血清清蛋白γ球蛋白的分离纯化与鉴定实验报告.docx

1、血清清蛋白球蛋白的分离纯化与鉴定实验报告生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称血清清蛋白、 -球蛋白的分离、纯化与鉴定实验日期实验地点合作者指导老师评分XX 教师签名 李某某 批改日期 2013-06-03格式要求： 正文请统一用： 小四号，宋体， 1.5倍行距；数字、英文用 Times New Roman； 标题用： 四号，黑体，加粗 。需强调的地方请用 蓝颜色标出。 不得出 现多行、多页空白现象。一、实验目的1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。3、了解柱

2、层析技术。二、实验原理1、粗提（盐析法）：蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。 当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电 离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电 荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质 颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同， 因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析， 便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来， 达到初步分离清蛋白、 球蛋白的目的2、脱盐（凝胶层析法）凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时

3、，溶液 中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动， 所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔 进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的 目的。3、纯化（离子交换层析法） 离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。 带正电荷的交 换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的 DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离 子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点

4、的不同可进行分离。血 清中各种蛋白质的 pI 各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷 不同，可以通过 DEAE离子交换层析将血清清蛋白和 -球蛋白分离出来。4、纯度鉴定（电泳）采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和 -球蛋白进行纯度鉴定， 以正常血 清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和 -球蛋白的纯度。三、材料与方法： 以流程图示意材料：1、样品：健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生）2、试剂：0.3mol/L 的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/L的 PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/L 的 PH6.5 醋酸铵缓冲液、 1.5mol

5、/L 的 NaCl-0.3mol/NH 4Ac 溶液、饱和硫酸铵溶液、 0.92mol/L（20%）磺基水杨酸、 0.05mol/L（1%）BaCl2 溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓 冲液、漂洗液。3、仪器及器材：层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑 色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、 电泳槽、直流稳压电泳仪方法：粗提脱盐纯化纯度鉴定（盐析法）凝胶层析法）离子交换层析法）（电泳）四、结果与讨论： 结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑 推论，并得出结论。结果：1、粗提（盐析法） :如图 1所示，往血清中缓慢滴加饱和硫

6、酸铵溶液后，溶液变浑浊，呈乳白色。离心后，溶液分为上层的上清液和下层沉淀，上清液呈浅黄色（见图 3），沉淀为白色。如图 2 所示，使用移液枪吸取上清液，从而分离上清液和沉淀。沉淀加水2、脱盐（凝胶层析法）和纯化（离子交换柱层析鉴定）：如图 5 所示，往层析柱中加样前，应先将层析柱中的上层液放出，用小烧杯接废液，直至下液面离柱床约 0.5cm。与葡聚糖凝胶 G-25 层析柱相对比， DEAE-纤维素层析柱的液体流出速度更缓慢。如图6 所示，往磺基水杨酸和 BaCl2 溶液中分别滴入流出液，生成白色沉淀，说明流出液中 含有蛋白质。白色沉淀越多，说明液体所含的蛋白质越多，以此选取浓度最高的 1 管球

7、蛋白进行醋酸纤维素薄膜电泳。图 5 DEAE-纤维素层析柱图6 磺基水杨酸和 BaCl2检测蛋白质呈阳性（红色圆圈为磺基水杨酸， 蓝色圆圈为 BaCl2 溶液）所示，染色后，薄膜上可见 5 条深蓝色横纹图 7 直流稳压电泳仪4、纯度鉴定（电泳）：如图 7 所示将醋酸纤维素薄膜架于电泳槽上，进行电泳。如图 8讨论：1、操作失误： 1）在进行球蛋白的除盐时，我们倒入球蛋白溶液后没有打开夹子让其进入凝胶柱，而 是接着倒入了 1ml 0.02mol/L NH4Ac 缓冲液，导致球蛋白被稀释。2）血清中各组分分离结果不佳，可能是点样过多。3）电泳图谱不整齐，可能是点样不均匀，或电泳时薄膜未放正。2、注意

8、事项：1）使用移液枪吸取上清液时，应注意从大往小调节吸取体积，小心吸取，避免吸取沉 淀物。2）使用层析柱时，注意不要让液面低于凝胶床 /纤维素床表面，以免空气进入凝胶床 / 纤维素床。3）往层析柱加液体时，注意不要将凝胶粒 /纤维素粒冲起，破坏凝胶床 /纤维素床表面的 平整。4）往层析柱加不同液体时，应先让上一种液体进入柱床后再添加另一种液体，否则样 品会被稀释，缓冲液等液体会失去其该有的作用。5）流出一定量液体时，要及时用磺基水杨酸和 BaCl2 检验流出液是否含有蛋白质，以 免蛋白质流失过多。6）点样线应窄于薄膜宽度，以免发生边缘效应。7）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓

9、冲液太多引起样品扩散。 但也不能太干，否则样品不易进入薄膜的网孔，导致电泳起始点参差不齐，影响分离效 果。8）点样线应窄而均匀，否则电泳图谱会不整齐。9）点样时应做好标记，以免弄混。标记要明显，以免染色漂洗后标记模糊消失。3、讨论题：1）硫酸铵盐析一步 , 为什么是 0.8ml 血清加 0.8ml 饱和硫酸铵 ?在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀， -球蛋白沉淀， 0.8ml 血清和 0.8ml 饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。 但硫酸铵会水解呈酸 性，如果浓度大的话酸性也很强，可能使蛋白质变性。若将血清加入饱和硫酸铵，会使 部分血清蛋白变性。所以要将硫酸铵慢慢加

10、入血清，边滴加边摇匀。2）为什么实验中 DEAE 纤维素柱分离 -球蛋白后不用再生 , 可直接用于纯化清蛋白 ?DEAE 纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合， 带正电荷的离子则不能， 这样便可达到分离纯化的目的。 -球蛋白带正电荷， 不与 DEAE 结合，会从层析柱中首先洗脱出来，所以可直接用于纯化清蛋白。3）应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和 -球蛋白的纯度 , 根据什么 来确定它是清蛋白还是 -球蛋白 ?判定它们纯度的依据是什么 ?正常人血清蛋白经醋酸纤维素薄膜电泳后可获得 5 条区带。-球蛋白的等电点约为 7.3，在 pH8.6 的巴比妥缓冲

11、液中， 带的负电荷最少， 在电场中比其它蛋白质移动速度慢。 而清蛋白等其它蛋白质的等电点均小于 7.3，在电场中比 -球蛋白移动速度快。其中清 蛋白等电点为 4.88，带负电荷最多，速度最快。且清蛋白在血清中含量最多。所以离点 样线最近的是 -球蛋白，离点样线最远的最粗的线是清蛋白。血清的电泳图谱上，从正 极端开始分别为清蛋白、 1-球蛋白、 2-球蛋白、 -球蛋白和 -球蛋白。对比血清的电泳 图谱与样品的电泳图谱上区带的位置，可知样品中含有哪种蛋白。经纯化后的清蛋白和 - 球蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳图谱上，若仅在清蛋白和 - 球蛋白位置上出现区带，说明纯度高；若在其它蛋白位置上出现区带，说明纯度低，含 有杂蛋白。