禽流感诊断方法研究进展讲解.docx

1、禽流感诊断方法研究进展讲解禽流感诊断方法研究进展摘 要：禽流感(Avian influenza,AI)是由正黏病毒科A 型流感病毒属中的不同亚型引起的禽类的一种急性高度接触性传染病1。由于亚型众多，而且各亚型或血清型之间无交叉反应性，这使得禽流感病毒的检测工作较为困难。实验室传统的诊断方法是病毒分离和血清学方法，病毒的分离鉴定是禽流感的经典诊断方法，其结果准确、可靠、灵敏、极少量病毒也可检出，但操作程序繁杂，检测周期长，需要其它的辅助检测手段。血清学方法如：血凝抑制试验、琼脂扩散试验、神经氨酸酶抑制试验、间接酶联免疫吸附试验等方法较之病毒分离具有更快速、准确、高效的特点，逐渐成为了禽流感确诊的

2、主流手段，但它主要是通过检测禽群体内抗体水平的变化，从而间接了解其体内病原感染情况的变化，具有明显的滞后性，不能适应当前养禽业的要求。当前面对禽流感病毒亚型众多、变异快的现状，人们迫切需要一种更高效的检测技术在更短时间内检测禽群感染情况。分子生物检测技术因其较之传统的检测方法更具有快速、敏感、特异等特点而倍受关注。关 键 词：禽流感病毒 病原学检测 血清学检测 分子学检测1 前言禽流感( Avian Influenza， AI)是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的危及禽类、人类和小型哺乳动物的以呼吸道症状为主，甚至全身性败血症的一种疫病，呈世界性发生和流行。根据血凝素(H)和神经氨酸酶

3、(N)，可将 A 型流感病毒分为不同亚型，已报道有16种血凝素H 亚型 ( H1-H16)和9种神经氨酸酶 N 亚型(N1-N9)2。A 型流感病毒感染人、猪、马、海豹、水貂、鲸及所有禽类。在正黏病毒科中A 型流感病毒是唯一感染禽类的病毒型。根据致病力的不同可以分为高致病性病毒(High Pathogenic Avian Influenza，HPAI) 和低致病性病毒(low pathogenic avian influenza，LPAI)。高致病性病毒可导致禽类大批死亡，并严重威胁着人类公共卫生安全；低致病性病毒低毒力株能明显降低家禽的生产性能，并在禽类间隐性传播，经抗原漂移或抗原转变形成新

4、毒株或毒力增强。早在 1878 年，Perroncito3就报道了禽流感在意大利的流行。1901年Centanni、Saranuzzi 4分离和描述了该病的病原，但直到 1995 年Schafer5证明该病属于A型流感病毒。高致病性禽流感通常由H5 和H7 亚型禽流感病毒引起，是严重危害养禽业的重大疫病，发病急剧、致病力强，发病率和死亡率可达到100%，能对养禽业造成毁灭性的打击，危害严重，是世界各国重点检疫和防范的对象。世界动物卫生组织(OIE)将其规定为A类传染病6，我国将其列为一类动物疫病。近年来，AI 流行呈上升态势，还接连不断地发生了H9N2、H7N7、H5N1亚型禽流感病毒感染人、

5、致人死亡的事例。世界卫生组织报告显示，仅2003年至2007年6月25日，世界范围内已报道有315人被感染，191 人死亡，引发了严重的社会公共卫生问题。我国于1979年首次分离到 AIV，1994 年报道AI在鸡群中流行，1996年在广东地区的鹅群中首次分离到 H5亚型 AIV。1997年，我国香港首次发生H5N1亚型 AIV 感染人并致人死亡的事件。据估计损失约达8000 万港币，这使得H5亚型禽流感病毒的公共卫生地位更加突出，在经历SARS之后，人们已认识到了高致病性禽流感潜在的危害性。禽流感被发现100多年来，各国政府都十分重视禽流感的防治研究，我国也有专门的机构研究禽流感。亚型众多是

6、禽流感最显著的生物学特征，再加上基因突变、重组和重排，使其变异极快，导致毒株的致病性也千差万别。而且，不同亚型或血清型之间无交叉反应性或反应性低，这使得禽流感的诊断监测工作较为困难，禽流感诊断方法的研究、开发与应用也越来越受到人们的关注。因此，快速、及时、准确地检测出禽流感对保障国民的生命财产安全具有重要意义。传统的诊断方法与近年来发展起来的分子生物学诊断方法以其不同的特点应用于科学研究和临床诊断。目前在国内外禽流感实验室主要有以下几种不同的诊断方法。2.病原学检测2.1病毒的分离鉴定用9-11日龄的SPF鸡胚分离增殖病毒，一般于24-120h出现死亡，收获尿囊液，此尿囊液即可能含有分离的病毒

7、。一般来说，初次分离的流感病毒具有血凝性，若无血凝性，可盲传3代，若仍然不出现血凝性，则可判断为阴性。有血凝性的病毒可能为流感病毒，可再作进一步的鉴定。分离鉴定的同时，进行致病力试验，确定毒力强弱。病毒的分离鉴定对禽流感的诊断比较确实，该方法具有精确、敏感的优点，但操作繁琐，耗时较长，需要一周左右时间。2.2 电镜检测技术由于流感病毒为正粘病毒，属于形态特征性强的病毒，因而可用电镜技术来诊断7，为提高禽流感的检出率，除样品制备技术外，取病料的部位和时间也是获得准确检验结果的关键。电镜技术快速、准确，但不能用于亚型及致病性的测定。3.血清学检测3.1血凝试验HA和血凝抑制试验HIAIV 能够与鸡

8、红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象又可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。血凝和血凝抑制试验可以鉴定病毒、检测血清中的抗体水平。HA加敏法是一种改进的HA试验方法，该法测抗体效价比常规法高2-4倍，若抗原用乙醚裂解，其敏感性比常规法高4-6倍，但观察时以30min内为好，否则易出现假阳性。HI试验时，应先除去非特异性凝集反应。许多禽类血清都含有非特异性血凝抑制因子，能和红细胞表面受体竞争性地作用于病毒表面的血凝素而发生非特异性凝集反应，通常用受体破坏酶即霍乱菌培养液处理法或高碘酸钠法制备血清8。3.2琼脂凝胶扩散试验(Agargel proliferate,AGP)抗体在琼脂中由

9、高浓度向低浓度自由扩散形成特异性肉眼可见的沉淀线，适用于检测所有A型AIV感染产生的血清抗体，也适用于鉴定AIV。这种方法简单易操作，但敏感性特异较差，易出现假阳性，且不能区分动物血清抗体阳性是病毒感染所致还是注射的疫苗所产生的抗体，所以不少学者希望能改进此方法。1986年 Wood 等9人成功地将免疫单辐射扩散试验应用于检测灭活疫苗中的HA抗体滴度，该方法操作简单，可重复性好，且敏感性强。AGP最常用的是免疫双扩散，赵增连、李海燕10分别开展了禽流感病毒快速定型双扩散法的研究，不仅提高了其敏感度，而且提高了检测速度。2000年，邓国华等11利用杆状病毒表达的禽流感病毒核蛋白建立了琼脂凝胶免疫

10、扩散诊断方法，该抗原可以特异地定性检测出所有15个禽流感病毒亚型的抗血清，并与我国广泛流行的15种禽类其他病原体的抗血清无交叉反应。3.3 病毒中和试验 病毒中和试验(virus neutralization test，VNT)检测 AIV及其亚型最敏感且特异的血清学方法。VNT作为经典的方法在病毒鉴定中是很重要的，很多新的检测方法都要与之进行比较。1999年Thoms等12报道，他们建立的用于 H5N1 AIV检测的微量中和试验的敏感性要高于HI试验，如同时结合运用H型特异的 Western-blotting试验，其敏感性可达80%，特异性达96%，但其操作繁琐耗时、耗材料，故在实际临床诊断

11、中不常使用。3.4酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(Ezyme linked immunosor-bentassay,ELISA)主要是用禽流感病毒型特异性抗原检测禽流感病毒型特异性抗体，是检测A型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快速的诊断技术，已成为AI流行病学及早期快速诊断的最有效和实用的方法。1974年Jenning等13首先用ELISA 对注射流感病毒后产生的抗体消长规律进行了检测。Meulemans14对ELISA、AGP、HI检测 AIV 抗体方法进行了比较研究，发现AGP和 ELISA 一样均能检测型特异性抗原(抗体)，但敏感性远低于 ELISA，HI适用于亚型

12、的检测，其敏感性不如ELISA。1993 年，Shodihall15用混合纤维素脂膜或硝酸纤维素膜代替微量反应板，建立了快速诊断的 DAS-ELISA，大大缩短了诊断时间，并可保留ELISA的特异性、敏感性，其结果又不需要特殊仪器分析，可用肉眼判定。肖运才等16对已知的阳性样品，用夹心 ELISA 法测得的病毒滴度比血球凝集滴度高16倍以上，且能检出其它亚型的禽流感病毒。2004 年，国内研制成功了H5亚型抗原捕获 ELISA 方法。ELISA成为AI流行病学普查及早期快速诊断的最有效和最实用的方法。3.5免疫荧光技术(IFT)IFT是利用被标记上荧光色素的抗原(或抗体)特异性地与抗体(或抗原

13、)结合，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应来进行观察的检测方法。IFA 最早用于鉴定AIV 的NP和MP抗原。用荧光标记禽流感病毒核糖蛋白(NP)或基质蛋白(MP)抗体检测组织触片中的禽流感病毒。1961年IFT就开始用于人类流感的快速诊断。1984年美国宾西法尼亚洲爆发禽流感时Skeeles17将IFT首次用于AIV的检测。IFT最早用于禽流感病毒的鉴定和定位病毒感染细胞中特异性抗原。IFT具有快速、简便、敏感性高等特点，易出现假阳性。3.6 神经氨酸酶抑制试验(Neuraminidase inhibition, NIT)NA是AIV的另一个重要的表面抗原，由RNA片段6编码，NA 分为N

14、1- N9共9个不同的型NIT主要用于AIV另一种表面抗原神经氨酸酶(NA)的亚型(N1- N9)的鉴定。NIT试验的一种改进法-平板微量NIT试验-于1993 年由VaDeuson 等18创立，用于A 型流感病毒的病毒分类和抗体检测的快速检测。该方法降低了抗原用量，且可对多种分离物同时进行抗原分类。3.7乳胶凝集试验 LATLAT 是以聚苯乙烯乳胶颗粒作为载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到血清中相应的抗体或处理过的病料中相应的抗原成份时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。LAT主要用来检测IgM抗体。LAT 的检测特点敏感性不如经典的HI试验，但由于不需要较高的实验技术和特定的仪器设备，简单、快速，

15、可方便地用于临床诊断和生产实践。喻正军等19以羧化的聚苯乙烯乳胶为载体，采用了共价偶联的技术，经双功能试剂将AIV 的HA 抗原表达产物和羧基化的乳胶共价偶联起来，对血清中特异性HA 抗体进行检测，克服了蛋白致敏普通乳胶时，致敏抗原量少、不稳定，致敏抗原上的蛋白容易脱落等缺点。3.8 胶体金免疫层析技术胶体金是20世纪80年代继三大标记技术荧光素、放射性同位素和酶后发展起来的固相标记免疫测定技术，它以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应对抗原或抗体进行定位定性乃至定量研究，是一种新兴技术。1971年，Faulk和Taylor20首先将其用于免疫电镜，目前成了荧光素、放射性同位素和酶标记以外的

16、一大补充。2004年，国内王传彬等21成功建立了H5亚型禽流感病毒单抗-生物素捕获ELISA流感病毒群特异性蛋白的单抗介导的斑点免疫金渗滤法(dotm imunogold filtration assay,DIG-FA)快速检测禽流感病毒，针对H5 HA蛋白为基础的用于禽流感 H5亚型诊断的胶体金免疫层析方法。2008年，彭伏虎22等用禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体4C4进行胶体金标记，建立了H9亚型禽流感病毒免疫层析检测法，适用于H9亚型禽流感病毒的现场检测及鉴别诊断。免疫胶体金试纸条检测禽流感可以现场操作，直接取喉气管、泄殖腔棉拭子以及脏器等进行检测，无须仪器设备，操作简单，20min内即

17、可初步判断是否有禽流感病毒存在，可广泛用于流感病毒的早期诊断。3.9压电生物传感器检测仪采用特殊处理涂有高分子膜和结合有禽流感病毒单克隆抗体的压电晶片作传感器，与数据收集系统和液晶屏组成的AIV压电生物传感器检测仪。可以定性 定量检测禽流感病毒，具有高灵敏度、小体积、快速、低成本、便于携带等优点。4 单链构型多态性( SSCP)作为检测基因变异的手段已得到广泛应用，其原理是单个核苷酸的置换引起 DNA单链构象改变，在非变性电泳中足以导致泳动率变化。Quinto等23用高通量 SSCP与限制性片段长度多性( RFLP)分析法对照，检测了近50株流感病毒的400多个基因片段，符合率为98%。5分子

18、生物学检测5.1反转录聚合酶链反应 RT-PCRRT-PCR技术可以从基因水平检测AIV的RNA，大大提高检测敏感性和缩短AIV的检出时间。近年来，以 RT-PCR为基础的各种诊断技术研究成为国内外研究的热点之一。依据其原理和技术特点的差异，RT-PCR技术又分为常规、巢式、荧光、多元PCR和PCR-RFLP、RRT-PCR等。多重 RT-PCR即mRTPCR，在RT-PCR 的基础上，再加入其他亚型或其他种病毒的特异性引物，以目的片段的不同长度相区别，可同时诊断多个亚型或多种病毒，使检测的效率和适用性大大提高。张应国等24研究建立了禽流感病毒A 型、H5、N1、H9、N2 亚型特异性RT-P

19、CR 及 H5/N1、H9/N2、A/ H5/ N1多重 RT-PCR 检测技术，该方法具有快速、敏感、特异等优点，为临床样品中AIV 型及H5N1、 H9N2亚型鉴定和诊断的有效方法。2003年，Munch等25将 RT-PCR方法进行了优化，建立了PCR-ELISA方法，用ELISA方法检测 PCR产物，试验证明其敏感性是传统电泳观察的100倍，能够检测到更微量的AIV。Dybkaer等26通过该法对禽流感病毒弱毒株( H5N2、H7N1亚型)进行检测，与鸡胚分离法相比，阳性率高出39%。Notomi等27于2000年建立了环介导恒等温扩增(loop-mediated isothermal

20、 amplification，LAMP)技术，是一种新型的核酸扩增技术。该方法应用广泛，适用于基层实验室进行快速检测。2008年，侯佳蕾等28根据H5亚型AIV血凝素基因序列，设计了一套特异识别HA基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增引物， 并以此套引物建立了一种基于LAMP技术的H5亚型禽流感病毒诊断方法。结果表明，该方法对H5-AIV RNA的最小检测限为10-6，灵敏度高于一步RT-PCR方法，全部反应可在1.5h内完成；在反应体系中添加SYBR GREEN I染料后，可通过肉眼观察有无荧光，直接判定结果。实时荧光定量RT-PCR，该方法是近几年发展起来的新技术，既保持PCR技术灵敏

21、、快速的特点又克服了假阳性和不能定量的缺点。目前主要有4种方法用于DNA 扩增产物的检测：双链DNA 结合染料法、分子信标(molecular beacon)法、杂交探针法、TaqMan 探针法。Erica等29应用一步法RT-PCR和荧光水解型探针，引物设计参照禽流感病毒HA基因序列，可用于检测A型禽流感病毒和及其H5、H7两个亚型。依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)，是一种新开发的分子生物学检测技术，一种连续、等温、基于酶反应的核酸扩增，整个反应有赖于反转录酶、噬菌体T7、RNA多聚酶和核糖核酸酶H(RNaseH)，2条寡核苷酸引物共同协作而完成，不需特殊仪器，不需温度循环，是以转录为基

22、础，单链核苷酸的连续扩增，其反应产物是单链 RNA。基于PCR原理的检测方法在扩增的过程中可能会丢掉很多信息，因此特别适用于扩增RNA模板。Collins等30检测了亚欧地区H5亚型 A IV同时还鉴别出高致病及低致病H5亚型。Lau等31建立的 NASBA技术可以检测 H1- H15亚型的AIV，并能区分出H5及H7亚型，整个过程从核酸分离到扩增检测，可在6h以内完成，灵敏度与鸡胚培养相当。该技术特点是整个扩增过程在恒温条件下进行，不受背景中DNA的干扰，不易发生交叉污染，扩增效率高于PCR，特异性好，不需要特殊(如PCR仪)的控温装置，可以同时检测50个样本，进行大规模检样。巢氏PCR 法

23、(RT-Nested PCR)，灵敏度高，可检测0.2pg的病毒核酸，适用于临床样品的检测。5.2基因探针诊断法基因芯片(gene chip)亦称DNA微阵列( DNA microarray)或寡核苷酸微阵列(oli-gonucleotide microarray)，是将大量的探针分子固定在固相支持物上，然后用不同荧光(红和绿)标记序列或样品(DNA或cDNA)与芯片上的探针进行杂交，将支持物上未发生互补结合反应的片段洗去，通过激光共聚焦显微镜扫描，借助计算机系统对荧光信号强弱的分析处理，推测出样品中大量相关基因的定量信息。2008 年，Xue等32通过设计AIV 的25个特异性引物和1个通用

24、引物，经 RT PCR或重叠PCR扩增出了这25个亚型的cDNA，研制出了一种能检测禽流感16个HA和9个NA的DNA 芯片。陈凤梅等33通过分子克隆操作，获得NDV，AIV，IBV，ILT，MG各一段特异性核苷酸序列，用芯片点样仪点样，同时点上用于系统监控的参照基因，制备成禽呼吸道疾病诊断基因芯片，可同时检测新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒和鸡毒支原体5种病原。一次试验即可对禽常见呼吸道疾病进行准确、快速特异的检测。由于基因芯片技术特异、敏感且允许同时扫描成百上千的核苷酸序列，已成为一种具有巨大潜能的禽流感诊断方法。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片断能与

25、其互补的核酸序列杂交形成双链核酸的探针技术，是目前在分子生物学和生物化学研究应用最广泛的技术之一。原位杂交是经适当处理后使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，2001年，黄庚明等34用 PCR技术制备了核蛋白基因片段NPC的地高辛标记cDNA探针，建立并优化了检测AIV的探针杂交法。该探针具有较好的特异性和敏感性，为从分子水平探讨AI的发病机理和临床早期快速诊断提供了新的研究手段。张万坡等35探讨了制备NP保守性的探针感染病毒的MDCK细胞进行原位杂交检测禽流感病毒RNA的方法，不但能很好地呈现病毒和细胞的位置关系。而且具有较

26、好的特异性和灵敏性，为禽流感病毒的组织原位杂交检测奠定了实验基础。5.3基质检测法基质检测法是近年来美国食品药物管理局认证的内源性病毒编码酶检测法。 研究表明A型和B型流感病毒的包膜表面存在基质，可将含A2酮糖，N2乙酰神经氨酸Neu5Ac的底物水解，将色素原标记在新合成的Neu5Ac上，就会形成基质底物。当A型和B型流感病毒存在时，基质底物就被病毒包膜表面存在的基质分解，释放出色素原，通过光测定装置就可以检测出，但是基质检测法只能用于A型和B型流感病毒的检测，而不能用于C型流感病毒的检测。Noyola等36应用标准板基质试剂盒对196份临床样品进行检测，并与病毒分离进行比较。其敏感性高达96

27、%，特异性为77%，阳性符合率59%，阴性率98%，但目前此方法在我国禽流感病毒检测中应用未见报道。6 新兴的禽流感病毒检测方法近年来禽流感在世界多个地区的不断暴发，引起了许多国家的警惕和重视。除了对传统检测方法的发展和完善，一些新兴的AIV 检测方法正在受到人们的更多关注。目前有报道使用的方法有纳米技术、质谱分析法、生物传感器法等。据刘旭辉等37国内学者报道，可将纳米量子点标记技术用于H5N1亚型AIV的快速检测，其敏感性比血凝试验高出4倍以上，与其他禽类病毒无交叉反应，整个检测过程大约只需3h。该方法的建立为我国高致病性禽流感的监测和诊断提供了一种有效的手段，具有良好的推广和应用前景。但是

28、纳米技术也有其潜在的危险，需要加强纳米技术的安全性研究。质谱分析(mass spectrometry,MS)是一种物理方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷离子，经加速电场的作用形成离子束进入质量分析器。在质量分析器中再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。最初质谱分析被用于原子量和同位素的确定。随着技术的发展，它也被人们用到了病毒的检测上。生物传感器是21世纪最具发展前景的高技术领域之一。目前研究人员正在研究一种能快速检测疾病的分子马达微动力生物传感器。该传感器将目前纳米科技研究分为两大新技术，即分子旋转马达和量

29、子点技术，与微流体通道技术等有机的结合到了一起，具有快速、灵敏、便宜等优点，除可用于AIV检测之外，还可用于肿瘤、艾滋病等其他重要病症的检测，具有更大范围推广应用的可行性。7 展望目前，国内外对流感病毒的检测主要包括对病毒抗原、流感特异性血清的检测和分子生物学检测。以上诊断方法和技术的建立在禽流感的防控中发挥着重要的作用，各种方法各有优缺点。病毒分离鉴定是经典的诊断方法，诊断结果比较确切，但不足之处是操作程序繁琐，费用高，费时费力(21d)，难以适应高致病性禽流感爆发时快速诊断的需求。免疫学诊断技术主要进行病毒鉴定、抗体检测和病毒型特异性抗原检测。由于AIV血清型众多，新的变异株不断出现，制备

30、血清型特异性单克隆抗体相对困难，且在各种免疫接种的情况下，血凝抑制试验等血清学诊断方法也会失去作用。另外实验过程需要在具备一定实验条件的实验室，并需要借助一定实验设备来完成，同样也不适应现场操作快速诊断的要求。分子生物学诊断技术具有敏感、快速、特异、能进行高通量样品检测等特点, 为传统的禽流感病毒检测方法开辟了另一条有效途径，显示出了其在控制禽流感暴发时的巨大价值。尽管如此，它仍然具有其局限性。它不能替代传统的病毒分离方法在鉴定病毒抗原特征性方面的优势，且其敏感性、特异性依赖于RNA提取过程、扩增所使用的酶及引物、探针长度这三个重要控制点掌握。如 RT-PCR、 RRT-PCR、NASBA等检

31、测方法，其影响试验结果的可变因素：引物、探针、酶及待检样品各型间都还未有标准品参照，检测结果仍存在置疑。目前，全世界学者们正在积极地建立一种全球性的统一分子检测标准。除了不断改进现有的检测方法，人们也正积极地致力于将一些新兴技术运用于禽流感的检测中，虽然这些技术还未能大规模的推广和使用，但它们却显示出了巨大的潜力，相信在不久的将来会有更多更快、更灵敏和特异的检测方法被用到禽流感的检测中来。参 考 文 献1Y.M.S a i f,主编.苏敬良,高福,索勋,主译.禽病学M.第11版.北京:中国农业出版社,2005:147-177.2甘孟侯.全球禽流感的流行形势J.中国预防兽医学报,2004,26(

32、6):468- 471.3Saberfar E,Forghani Fard M,Mosavi M.Multiplex reverse transcriptase PCR assay for typing and subtyping of influenza A(H5 and H9) virus in IranJ.Iran Biomed J,2007,11(2):69-74.4Thongtira A,Payungporn S,Keaw charoen J,et al.The single step mult iplex reverse transcription polymeras echain reactionas say for dect ecting H5 and H7 avianinfluenza A virusesJ.Tohoku J,2007,211: 75-79.5于康震,陈化兰,唐秀英.97香港禽流感J.中国畜禽传染病,1998,20: 187-191.6曹伟胜,辛朝安,梁昭平等.2004年亚洲H5N1亚型高致病性禽流感流行