代后，国外在这方面有了一些较为出色的工作，但在我国，仅自天麻、细叶石斛和见血清中分离到几种菌根真菌。在兰花生活史中，成年兰是它们的主要生活阶段，也是兰科植物入药或作为观赏兰花的主要器官。因此，揭示成年兰根与菌根真菌之间的内在关系将为自然条件下兰科植物的栽培提供重要的理论依据，也是真正保护野生兰花资源的关键所在。目前仅有少量有关成年兰菌根显微结构的报道，缺乏更深入的研究。1兰科植物菌根的特点 兰科植物，无论绿叶兰还是非绿叶兰，在其生活史中必

5、须部分或完全依靠菌根真菌为其提供营养才能生存。兰科植物种子细小，其原胚不具备能使种子发芽并发育形成原球茎和幼苗所需的养分，因此，萌芽的种子必须从它处获得营养，特别是碳水化合物，才能生长发育。腐生兰没有叶绿素，是异养植物，完全依赖真菌为其提供养分完成其生活史。所以兰科植物在种子萌发阶段或在不能进行光合作用自养的时期，必须与菌根真菌共生，获得碳水化合物和其它营养物质。 一系列有关兰科植物菌根的研究表明，兰科植物自其共生真菌获得营养，而真菌作为异养性微生物，其碳源取自其它活的有机体或死的残留有机物上，而非其“寄主”兰科植物。所以兰科植物的菌根真菌往往又与附近的其它树木、树桩或土壤内的残留有机物相连。

6、目前已经发现有的真菌在与兰科植物形成内生菌根的同时，与其它植物形成外生菌根，三者间似乎存在某种三重共生平衡关系。 尽管在自然界几乎所有的兰科植物都有菌根，但菌根只形成在兰科植物的营养根上（当年形成的新根），而在贮藏根（根茎）上却没有菌根真菌侵染，气生根上也很少有菌根真菌存在。Gaumann(19561961)，Burges(1939)Nuesch(1963)和Arditti(1975)等的一系列研究证明兰科植物活的贮藏根可产生一种杀真菌物质兰酚(orchinol)(Harley & Smith1983)，从而抵抗真菌对它们的侵染。 兰科植物菌根常呈污白色、浅黄色或浅黄褐色，表面有松散的外生菌丝

7、与其它树木或残余有机物相连。菌丝具隔膜，在营养根或原球茎的皮层组织细胞内形成结状或螺旋状的菌丝圈菌丝结(Peloton)。不形成菌套和哈蒂氏网，是一种内生菌根。2形成兰科植物菌根的真菌 早在1840年，Link首先证实在兰科植物根内具有内生真菌。1846年，Reissek指出在雀巢兰Neottia nidusavis Rich等四种兰花的根中发现分布有真菌(Arditti，1967)，并被随之而来的大量工作证实，其中以Wahrlich(1886)的工作最为突出，他对来自世界各地的500种兰花的根进行了研究。法国的Noel Bernard(1899)在林中发现了大量Neottia L.的幼苗，并

8、注意到它们均被真菌侵染，从而推断真菌的侵染是种子萌发所必须的，并建立了种子与真菌的共生萌发实验证实了这一假设。至此，真正揭开了兰科菌根之谜，有关菌根真菌的种类和真菌对种子、幼苗和成熟植物作用的研究得到广泛开展(Burgeff，1932，1959；Downie，1940，1943a，b，1959a，b；Curtis，1936，1939，1943；Knudson，1922；Arditti，1967)，发现大量的兰根分离物均隶属于半知菌形式属丝核菌属(Rhiozoctonia)(Burgeff，1936)，包括R.repens，R.goodyerae-repentis和R.solani(Arditt

9、i，1967)。Catoni(1929)从Cypripedium sp.分离到的一个丝核菌菌株产生了有性世代，被鉴定为Corticium catonii.另外还发现Xerotus javanicus可与Gastrodia spp。形成菌根，Marasmius coniatus与Didmoplexis、Armillaria mellea与Galeola septentrionalis及Gastrodia elata也可形成菌根(Harley，1959)。Warcup和Talbot(Warcup&Talbot，1962一1980；Warcup，1982，1985，1988，1991)从澳大利亚兰根

10、中分离到大量属于丝核菌属的菌株，经培养形成了有性世代，鉴定后发现分别属于Thanatephorus (Corticium)，Ceratobasidium，Ypsilonidium，Sebacina和Tulasnella。Warcup(1975)和Jonsson & Nvlund(1979)发现有些绿叶兰的种子可与Oliveonia pauxilla和Favolaschia dybowskyana共生而萌发，而这两种菌都没有丝核菌阶段。大量具锁状连合的担子菌也自非绿叶兰中获得，因而一度认为兰根中的内生真菌可能都是担子菌，现已证实并非如此。在这些分离物中有些形成了子实体，分别为Mara smius

11、 coniatus，Xerotus javanicus，Hymenochate sp. Armillaria mellea和Fomes sp.(Kusano,1911；Burgeff,1932,1936；Hamada,1940；Hamada& Nakamura,1963)。Warcup(1981)用65种木材腐朽真菌对一种无叶绿素的蔓生兰科植物Galeola foliata的种进行接种试验，结果有7种白腐菌(如：彩绒革盖菌Coriolus versicolor)和2种层孔菌(Fomes sp.)能同种子共生，促进种子发芽(Harley & Smith,1983)，至此，有关兰科内生真菌的分离和

12、分类的研究除少数无丝核菌阶段的担子菌外，多数都是有关丝核菌菌株或至少部分特征是属于丝核菌的菌株在不同兰花或同种兰花根中的再次发现(Alexander & Hadley,1983;Harvais,1973;Harvais & Hadley,1967;Hadley & Williamson,1972;Nishikawa & Ui,1976)。对常规分离兰科内生真菌时所获得的隶属于丝抱纲(Hyphomycetes)的不育菌丝群(Mycelium radicis atrovirens(MRA)(Melin，1922)的多种真菌未给予注意。1985年后，加拿大学者R.S.Currah及其研究小组对北温带

13、的陆生兰花的内生真菌作了一系列的研究，发表了15个种，其中5个新种，l个新组合，分别隶属于Rhizoctonia，Phialocephala，Leptodontidium，Trichocladium，Trichosporiella，Epulorhiza，Ceratorhiza，Sebacina，Sistotrema，Moniliopsis，Thanatephorus和Ceratobasidium(Currah et al,1987a，b，1988，1990)，首次对生于兰根中的MRA类真菌作T研究(如Phialocephala，Leptodontidium等)，并对每个种的培养和形态特征作了详

14、细描述，为今后的研究工作提供了较准确而详实的资料。Moore(1987)将菌丝隔膜的特征与真菌分类相联系，根据隔膜的形态结构和菌丝细胞内细胞核的数目，对原包括在丝核菌属中的那些形态学上明显有区别的真菌进行研究并建立了3个新属：Ceratorhiza，Epulorhiza和Moniliopsis，各新属相应的有性世代分别为Ceratobasidium；Tulasnella和Sebacina；Thanatephorus。而丝核菌属则保留下来用来包括该属的模式种R.crocorum(Pers.)DC:Fr。这一分类体系使我们对丝核菌类真菌的认识更全面，进行分类鉴定时更准确、方便。Currah et

15、al(1992a，b)也研究了菌丝隔膜与兰科内生真菌分类的关系，证实以菌丝隔膜结构与细胞内核的数目为分类特征划分的类群与利用培养特征和菌丝显微结构为分类依据划分的类群是一致的，承认了Moore(1987)的3个新属，列出了兰科菌根内生真菌的最基本的检索表，记载了迄今已发现的兰科内生真菌15个属，29种和2个腐生类群，并附有主要的培养特征和形态结构特征的描述，为兰科菌根内生真菌的种类研究提供了较可靠的依据和有效的手段。在欧洲(Marchisio et al,1985;Salmia,1988)和亚洲部分地区(Tsutsui & Tomita,1986;Uetake et al,1992;Masuh

16、ara et al,1991;Terashita,1982;Hadley,1985)也有有关兰科菌根内生真菌的大量工作，但多未涉及到内生真菌的分类研究。 有关热带附生兰花菌根真菌的工作也很多(Hadley & Williamson,1972;Bermudes &Benzing,1989;Benzing,1981;Goh et al,1992)，但仅Hadley & Williamson(1972)对内生真菌种类作了研究，并鉴定出Ceratobasidium cornigerum(Bourdier)Rogers，Tulasnella calospora(Bourdier) Juel及几个丝核菌菌

17、株。Richardson(1993，1995)对哥斯达黎加的59种热带附生兰花菌根内生真菌的研究是较为杰出的。他发现有23个种的根中有菌丝结，从5个种中分离到T属于担子菌的内生真菌，分别是Ceratorhiza，Moniliopsis和Melanotus(Agaricales)，其中Melanotus是首次报道。其余的分离物属于子囊菌(Ascomycotina)和半知菌丝抱纲。子囊菌有Calonectria，Chaetomium，Eupenicillium，Glomerella，Hypoxyon，Leptosphaerulina，Nectria，Pseudollescheria，Xylaria

18、等9属；半知菌有Acremonium，Acrogenospora，Atlernaria，Arthrinium，Chloridium，Cladosporium，Codinaea，Curvularia，Dactylaria，Drechslera，Epicocchum，Fusarium，Geotrichopsis，Gliocladium，Hadrotrichum，Humicola，Malbranchea，Monilia，Nodulisporium，Periconiella，Pithomyces，Ramichloridium，Seytalidium，Stilbella，Tetracladium，Tro

19、Posporella，Verticillium，Mycelia sterilia group A，Mycelia sterilia group B等28属及2个不育菌丝组，附有各属种的描述，但没有探讨它们在种子萌发中的作用。 “兰科丝核菌类”及其他的兰科内生真菌的鉴定是非常困难的，一方面真菌本身缺乏稳定的形态学和培养特征，另一方面可靠的文献也很少。Andersen(1996)从形态学、超微结构和分子水平对40个隶属于丝核菌(Rhizoctonia sensu lato)的菌株(包括相应的有性世代和大量未鉴定的兰科内生真菌)的分类作了比较研究。证实了Moore(1987)对丝核菌属的重新划分。并

20、指出Epulorhiza的有性世代应限制在Tulasnella中，因为Sebacina菌株的菌丝隔膜孔的超微结构显著不同于Epulorhiaz。Ceratorhiza的菌株在菌株形态、隔膜孔超微结构及RFLPs图谱三方面与Moniliopsis难以区别，二者的区别仅限于核的数目的不同。Moniliopsis的有性世代限制在Thanatephorus中。Mordue et al(1989)，曾从培养特征、生化技术、菌株融合组等角度探讨了丝核菌类的分类，认为兰根中分离出的Thanatephorus pennatus，Rhizoctonia repens是独立的种。我国对兰科菌根真菌的分类研究仅见徐

21、锦堂等(1989)分离自天麻原球茎的紫箕小菇Mycena osmundicola和郭顺星(1991)自细叶石斛和见血清原球茎中分别分离到的微囊菌属(Microascus Zukal)和毛壳菌属(Chaetomium Kunze et Schmidt)的2个未定种菌株，但上述3个菌株(种)均可促进其“寄主”兰科植物的种子萌发。3兰科植物菌根的形成在大多数兰科植物的生活史中，菌根的形成分为两个阶段：第一个阶段是萌发幼苗的初次感染，是原球茎与共生真菌的相互作用时期。第二个阶段是成年兰新根(营养根)的再次感染，是成年兰根与真菌相互作用的时期。3.1原球茎与共生真菌的相互作用自然状态下，兰科植物种子萌发

22、时，必须与适当的菌根真菌共生，才能发育形成原球茎和幼苗。兰科植物种子非常细小，结构简单，仅由种皮及未分化的胚组成，无胚乳。通常在1个茹果中就含有成千上万个轻如尘埃的微粒种子。最大的种子平均千粒重不到10毫克，最小的种子千粒重不到1毫克。天麻(Gastrodia elata)种子呈纺锤形至新月形，平均长670微米，宽120微米，种皮由一层无色透明的长形薄壁细胞组成，侧壁木质化加厚，种胚居种子中部。种子成熟时胚处于原胚阶段，椭圆形，平均长180微米，宽100微米，由数十个原胚细胞和分生细胞组成，大略可分为57层。胚前端为分生组织，中间为原胚细胞，基部一个基细胞呈倒，三角形，为柄状细胞，柄状细胞外包

23、有一层形似胶状的非细胞结构物质，PAS染色阳性(徐锦堂，1980a，b，1993)。共生萌发是指当兰科植物种子与适当的真菌相遇时，二者形成共生关系，种子萌发形成原球茎并发育成幼苗的过程。自Benard(1904，1909)首次发现了兰科植物需依赖真菌的侵染才能生长发育，建立了种子的共生萌发实验方法，并指出可溶性的有机化合物至少可部分替代真菌的作用后，有关种子萌发的研究广泛地开展起来。Knudson(1922，1924)在本世纪20年代的一系列研究成功地在含糖培养基上培养出了兰花幼苗，建立了一套兰科植物种子的非共生萌发(无共生真菌存在，以有机化合物为碳源)实验方法和萌发所需的恰当的培养基配方，为

24、利用非绿叶兰幼苗的发生研究兰花种子萌发时对营养的要求，揭示菌根真菌在兰花幼苗发生过程中的作用提供了有效的手段，同时也为利用种子栽培兰花提供了一套可靠而简便的方法。目前已有大量的兰花种子通过该方法萌发成功，有的甚至可以开花(Harley，1959)，但在自然状态下，真菌的存在却是种子萌发形成原球茎及幼苗的必须条件(Burgeff，1936；1959)。实验室条件下对兰花原球茎与真菌共生物之间的共生关系的形成和结构特征的研究仅涉及到少数兰花的种，也很少涉及除丝核菌属真菌以外的其它兰科菌根真菌。Burgeff(1959)总结了早期原球茎真菌相互作用的观察，但最详细的有关这种关系的结构特征的论述是被丝

25、核菌属的种定殖的Dactylorhiza purpurella(CT. &T.A. Steph)Soo的原球茎(Hadley et al 1971；Hadley，1975，1982；Strullu & Gourret，1975)以及被Ceratobasidium cornigerum (Bourdot)Rogers定殖的Pterostylis cucullata R.Br.的原球茎(Clements，1988)。以后，Peterson & Currah(1990)对Goodyera repens与Ceratobasidium cereale、Rasmussen(1990)对Dactylorhi

26、za majalis与Epulorhizasp。、Uetakeetal(2992)对Spiranthessinensis与Rhizoctonia sp.以及Richardson(1992)对Platanthera hyperborea与Rhizoctonia cerealis或Ceratorhiza goodyerae一repentis之I司的共生关系的形成和结构特征的变化也进行了详细的研究。郭顺星(1990a，1991)研究了产于我国的白友、细叶石解、铁皮石解等的种子萌发及原球茎发育过程中与菌根真菌的互作。但上述工作多集中在陆生兰(地生兰)或少数附生兰中，对于腐生兰花的研究较少，仅有产于西澳

27、大利亚的地下生腐生兰Rhizanthella gardneri受到较多的关注。Dixon et al(1990)对该兰花的分布、生态习性、形态结构以及与其共生的菌根真菌间的关系等作了概括性论述。Rhizanthella gardneri的菌根真菌是丝核菌属的2个菌株，其有性世代是Thanatephorus(Warcup，1981，1985；Hadley，1982)。其中一个菌株产生的有性世代被鉴定为Thanatephorus gardneri Warcup(Warcup，1991)。该菌根真菌既可促进其“寄主”兰花的种子萌发，又可存在于地下生的块茎中为植物提供营养。对于腐生兰天麻的研究，近年来

28、在我国有很大的进展和突破。徐锦堂(1980，1981)成功地从天麻种子发芽后形成的原球茎中分离并筛选出十余个对天麻种子萌发有较好促进效果的菌株，其中一株形成了子实体，鉴定为紫箕小菇(Mycena osmundicola Lange)(徐锦堂等，1989)。证明了与天麻块茎共生的菌根真菌蜜环菌(Armilaria mellea)抑制天麻种子萌发(冉砚珠等，1988)，首次阐明了天麻必须先后与两种不同的真菌共生才能完成其生活史。这说明，在兰科植物中，种子的萌发与成年兰的生长发育可能与同一种真菌共生，也可能与不同的真菌共生，这似乎能解释为什么在有些共生萌发实验中，种子的萌发是成功的，但幼苗的移栽及成

29、年兰的生长却是失败的。也可部分地解释兰科植物与其菌根真菌之间的专一性的变化，因为迄今为止，专一性探讨均是建立在自成年兰根中分离到的菌根真菌与该“寄主”兰花种子之间的共生关系能否建立的基础上。如果兰花在种子萌发与成年兰阶段需与不同的真菌共生，那么仅据种子的共生萌发试验来评价兰科植物与真菌间的专一性显然是不充分的。因此，进一步研究其它兰科植物中是否也存在类似现象是很有必要的。 兰科植物种子的萌发始于种皮的破裂。在某些兰花中(如Cypripedium)，真菌首先突破种皮自胚柄端细胞进入胚中，然后在胚细胞内扩散，胚细胞膨大，使种皮破裂。而在其它的属如Phalaenopsis和cattelya中，种子吸

30、水膨胀，种皮破裂，然后真菌自胚柄端细胞侵入胚中(Jackson & Mason，1984)。有时菌丝也自根毛或胚柄细胞附近的表皮细胞侵入胚中(Hadley & williamson，1971；Purves & Hadley，1975)。当真菌菌丝穿过胚的细胞壁时，原球茎细胞的质膜内陷，真菌菌丝被其包围，植物细胞生理活性增强，出现大量的线粒体、内质网、高尔基体和各种大小的液泡，淀粉粒也开始形成，核明显的膨大(Burgeff，1932)。利用显微光密度计和放射性自显影技术，Williamson & Hadley(1969)测定了Dactylorchis purpurella和Spathiglott

31、is plicata与Tulasnella calospora共生时植物细胞内核的变化，发现核总是比不与真菌共生时大。侵入胚中的菌丝从一个细胞向另一个细胞侵染，原球茎基部的23层细胞往往被菌丝充满，菌丝在植物细胞中生长并形成菌丝结，增大了两共生物之间的接触界面。定殖于Dactylorchis purpurella皮层细胞中的菌丝的细胞壁分为二层，内层电子致密，较薄，与其自身质膜相邻，外层厚度度化较大，电子密度相对低些(Strullu & Gourret，1974)。Hadley et al(1971)也描述7类似的现象，并指出外层细胞壁呈颗粒状。Strullu(1978)认为外层壁可能完全或部

32、分是由于原球茎的作用产生的。Nieuwdrop(1972)进一步指出环绕菌丝的原球茎细胞质膜合成了这层壁的各种成分(果胶和纤维素)，而幼龄的菌丝和菌丝结可消化它们。Hadley(1975)进一步指出菌丝外层壁的形成是真菌与植物相互作用的产物，因为他认为菌丝本身的外层电子透明的壁完全不同于当它们存在于原球茎细胞内时的加厚、颗粒状的外层壁。刚刚侵入原球茎细胞中的真菌菌丝具有丰富的原生质，内含细胞核、液泡、线粒体、脂肪滴和糖原颗粒，无内质网(Strullu & Gourret，1974)。Hadley及其同事(1971，1975)观察到真菌的原生质膜也部分内陷形成泡囊状结构，推测这可能与共生体双方的

33、物质转运有关。还注意到真菌细胞的内层壁常在外层壁中形成突起，而与之相对的原球茎细胞质膜则在此处凹陷，可能也与物质转运有关。原球茎细胞内的菌丝结的寿命并不长，通常不过几天最多十几天就被消化了。Strullu & Gourret(1974)将菌丝自侵入到菌丝结被消化这一时期分为四个阶段:阶段一，指菌丝刚刚侵入原球茎细胞(如上描述)；阶段二，菌丝仍被原球茎细胞质膜单独环绕，菌丝扁化，外层细胞壁更厚，原生质已消失，仅剩一些质膜和颗粒状物质在缓慢分解；阶段三，菌丝结已完全衰败，菌丝内含物已完全消失，仅剩一团细胞壁被原球茎细胞质膜包围；阶段四，菌丝的形状已完全失去，细胞壁也已解体。此时，该原球茎细胞可被新菌丝重新定殖，形成新的胞内菌丝团。Uetake(1992)在研究Spiranthe