江苏省高校科研项目申报书范本.docx

1、江苏省高校科研项目申报书范本附件4-1-1-1：省普通高校学术学位研究生科研创新计划项目申报书 申 请 人：研 究 生 层 次： 博士研究生 硕士研究生一级学科名称： 基础医学 二级学科名称： 免疫学 研 究 方 向 ： 糖生物学 申请项目名称：TAK1的糖基化修饰在调节巨噬细胞炎症微环境中的作用 指 导 教 师 ： 季玉红 所 在 学 校 ： 大学 省学位委员会制表省教育厅二O一四年四月填 表 说 明一、填写本表前，应先仔细阅读省普通高校研究生科研创新计划项目实施与管理办法等有关文件与本说明，务必实事填写。二、填写本表栏目时，如需要可加附页。三、本表所有信息必须全部填写，不存在的容一律填“无

2、”。项目概况项目名称TAK1的糖基化修饰在调节巨噬细胞炎症微环境中的作用 项目类别A.人文社科项目B.自然科学项目起止年限 2014 年 05 月 至 2015 年 05 月 二级学科代 码1001二级学科名 称 100102重点学科国家级 省 级 申请人姓 名徐志伟性 别男出生年月1991年1月博（硕）士入学年月2013年9月所 在院 系 医学院联系电子信箱xuzhiweixy163.一、立项依据（包括项目来源，研究意义，国外研究现状、水平和发展趋势等） 炎症反应是机体免疫系统针对外界刺激如感染和组织损伤而产生的一种复杂的生理性反应,由趋化因子、细胞因子、脂类炎症介质等参与。巨噬细胞是炎症反

3、应的主要效应细胞,激活的巨噬细胞在炎症开始后迅速抵达炎症部位,参与吞噬病原体和分泌各种参与炎症反应的介质和细胞因子1-2】。炎症反应中所产生的 大量炎症介质在有效清除病原体的同时,也可造成正常细胞和组织的病理性损伤。因此,对炎症反应这把机体防御双刃剑的有效调控就显得尤为重要。巨噬细胞至少可以被分为两种类型:Ml型,即经典活化的巨噬细胞(Classicallyactivatedmacrophage)和MZ型,即替代性活化的巨噬细胞(Altemativelyaetivatedmacrophage)MI型巨噬细胞在细菌或其产物脂多糖(Lipopolysaceharides,LpS)或干扰素(Inte

4、rferon一了,IFN一丫)的诱导下产生,表现为:高递呈抗原的能力3-4】;高分泌白细胞介素12(Inierlukin一12,IL一12)和白细胞介素23(Inierlukin一23,IL一23)与其随后诱导的I型免疫应答;高产生毒性中间产物一氧化氮(Nitrieoxide,No),活性氧中间产物(Reaetiveoxygen intermediates,Rol):的能力因此,Ml型巨噬细胞被认为具有杀伤细菌和肿瘤细胞并可以分泌多种促炎性细胞因子的能力而MZ型巨噬细胞可由白细胞介素4(Interlukin一4,IL一4)!白细胞介素13(Interlukin一13,IL一13)!糖皮质激素!

5、转化生长因子一p(Transformatinggro诚hfacto卜p,TGF一p)和前列腺素EZ(ProstaglandinEZ,PGEZ)等诱导产生5,表现为:低的递呈抗原的能力;产生抑制细胞增殖和活性的细胞因子,如白细胞介素10(Interfukin一10,IL一10);较好的清除碎片的能力;促进血管生成和创伤愈合的能力。 转化生长因子（TGF）-活化激酶（TAK），也叫做丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7)，是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一员6。TAK在TNF的产生和其他炎性介质激活MAPK中有关键作用，比如p38a MAPK，c-Jun氨基末端激酶(JNK1/JNK2

6、)，ERK1/2和转录因子核因子kB (NFkB) kB (NFkB) ，TAK在几种细胞因子介导的先天免疫信号转导级联中很重要，包括TNF，IL-1和TGF-通路，也包括Toll样受体的下游信号和NOD1/2。在这些通路中，多个促炎细胞因子和毒素触发TAK的活动，引起自身磷酸化作用和IkB 激酶复合物的继发补充，最终导致转录因子NFkB的激活。原生形态的TAK包含一个催化激酶亚单位与调节亚基TAB（TAK1结合蛋白1，一种拟磷酸化酶）形成的复合物和两种同源蛋白TAB2 or TAB3之一。脂多糖或IL-1引起的TAK1的活化由Lys63相关的多聚泛素化肿瘤坏死因子受体相关因子6多聚泛素化触发

7、，它与TAB2和TAB3的碳端的锌指结构结合，刺激TAK1的自身磷酸化和活化7。 蛋白质的糖基化可以影响蛋白质的折叠、成熟、配体-受体结合与胞的信号转导，在维持生理功/或疾病的发生中均发挥重要作用8。越来越多的研究表明，蛋白质的糖基化修饰与巨噬细胞炎症的发生、发展密切相关。研究发现蛋白质糖基化修饰与机体的炎症反应密切相关，例如白细胞表面的整合素与选择素等细胞表面分子在被糖基化修饰后，能促进其向炎性部位募集，以完成免疫细胞识别/清除病原体等过程。最近的研究也表明蛋白质糖基化修饰参与胶巨噬细胞炎症微环境的形成与炎症的发生与发展9.巨噬细胞细胞表面的高级糖基化终产物（advanced glycosy

8、lation end product，AGE）能与巨噬细胞细胞表面高度聚糖化作用终产物的受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）相结合，抑制巨噬细胞释放细胞因子，上述研究结果表明蛋白糖基化修饰可影响巨噬细胞局部的炎症反应，在炎症过程中发挥重要作用10】。目前国外研究巨噬细胞炎症作用过程中所涉与的信号通路主要有，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号通路以与细胞核因子-kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-B）信号通路11。转化生长因子激活

9、激酶（TAK1，MEKK7）是MAP3K家族的成员之一，能被多种细胞因子包括IL-1，IL-18，TNF-等激活，处于这两条途径的分支点上12 。TAK1作为炎症反应中细胞信号传导上游重要的激酶，可能对巨噬细胞炎症起着重要的调节作用。其中经典NF-B信号通路的激活在炎症过程中发挥着关键性的作用。已有的研究表明脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的炎症模型中，TAK1的活性明显上调，以与炎症因子的表达稳定性增高13-14。但TAK1的糖基化对其炎症具体的分子调节机制尚不清楚。综上所述，TAK1是否存在糖基化的修饰？LPS刺激巨噬细胞炎性激活调节过程是否需要TAK1糖基化的参

10、与？具体的调节机制是什么？这些问题都值得我们深入研究。【参考文献】1Ayub A, Ashfaq UA, Haque A. HBV induced HCC: major risk factors from genetic to molecular level. Biomed Res Int. 2013;13(1):810461. 2Thomas DL. Global control of hepatitis C: where challenge meets opportunity. Nat Med. 2013;19(7):850-858.3Barone C, Koeberle D, Metse

11、laar H, Parisi G, Sansonno D, Spinzi G. Multidisciplinary approach for HCC patients: hepatology for the oncologists. Ann Oncol. 2013;24(2): 15-23.4Tian Y, Yang W, Song J, Wu Y, Ni B. Hepatitis B virus X protein-induced aberrant epigenetic modifications contributing to human hepatocellular carcinoma

12、pathogenesis. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2810-2816.5Lazo-Gmez R, Ramrez-Jarqun UN, Tovar-Y-Romo LB, Tapia R.Histone deacetylases and their role in motor neuron degeneration. Front Cell Neurosci. 2013;7(3):243.6Hojfeldt JW, Agger K, Helin K. Histone lysine demethylases as targets for anticancer thera

13、py. Nat Rev Drug Discov. 2013;12(12):917-30.7Parbin S, Kar S, Shilpi A, Sengupta D, Deb M, Rath SK, Patra SK. Histone deacetylases: a saga of perturbed acetylation homeostasis in cancer. J Histochem Cytochem. 2014 ;62(1):11-33.8Kelly RD, Cowley SM. The physiological roles of histone deacetylase (HDA

14、C) 1 and 2: complex co-stars with multiple leading parts. Biochem Soc Trans. 2013;41(3):741-749.9Reichert N, Choukrallah MA, Matthias P. Multiple roles of class I HDACs in proliferation, differentiation, and development. Cell Mol Life Sci. 2012;69(13):2173-2187. 10Schneider G, Krmer OH, Schmid RM, S

15、aur D. Acetylation as a transcriptional control mechanism-HDACs and HATs in pancreatic ductal adenocarcinoma. J Gastrointest Cancer. 2011;42(2):85-92. 11Di Marcotullio L, Canettieri G, Infante P, Greco A, Gulino A. Protected from the inside: endogenous histone deacetylase inhibitors and the road to

16、cancer.Biochim Biophys Acta. 2011;1815(2):241-252.12Gao C, Dimitrov T, Yong KJ, Tatetsu H, Jeong HW, Luo HR, Bradner JE, Tenen DG, Chai L. Targeting transcription factor SALL4 in acute myeloid leukemia by interrupting its interaction with an epigenetic complex. Blood. 2013;121(8):1413-1421. 13Jiang

17、Y, Iakova P, Jin J, Sullivan E, Sharin V, Hong IH, Anakk S, Mayor A, Darlington G, Finegold M, Moore D, Timchenko NA. Farnesoid X receptor inhibits gankyrin in mouse livers and prevents development of liver cancer. Hepatology. 2013;57(3):1098-1106.14Buurman R, Grlevik E, Schffer V, Eilers M, Sandbot

18、he M, Kreipe H, Wilkens L, Schlegelberger B, Khnel F, Skawran B. Histone deacetylases activate hepatocyte growth factor signaling by repressing microRNA-449 in hepatocellular carcinoma cells. Gastroenterology. 2012;143(3):811-820.注：项目名称应简洁明了，字数限25个汉字。二、研究目标、研究容和拟解决的主要问题研究目标： (1) 明确TAK1是否存在糖基化修饰（2）明确

19、TAK1的糖基化修饰在细胞炎症微环境中的作用；（3）明确TAK1的糖基化修饰在巨噬细胞炎症微环境中作用；（4）明确TAK1的糖基化修饰在巨噬细胞炎症因子分泌中的作用；研究容： 1.TAK1糖基化修饰在巨噬细胞炎症微环境中的作用。（1）TAK1糖基化位点的鉴定。分离、纯化TAK1的蛋白，利用糖基化抗体与质谱分析检测TAK1是否存在糖基化修饰与其可能的糖基化修饰位点；利用凝集素印迹与质谱鉴定其糖型与糖链结构。（2）TAK1糖基化修饰与巨噬细胞微环境之间的关系。分析炎症环境中TAK1的糖基化修饰在巨噬细胞；同时分析TAK1的糖基化修饰对巨噬细胞细胞因子分泌的影响。（3）TAK1糖基化修饰对巨噬细胞微

20、环境影响的分子机制。干预TAK1的糖基化修饰检测巨噬细胞号转导、调节的靶基因的表达与巨噬细胞生物学行为的改变；在此基础上构建炎症模型，分析干预TAK1的表达对巨噬细胞生物学行为的影响。（4）TAK1的糖基化修饰在巨噬细胞中磷酸化的作用。分析巨噬细胞中TAK1表达与糖基化修饰与磷酸化修饰之间的关系，抑制TAK1的糖基化后检测该分子磷酸化的变化。拟解决的关键科学问题：1.TAK1是否可通过 O-糖基化修饰影响巨噬细胞激活我们前期的研究在预测TAK1存在糖基化修饰位点的基础上，验证PPAR能发生 O糖基化修饰，深入分析其糖基化位点，发现其分别位于 TAK1 与TAB2结合域，而先前的研究也发现突变

21、PPAR 的糖基化位点可减少其对巨噬细胞激活的抑制，这表明 PPAR 可通过糖基化修饰影响巨噬细胞激活。在后续研究中我们将鉴定 PPAR 的糖链结构，并分析抑制其与TAB2结合，是否影响巨噬细胞激活。 2.促进 TAK1 的糖基化修饰是否能调节巨噬细胞炎性激活与其细胞因子的分泌？先前的研究也已经报道在 巨噬细胞炎症反应过程中， TAK1发生糖基化修饰后可促进巨噬细胞的激活，这提示 促进 TAK1的糖基化修饰影响巨噬细胞激活与其介导的细胞因子的分泌。抑制TAK1的糖基化后，下调炎症基因的表达，抑制巨噬细胞的激活与其介导的细胞因子。3.巨噬细胞的转染效率 课题组在前期研究中已经构建了以Flag为标

22、签的TAK1全长质粒，并用于HEK293T细胞中的过表达，已经取得了较好的结果。同时在前期研究中，课题组已经进行了巨噬细胞转染条件的优化，并取得了较高的转染效率。在进一步实验中，课题组将完善实验技术与方法，较好实现目标基因过表达的目的。三、课题的研究思路与方法、技术路线、试验方案（含创新性）与其可行性分析研究思路与方法:1. 分析小胶质细胞中 TAK1是否可发生 O-糖基化修饰。 a）构建TAK1真核表达载体，转染HEK293T细胞，免疫共沉淀后运用O-GlcNac抗体进行检测；同时将分离纯化得到的TAK1蛋白运用Click-iTTM O-GlcNAc Enzymatic Labeling S

23、ystem试剂盒进行反应，对TAK1进行可视化标记，检测TAK1是否可发生糖基化；b）将转染TAK1表达载体的HEK293T细胞分别用OGT的激活剂GlcNacstain与OGA的抑制剂CpOGA处理，分别运用免疫共沉淀纯化TAK1蛋白，运用O-GlcNac抗体进行检测明确TAK1可发生糖基化修饰；c）分别选取巨噬细胞的细胞株，运用免疫印迹检测TAK1的表达，在此基础上选取TAK1表达较高的细胞系运用TAK1抗体进行免疫共沉淀，免疫印迹检测TAK1的糖基化修饰。2. TAK1的O-GlcNAc修饰位点的确定。a）利用生物信息学方法分析预测TAK1的糖基化修饰位点，在此基础上构建点突变载体，分别

24、转染HEK293T细胞后，免疫共沉淀联合免疫印迹分析TAK1的糖基化位点；b）在此基础上分贝运用OGT的激活剂GlcNacstain与OGA的抑制剂CpOGA处理细胞，免疫共沉淀联合免疫印迹分析TAK1的可能的糖基化位点；分离纯化巨噬细胞中TAK1蛋白，运用ETD-MS/MS分析TAK1发生O-GlcNac修饰的糖基化位点。3.分析TAK1糖基化修饰与巨噬细胞炎症微环境之间的关系（a）将野生型与糖基化位点突变型的TAK1分别转染入巨噬细胞，收集细胞，采用MTT法、流式细胞术检测巨噬细胞细胞增殖情况；Realtime PCR法与ELISA法，检测巨噬细胞炎症相关细胞因子（IL-1、IL-6、TN

25、F-、IFN、IL-10等）的合成与分泌改变，分析TAK1糖基化修饰与巨噬细胞生物学行为改变之间的关系。（b）将野生型与糖基化位点突变型的TAK1分别转染入巨噬细胞，利用炎症细胞因子IL-1、LPS等刺激上述转染后巨噬细胞，模拟炎性微环境，不同时间点收集细胞，采用上述方法检测巨噬细胞的增殖、能力的改变，分析炎症环境中TAK1的糖基化修饰在巨噬细胞炎症微环境发生发展中的作用。（c）将野生型与糖基化位点突变型的TAK1分别转染入巨噬细胞，利用炎症细胞因子IL-1、LPS等刺激上述转染后巨噬细胞，分别采用Realtime PCR法与ELISA法，检测巨噬细胞炎症相关细胞因子（IL-1、IL-6、TN

26、F-、IFN-、IL-10等）的合成与分泌改变。（d）将野生型与糖基化位点突变型的TAK1分别转染入巨噬细胞，利用炎症细胞因子IL-1、TNF-等刺激上述转染后巨噬细胞，利用中和抗体阻断上述细胞因子的生物学效应，并检测上述增殖、炎性因子释放等指标变化，以分析巨噬细胞炎症微环境中TAK1的糖基化修饰在其炎症反应放大循环中的作用。4.分析TAK1的糖基化修饰对巨噬细胞炎症微环境影响的分子机制（a）将野生型与糖基化位点突变型TAK1真核表达载体转染入巨噬细胞，采用免疫共沉淀技术结合western blot，检测巨噬细胞中TAK1与TAB2结合的改变；采用western blot分析MKK信号转导通路

27、调节的JNK、ERK等基因的表达变化；采用MTT与流式细胞术分析TAK1糖基化修饰改变对该信号通路直接下游事件巨噬细胞的增殖的影响。（b）将野生型与糖基化位点突变型TAK1真核表达载体转染入巨噬细胞，采用免疫共沉淀技术结合western blot，检测巨噬细胞中TAK1与IKK、结合的改变；采用western blot分析IKK信号转导通路调节的IKK、等基因的表达变化。（c）将野生型与糖基化位点突变型TAK1真核表达载体转染入巨噬细胞，采用免疫共沉淀技术结合western blot，检测胶质瘤细胞中MTDH与p65结合的改变；采用核浆分离技术、细胞免疫荧光技术，检测TAK1与p65的核浆分布

28、情况，分析TAK1糖基化修饰对于p65向细胞核转运情况的影响；采用western blot分析IB的磷酸化水平变化；采用荧光素酶报告基因技术，分析TAK1糖基化修饰对于细胞核NF-B活性的影响；采用Realtime PCR技术、ELISA法，检测炎性细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-、IFN-、IL-10等）的合成与分泌改变。（d）在此基础上，分别利用多种炎症因子IL-1、TNF-等处理巨噬细胞，模拟巨噬细胞炎症微环境，并干预TAK1的表达，分析其对上述信号转导激活的影响。5. 分析 TAK1发生0-糖基化修饰对巨噬细胞激活的影响。(1)TAK1发生 N-糖基化修饰对 TAK1 与IKK结

29、合能力的影响。 a） 将野生型与糖基化位点突变的 TAK1 转染巨噬细胞后，检测外转受体的表达情况； b） 利用 FITC 标记的 15-P-DJ 处理巨噬细胞 1 小时，固定细胞，流式细胞术检测细胞表面绿色荧光的结合情况，观察干预TAK1 糖基化修饰对其与IKK结合能力的影响。(c） MTT 法检测上所述巨噬细胞中细胞活力的变化，ELISA 检测上述细胞中细胞因子分泌的变化，同时收集细胞蛋白，免疫印迹检测细胞活化标记物的变化； 6.分析TAK1发生0-糖基化修饰对巨噬细胞磷酸化的影响（a）将野生型与糖基化位点突变型TAK1真核表达载体转染入巨噬细胞，采用免疫共沉淀技术结合western bl

30、ot,检测TAK1的磷酸化的变化（b）将野生型与糖基化位点突变型TAK1真核表达载体转染入巨噬细胞，在炎症因子的刺激的情况下，采用western blot检测TAK1以与靶定下游分子的磷酸化变化 技术路线：创新性：（1）本项目研究的特色之处：本项目以炎症发生过程中蛋白质翻译后的O-GlcNAc修饰为核心，以TAK1的糖基化修饰为切入点，系统的从细胞生物学、分子生物学、组织病理学与实验动物学等多学科系统的研究刺激情况下TAK1的O-GlcNAc修饰在巨噬细胞炎症发生与发展中的作用，为研究巨噬细胞炎症的发生机制，寻找炎症治疗方法提供理论依据。这是本项目的特色之处。（2）本项目研究的创新之处：本项目

31、研究中将蛋白质糖基化修饰引入到巨噬细胞炎症的调解中，从糖生物学角度研究表观遗传学的调控机制。本项目的研究可为阐明多因素导致的炎症发生发展的分子机制提供理论依据。这是本项目研究的创新之处。可行性：（1）立项依据充分，预实验结果明确，课题研究理论可行。前期的研究发现TAK1蛋白质的糖基化修饰参与巨噬细胞炎症的发展，而TAK1也被报道参与炎症的发生发展。课题组在前期的研究中发现TAK1可以发生呢个O-糖基化修饰，并在前期的研究中发现炎症情况下O-GlcNAc明显增加，这提示在巨噬细胞炎症发生发展过程中，TAK1的糖基化修饰促进炎症的发生与发展。（2）成员队伍合理，学科层次全面，项目研究人员可行。项目研究组成员来自外科学、分子生物学、组织病理学等多学科，拥有多学科的而研究背景，为项目的完成提供理论支持；同时项目组中有多位成员主持与参加国家自然科学基金的研究，具有完成本课题的能力。（3）研究方法多样，研究的技术可行。项目组在前期的研究中已经系统的掌握细胞生物学、分子生物学、组织病理学、实验动物学、表观遗传学等多学科的研究技术与方法，可为本课题的研究提供技术支持。四、研究工作的总体安排与进度2013年01月-2015年12月 分析TAK1存在糖基化修饰；在此基础上分析TAK1的O-GlcNAc修饰位点。参加国学术会议