基于花生四烯酸代谢通路研究中药活性成分对脂多糖诱导炎症模型的影响.docx

1、基于花生四烯酸代谢通路研究中药活性成分对脂多糖诱导炎症模型的影响基于花生四烯酸代谢通路研究中药活性成分对脂多糖诱导炎症模型的影响第一章 绪论 1.1 类二十烷酸介绍 类二十烷酸也称类花生酸（eicosanoid），包括前列腺素类(prostaglandin)，凝血恶烷类(thromboxane)和白细胞三烯类(leucotriene)，是一大类由许多哺乳动物组织产生的激素类的物质。它们只在产生的器官中起作用，所以称为自泌调控分子，而不是激素。不饱和脂肪酸（）是指含有两个或两个 以上不饱和双键且碳原子数为 16 22的直链脂肪酸，也叫多烯脂肪酸。多不饱和脂肪酸根据第一个双键出现的位置可以分为 3

2、、6 79系列，其中3和6系列多不饱和脂肪酸具有重要的生物学作 用。亚麻酸（）、二十碳五烯酸（）和二十二 碳六烯酸（）是典型的 3系列多不饱和脂肪酸，双高亚麻油酸（）、亚油酸（）和 花生四烯酸（）是典型的 6 系列多不饱和脂肪酸。 类二十烷酸（）也称类花生酸，是一大类由二十碳多不饱和脂肪酸（、 等）氧化产生的具有生物活性的物质。 等将类二十烷酸的概念进一步扩大，将十八碳的不饱和脂肪酸和二十二碳的不饱和脂肪酸（二十二碳五烯酸（）和 ）等经氧化产生的具有生物活性的物质一并归入类二十烷酸。大部分类二十烷酸由游离的 生成。 类二十烷酸是一大类由二十碳多不饱和脂肪酸氧化产生的具有生物活性的不饱和脂肪酸，

3、是重要的炎症因 子，广泛存在于体液和组织中，调节体内众多生理和病理过程。类二十烷酸在生物体内种类众多，含量较低，并且 存在大量同分异构体，因此生物体内类二十烷酸的分离和分析具有较大的挑战。1.2 类二十烷酸的分析方法1.2.1酶免疫分析法 酶免疫分析法（）是定量分析类二十烷酸最常用的方法。 是利用抗原抗体特异性结合的原理，以酶标记的抗原或抗体作为示踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光，从而进行定量分析的一种 非放射性的分析方法 。检出限极低、灵敏度高、操作简单，但受限于商品化的酶示踪物和抗体种类及数量，难以进行高通量分析。的专属性较差，抗体易与具有类似结构的非目标类二十烷酸发生交叉反应，出现假

4、阳性的结果。较多应用于实验和临床研究中。 Kowal-bielecka等采用ELA对COX、5-LOX和15-LOX氧化生成的类二十烷酸进行分析。对 32 例硬皮性肺病患者、16例未患硬皮性肺病的系统硬化症患者和 12 例正常人的支气管肺泡灌洗液 （）中的 、15和 进行定量分析。发现 4的含量在3组人中有显著性差异，其机制有待进一步研究。Ciebiada等采用 定量检测肺癌患者的呼出气冷凝液（）和 种类二十烷酸8、cys-LTs和PGE并进行对比。发现 和的4种类二十烷酸含量变化呈正相关，即 中的类二十烷酸变化可反映其在 中的含量变化，因此监测 中类二十烷酸 含量的变化有望成为一种监测肺癌疾

5、病变化和评估 治疗效果的无损伤监测方法。 等采用 定量检测低剂量阿司匹林对人免疫缺陷病毒（）相关的神经认知功能障碍模型动物脑组织中的GE、LTB、8-isoprostane、15-HETE和LXA等9种类二十烷酸，发现长期用低剂量的阿司匹林喂食1 转基因大鼠后，其脑组织中 8、 15、和LTB 显著性降低，这表明低剂量的阿司匹林可以降低炎症反应，上调大鼠脑组织代谢并促进神经认知功能障碍。1.2.2 液相色谱分析法 液相色谱是一项具有高分离效率、高选择性、高灵敏度、应用范围最广泛的色谱分离技术。与气相色谱不同，液相色谱的分离不需要高柱温，因此液相色谱可以分离热不稳定、不易挥发的样品。但由于 大多

6、数类二十烷酸不具有紫外吸收性能或紫外吸收较弱，常用的紫外检测器（）并不适用于类二十烷酸的定量分析，蒸发光散射检测器（）虽是一种通用型检测器，其较差的灵敏度难以适用于含 量极低的类二十烷酸的检测。荧光检测器（）具有高选择性和高灵敏度，但其仅对荧光物质有响 应，因此需要选择合适的荧光标记物对类二十烷酸进行衍生化。 等为提高 检测 类二十烷酸的灵敏度，选用荧光标记物 2-（2，3 ） （-）对 12 种类二十烷酸进行标记，并利用 - 建立了一套具有较高灵敏度、高选择性的分析方法。该方法定量限为10g/L，且在10-250g/L的质量浓度范围内线性关系良好，也具有较好的准确度和精密度，但是该方法仍需要

7、对类二十烷 酸进行衍生化处理，前处理步骤繁琐。1.2.3 色谱质谱联用分析 色谱-质谱联用技术将色谱卓越的分离能力和质谱的准确定性及定量优势相结合,是目前应用最广泛的技术。三重四极杆质谱具有强大的定量能力，其多反应监测（）模式可通过选择性地采集母离子和相对应的特征子离子对共流出的不同种类的类二十烷酸和同分异构的类二十烷酸进行选择性检测。 1.3 炎症与花生四烯酸代谢通路1.3.1 COX通路 环氧化酶12(COX-12)或称前列腺素H合成酶(PGHS)是花生四烯酸代谢中的关键酶之一。组成型表达酶COX-1负责机体在本底水平的PGE2的表达或者刺激下瞬间的PG的表达。COX-2在正常生理条件下几

8、乎无表达，当身体组织受到某种刺激如外伤、感染或者某种因子如细胞因子和生长因子等的诱导时，COX-2高度表达。近年来新发现了COX家族的另外一种变构体1COX-3或称COX-b，它是COX-1的一个剪接变构体，其基因序列与COX-2不同之处在于COX-3保留了内含子1序列。COX-3也可催化PGH2的生成，主要表达于大脑和心脏的微血管中，其活性可被醋氨酚抑制，是一个新的药物靶点。 AA经COXl2氧化生成PGH2，大多数细胞中PGH2经微粒体PGE2合成酶(m PGES)作用进而生成PGE2。PGE2几乎能够在所有的人体细胞中合成，并且通过4种G蛋白偶联受体：EPl、EP2、EP3、EP4组成的

9、信号通路发挥极其复杂的生理作用。在炎症反应中，PGE2涉及到所有炎症的经典过程：红、肿、疼。由于PGE2导致的动脉扩张进而引起炎症组织中血流加快增多和血管通透性增强最终引发红肿症状。PGE2通过其EP1受体传递信号，作用于炎症部位的外周感觉神经元和中枢神经位点，最终导致痛觉过敏。 PGE2在免疫系统调节过程发挥着复杂的作用。PGE：可作为前炎症因子调节炎症过程中免疫细胞的分化或上调细胞因子的表达，起到促进炎症发生的作用。PGE2可以促进T细胞向T辅助细胞(Th1或者Th2)分化。然而，Sugimoto和Narumiya使用不同的EP受体缺陷型基因敲除小鼠，证实PGE2不仅仅作为前炎症因子起作用

10、，同时也能发起抗炎反应。PGE2能够抑制向Th2细胞的分化、B细胞功能，进而抑制过敏反应。1.3.2 LOX通路 LOX通路至少有3种酶：5-LOX、12-LoX和15-LOX参与了AA的代谢。其中5-LOX和15-LOX研究较多。5-LOX催化途径：5-LOX在5-LOX激活蛋白(5-FLAP)的协助下催化AA转化生成白三烯，LTA4不稳定，可以通过水解或与谷胱甘肽结合或跨细胞转移代谢生成具有生物活性的类二十烷酸。在中性粒细胞和其他炎症细胞中，LTA4由环氧化物水解酶(LTA4H)催化生成LTB4。LTA4与谷胱甘肽结合转化为LTC4，而LTC4转运至细胞外并裂解形成LTD4和LTE4。 形

11、成白三烯的5-LOX通路在前炎症级联反应中起到很重要的作用。LTB4是一个潜在的中性粒细胞的化学趋化剂，而LTB4和LTD4是嗜酸性粒细胞的化学趋化物。LTC4、LTD4、LTE4均含有一个半胱氨酸残基(cysteine)，故统称为cysLTs，被认为是过敏反应的慢反应物，是重要的炎症介质。在哮喘中，cysLTs能够显著调节炎症反应，包括引起气道平滑肌收缩和黏液分泌、招募免疫细胞引起过敏反应、调节细胞因子的生成分泌。cysLT能够引起和增强炎症过程中后微静脉的血浆渗透和黏液分泌，调节Th2细胞依赖的抗原驱使的肺炎症反应。在体内，cysLT在肥大细胞的生长或迁移中发挥至关重要的作用，在cysLT

12、1受体介导下由旁分泌方式组成性地刺激骨髓源性肥大细胞，使其发生脱颗粒作用，释放出组胺等炎症介质。 15-LOX催化途径：在炎症等病理过程中，AA通过跨细胞途径，经15-LOX催化，通过血小板和白细胞的接触反应最后生成脂氧素(Lipoxin,LX)。LX可抑制脂多糖(LPS)诱导的单核巨噬细胞向DC的分化和DC成熟，下调抗原提呈细胞表面MHC-II及协同刺激分子表达，从而在一定程度上阻断T细胞活化信号。脂氧素通过抑制NF-KB的活化抑制内皮细胞和巨噬细胞中LPS诱导引起的炎症。1.3.3 CYP通路 AA从经细胞色素P450(cytochrome P450 CYP)家族的环氧化酶催化生成环氧二十

13、碳三烯酸(EETs)，主要有4种EET异构体：5，6-EET、8，9-EET、11，12-EET、14，15-EET。EETs主要经可溶性的环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH)水解生成生物活性较弱的DHETs，sEH是EETs代谢中的关键酶之一，通过对sEH活性的调控可改变体内EETs的水平。 在脉管系统和肾脏中，EETs可降血压和抑制血管炎症。在一些血管床中，EETs尤其是ll，12-EET和14，15-EET作为内皮来源的一类超极化因子或称为内皮衍生的超极化因子(EDHF)，通过激活平滑肌中K+通道引起平滑肌的超极化核血管舒张，进而降血压。sEH抑制

14、剂通过保持高水平的EETs起到降血压的作用。例如sEH抑制剂DCU剂量依赖地抑制血管平滑肌细胞增殖。血管内皮细胞中，EETs增加Ca2+内涌，增强纤维蛋白溶解，刺激血管内皮细胞形态生成，进而起到抑制细胞因子诱导的炎症反应的作用。此外，EETs诱导多形核白细胞聚集，这也降低了白细胞与内皮细胞的粘附。 EETs具有抗炎活性。在大鼠和小鼠模型中，EETs减轻LPS和白介素lB(IL-113)诱导的发热，表明EETs或者其代谢物在温度稳态中有重要作用，外源性的EETs也有此作用。EETs的解热效应可能是由于8，9-EET和14，15EET降低PGE2的生成，已经有实验证实对LPS诱导的小鼠炎症模型使用

15、sEH抑制剂处理后血浆中的PGE：量降低1l，12-EET：扣0制IKB激酶(IKK)，抑制IKK介导的IKBot磷酸化，阻止IKB的降解，这使得NFKB保持在非活性状态并抑制NFKB介导的基因转录，而NFKB介导的基因转录在炎症发生和发展的过程中起重要作用。1.4 抗炎活性成分炎症是具有血管系统的活体组织对各种损伤因子的刺激所发生的防御反应，在人体许多重大疾病的发生发展过程中起着极其重要的作用。临床上应用的抗炎药物主要有非甾体类抗炎药、甾体类抗炎药和中草药。由于现有的化学合成抗炎药物具有明显的不良反应，近年来人们越来越重视从天然产物中寻找、开发抗炎药物。 炎症是机体对各种炎性刺激引起组织损害

16、而产生的一种基本病理过程，也是机体对损伤或感染 产生的一种重要的保护性反应。水飞蓟素（）是由菊科植物水飞蓟 果实中分离的黄酮类化合物，主要含水飞蓟宾（）、异水飞蓟宾（）、水匕蓟宁（）、水飞蓟亭（）、 水飞蓟醇等。其中水飞蓟宾含量最多，活性最强，具有保肝利胆、抗脂质过氧化、清除自由基、抗辐射、抗肿瘤、降血脂和抗胃溃疡等药理学效应。目前水飞蓟素已经成为世界各国的保肝植物药，以其为主药的制齐泛用于治疗急、慢性肝炎和肝硬化等。此外水飞蓟素还具有抗炎和免疫调剂作用，能抑制-、和-产生。和报道水飞蓟素能抑制花生四烯酸代谢中和途径，并且主要通过抑制-表达来发挥其抗炎活性。 姜黄素类化合物（）是中药姜黄（ ）

17、的主要有效成分，主要包括姜黄素（）、去甲氧基姜黄素（）和去二甲氧基姜黄素 （）三种。这三种酚类色素相近的结构（苯环间二酮结构与烯酮的互变异构、苯环上的酚羟基）使它们具有相似的药理作用，如抗炎、保肝、抗氧化、抗肿瘤和降血脂等作用。一般认为苯丙酰基是其抗炎特征基团，苯环上酚羟基、侧链双键可增强其抗炎活性，姜黄素分子结构中-酮基团亦可能是其抗炎活性所必需的。姜黄素作为一种强力抗炎抗氧化剂，主要通过抑制前列腺素合成、抑制溶酶体酶和琥珀酸脱氢酶活性、抑制血小板凝聚而产生作用。1.5 KLA 诱导Raw264.7细胞炎症模型 RAW264.7细胞随机分为空白组、炎症组、双氯芬酸钠组、尼美舒利组、美洛昔康组

18、,每组5皿细胞。采用100 ngm L-1KLA诱发RAW264.7细胞产生炎症,50gm L-1双氯芬酸钠、45gm L-1尼美舒利、30gm L-1美洛昔康分别干预建立给药组模型,TNF-生成量变化验证模型,1H-NMR法采集各组细胞膜磷脂的氢谱,主成分分析法(PCA)分析细胞膜磷脂变化。结果细胞模型建立成功,1H-NMR图谱与PCA结合分析比较细胞膜磷脂,空白组、双氯芬酸钠组、尼美舒利组、美洛昔康组分别与炎症组距离较远,得分图分型较好,各组细胞膜磷脂差异均有统计学意义。RAW264.7细胞膜磷脂在炎症前后发生了显著的变化,炎症的发生与磷脂的变化具有相关性。1.6课题研究内容与意义 花生四烯酸的三条代谢通路均与炎症的发生、发展关系密切，以促炎或者抑炎的方式参与炎症过程的调节。更重要的是，3条通路之间相互影响、相互干扰。那么，同时抑制两条通路或者3条通路是否有更好的抗炎效应?这也为炎症疾病的治疗带来新的希望。