细胞苗工艺规程及SOP.docx

1、细胞苗工艺规程及SOP细胞苗工艺规程及SOP一、工艺规程1 概念 是兽药生产和质量控制中最重要的文件，是规定生产所需原料和包装材料等的数量、质量以及工艺、加工说明、注意事项、生产控制的一个盒一套文件，是企业组织和指导生产的重要依据，也是技术管理工作的基础。工艺规程的目的是为生产各部门提供了一个共同遵守的技术准则，以保证每一兽药产品在整个有效期内都保持预定设计的质量。2 工艺规程主要内容2.1 封面与首页 封面上应明确本工艺规程是某一产品或某一剂型的生产工艺规程明确编制人、审核人、批准人签字及日期，明确批准执行日期。2.2 工艺流程图2.3 质量控制要点2.4 正文 正文工艺规程的核心部分，应根

2、据本企业的产品和兽药GMP的要求来分别制定原料和制剂的工艺规程。2.5 成品质量标准3 工艺规程编制中应注意的事项3.1 内容全面。如从兽药批准文件到生产控制的方法、各种质量标准直至该品种工艺规程变更登记等。3.2 有较多内容相同或重复时，可采取将相同内容汇编等形式，集中为一个或几个文件，工艺规程中可只体现版本号和文件号等。3.3 以体现生产方法为原则，不必过细；但可形式多样，以适用、能作为其他文件的重要义据为原则。4 修改与更改工艺规程一经批准，不得任意改动，各级操作人员和管理人员都应严格执行。对不符合工艺规程的指令或无批准手续变更的指令，操作人员应拒绝执行。工艺规程一般35年修订一次当有重

3、大工艺改革、设备更新、原辅料变更等，需要组织工艺验证，证明对质量无影响时才能通过批准更改工艺规程。一般的工艺和设备改进项目，由有关部门提出书面报告，经实验在不影响产品质量情况下，通过规定的程序，批准修订稿，修订稿的编写、审核、批准程序与制定程序相同，并注明修改日期、实施日期、各级人员的签字。例 题 目猪瘟活疫苗（细胞苗）生产工艺规程编 码页 数共 页起 草 人审 核 人批 准 人制定日期审核日期批准日期颁发部门GMP认证办公室颁发数量生效日期分发单位质管部、质检部、生产部、生产车间一、目 的：规定制造猪瘟活疫苗的方法和程序。二、适用范围：适用于猪瘟活疫苗的生产的全过程三、依 据。猪瘟活疫苗制造

4、及检验规程四、责 任 者：生产部各岗位。五、正 文：I 工艺流程及质量控制要点 猪瘟活疫苗（细胞苗）控制要点工 序质量控制要点质量控制项目频 次种毒制备种 毒生产用种毒批每 批细胞制备消 化时 间每 批温 度每 批细胞传代细胞系统外源病毒检验每 批检 验半 成 品无菌检验每 收效力检验每 收安全检验（脾毒接种）每 批配苗分装保 护 剂无菌检验每 批半 成 品无菌检验每 批分装过程无菌检验分装过程前、中、后检验分装量间隔半小时标定分装量II 操作细则本品系用猪瘟兔化弱毒株接种于犊牛睾丸细胞收获感染病毒液，加适宜稳定剂，经冷冻干燥制成，用于预防猪瘟。1 制苗材料的制备1.1 条件准备1.1.1 根

5、据细胞制备所需物品及设备条件，进行全面准备。1.1.2 按使用时间，提前做好灭菌工作后将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。1.1.3 在工作开始前3040min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。1.2 操作规则1.2.1 细胞的制备1.2.1.1 制苗用细胞的来源。制苗用细胞为14日龄健康犊牛睾丸细胞。 犊牛睾丸应选用非猪瘟疫区，无口蹄疫、粘膜病等传染病地区。1.2.1.2 牛睾丸的采集和处理 将犊牛体表消毒，以无菌手术采取牛睾丸，放在含适宜抗生素的Hanks液或Earles液中浸泡3040min。再无菌除去被膜、副睾，把组织剪成12mm小块，用Hanks液或Earles液所

6、配的洗液反复冲洗，至上清液清亮为止。1.2.2 细胞的消化1.2.2.1 将组织块放入消化瓶中，牛睾丸组织块加58倍0.25胰酶溶液。1.2.2.2 塞紧瓶口，置37水浴消化30-min，不含予热时间。在消化过程中，每隔10min轻摇一次，消化完毕时除去胰酶溶液。1.2.2.3 细胞分散及培育倒去胰酶溶液后，脱酶用Hanks液或Earles液反复冲洗23次，再加入营养液，以玻璃珠振摇法或吹打法分散细胞，反复进行34次。 用810层纱布将细胞过滤，收取细胞悬液，分装培养瓶，装量为瓶容积的l10，塞紧瓶口，置3637进行旋转培养，转速为1012r/h，一般于第35天细胞长成单层。 细胞传代及检验

7、牛睾丸原代细胞长成单层以后，用EDTA-胰酶细胞分散液消化，以1：31：5制成次代细胞悬液，继续转瓶培养35日，形成良好单层。同时，将次代细胞悬液分装到检验用的小扁瓶和带盖玻片的林氏管中培养并作检验，应达到如下标准： 细胞培养用血清不含牛粘膜病病毒抗体。 细胞培养物应无特异性病变，无细菌、霉菌（见无菌（纯粹）检验标准操作规程）和支原体（见支原体检验标准操作规程）污染，不吸附豚鼠红细胞。 细胞培养物用猪瘟、猪细小病毒和牛粘膜病三价荧光抗体染色，应阴性结果。将细胞冻融液接种vero细胞，应不出现任何病变（见非禽源外源病毒检测标准操作规程）。1.3 清场和记录1.3.1 工作结束后，应全面清场，对工

8、作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。 1.3.2 全面填写生产工序记录。2 生产用毒种的制备2.1 条件准备 2.1.1 根据毒种制备所需物料及设备条件，进行全面准备。 2.1.2 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。 2.1.3 在工作开始前3040min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。 2.2 操作规则 2.2.1 毒种繁殖 2.2.1.1 脾毒的繁殖 2.2.1.1.1 家兔的选择 选用营养良好，体重1.53.0kg的健康家兔。购入家兔应隔离饲养观察30天以上。 家兔在接种前，至少应测温观察3天，每天上、下午测体温各一次，选用体温

9、正常、温差波动不大的健康家兔。 2.2.1.1.2 接种 将冻干毒种用灭菌生理盐水制成20-50倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1m1。 2.2.1.1.3 测温观察 家兔接种后，上、下午各测体温一次，24h后，每隔6h测体温一次。 2.2.1.1.4 热型判定 接种家兔的体温反应分为四类 A 定型热反应(+) 潜伏期2448h，体温上升呈明显曲线，超过常温1以上，至少有3个温次，并稽留1836h。 B 轻热反应(+) 潜伏期2472h，体温上升有一定曲线，超过常温05以上，至少有2个温次，并稽留1236h。 C 可疑反应() 潜伏期不到24h，或超过72h以上，体温曲线起伏不定，或稽留不到12h

10、，或稽留超过36h而不下降。 D 无反应(一) 体温正常者。 注：常温 家兔接种前3天所测体温的平均温度。 潜伏期 由接种时算起，到体温上升超过常温05以上的间隔时间。 稽留期 由体温上升超过0.5算起，到体温下降到常温或接近常温的间隔时间。2.2.1.1.5 毒种收获 选择定型热反应兔，从体温下降及其以后的24h内剖杀，以无菌操作采取脾脏冷冻或冻干保存，作为生产用毒种。2.2.1.1.6 本毒种对家兔无特征性病变，各脏器可以有轻度充血、出血，脾、淋可能有不同程度的肿胀。如发现有异样病变或任何时期死亡的兔，均不得使用。2.2.1.2 细胞毒的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.3%0.5%的病

11、毒悬液，接种生长良好的牛细胞，置3637继续培养。每隔45日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种。2.2.2 毒种鉴定2.2.2.1 对细胞的感染性 毒种接种牛睾丸或羊肾细胞均不致细胞病变。2.2.2.2 对家兔的感染性 毒种接种家兔仅产生特异性热反应，不致死家兔。2.2.2.3 病毒含量 脾毒对家兔的最小感染量为10-5/m1。2.2.2.4 安全性 脾毒用无菌生理盐水作10倍稀释，细胞毒用原液接种无猪瘟中和抗体的健康敏感猪4头，每头肌肉注射5ml，接种后每天上、下午各测体温、观察一次，观察21天。体温、精神、食欲应正常。2.2.2.5 纯净 毒种应无细菌、霉菌(见无菌（纯粹

12、）检验标准操作规程)、支原体(见支原体检验标准操作规程)及外源病毒（见外源病毒检验标准操作规程）污染。2.2.2.6 特异性 将毒种用抗猪瘟病毒特异性血清中和后，接种家兔2只，在96h内不引起热反应及发病死亡。2.2.2.7 基础种子代次 为478490代。2.2.3 毒种保存在-15以下保存，脾毒不超过25天，细胞毒不超过6个月。2.2.4 毒种继代，脾毒不超过5代，细胞毒不超过3代。2.3 清场和记录2.3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。2.3.2 全面填写生产工序记录。 3 半成品的制备3.1 条件准备3.1.1 根据毒液繁

13、殖所需物料及设备条件，进行全面准备。3.1.2 按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。3.1.3 在工作开始前3040min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。3.2 操作规则3.2.1 接种 取已形成良好单层的牛睾丸次代细胞培养瓶，弃去营养液，接种含35生产用细胞毒种或0203脾毒种的维持液，置3637继续培养。3.2.2 收获 接毒后5天作第1次收获换液，以后每隔4天收获换液1次。收获换液时，每个细胞培养瓶须备下列溶液：乳汉液，7.5%碳酸氢钠，双抗，健马血清。收毒的次数依细胞生长状况而定，一般收毒在六收左右。3.2.3 收获的半成品置-15以下保存，应不超过3个

14、月。3.2.4 半成品检验3.2.4.1 无菌检验 将每组抗原分别取样，接种于T.G、G.A及G.P小管培养基中，各2支，每支接种0.2ml，一组置37，另一组置25培养，观察35天，应无细菌和霉菌生长（见无菌（纯粹）检验标准操作规程）。3.2.4.2 毒价测定 各收次病毒培养液分别用家兔测定，每1ml病毒含量60000个家兔感染量，方可用于配苗。3.3 清场和记录3.3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。3.3.2 全面填写生产工序记录。4 配苗4.1 条件准备4.1.1 根据配苗所需物料及设备条件，进行全面准备。4.1.2 按使用

15、时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。4.1.3 在工作开始前3040min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。4.1.4 将检验合格的半成品于配苗前取出，融化待用。4.2 操作规则4.2.1 将检验合格的半成品和冻干稳定剂，以及抗生素放到100级工作台上。4.2.2 把半成品混合在同一容器内，按一定比例加入冻干稳定剂、适量抗生素，充分混匀。每头份细胞毒液应不少于0.015ml。4.3 清场和记录4.3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。4.3.2 全面填写生产工序记录。5 疫苗的分装 操作内容见分装岗位标准操作规

16、程。6 疫苗的冻干 操作内容见冻干岗位标准操作规程。7 轧盖、贴签 操作内容见轧盖、贴签岗位标准操作规程。8 包装 操作内容见包装岗位标准操作规程III 成品检验见猪瘟活疫苗成品质量内控标准。检验方法见猪瘟活疫苗成品检验操作规程 二标准操作规程（SOP）1 概念 是指经批准用于指示操作的通用性文件或管理办法，SOP（standard operating procedure）包括生产操作、辅助操作以及管理操作规程。2 SOP主要内容2.1操作法名称。2.2编号、颁发部门、生效日期。2.3 所属生产（或管理）部门、产品、岗位、适用范围。2.4操作方法（或工作方法）及程序。2.5采用原辅料（中间产品

17、、包装材料）的名称、规格。2.6采用工器具的名称、规格及用量。2.7操作人员。2.8附录2.9附页。例 题 目细胞制备岗位操作规程编 码页 数共 页起 草 人审 核 人批 准 人制定日期审核日期批准日期颁发部门GMP认证办公室颁发数量生效日期分发单位公司各部门一、目 的：确保活疫苗生产工作的质量。保证生产的顺利进行。二、适用范围：适用于活疫苗细胞制备工序。三、责 任 者：生产车间活疫苗细胞制备人员。四、正 文： 1 条件准备 1.1 根据计划，提前准备好细胞制备所需物品如万瓶、瓶皿、三角瓶、漏斗、玻璃珠、解剖用眼科剪子、镊子、吸管等，按要求分别进行高压及干热灭菌备用。 1.2 使用前按物品的物

18、流及消毒要求移入洁净工作间待用。1.3 在工作开始前3040min，按要求调整送风量，直至达到所需洁净级别。 1.4 在操作前对所准备的各种用品进行全面的检查核对。2 操作规则2.1 鸡胚成纤维细胞单层（CEF）的制备 选择910日龄发育良好的鸡胚，先用碘酒棉再用酒精棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌和玻璃器皿内，用汉克氏液洗涤胚体，用灭菌的剪刀剪成米粒大的小组织块，再用汉克氏液洗23次，然后加025胰酶溶液（每个鸡胚约加ml），在37.538.5水浴中消化2030分钟,吸出胰酶溶液,用汉克氏液洗23次,再加入适量的营养液(用含5%10%犊牛血清乳汉液,加适宜抗生素适

19、量)吹打,用46层纱布滤过,制成每1 ml含活细胞数约100150万的细胞悬液,分装于培养瓶中(每10000 ml圆瓶加入细胞 悬液1000 ml)进行培养(每小时转速以911为宜).形成单层后备用(地般在24小时内应用)。2.2 鸡胚皮肤细胞单层的制备方法（1） 选择1213日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘，无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃器皿内，用汉氏液洗涤胚体，再用灭菌的眼科镊子将皮肤轻轻地扒下，用剪刀在广口离心瓶中剪碎并用汉氏液洗2次，用0.25%的胰酶溶液（每个鸡胚约4ml）在37.538.5水浴中消化2025分钟，然后吸出胰酶溶液，加入适当的营养液吹

20、打，用4层纱布滤过，制成每1ml含活细胞数约100万的悬液，分装于培养瓶中（1000ml克氏瓶加入细胞悬液120ml），放入30温箱培养。形成单层后即可进行病毒接种（一般在培养后24h内应用）。方法（2） 选择1213日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘，无菌取出鸡胚，放灭菌的烧杯中，用汉克氏液洗涤胚体，再用灭菌的镊子将胚夹入另一个放磁棒的灭菌三角瓶中，加37的0.25%胰酶溶液(每个鸡胚810ml)，放在磁力搅拌器上以低速搅拌消化约2025分钟，取出加入适量含血清的汉克氏液中止消化。然后将胰酶及消化 下来的细胞（即鸡胚皮肤细胞）液倒出，底部液用一层纱布滤过。这

21、1000r/min离心10分钟，去上清液，加入适量培养液吹打分散细胞，用4层纱布滤过。根据细胞数加入所需的营养液，制成每1ml含活细胞数约100万的细胞悬液，分装于培养瓶中（1000ml克氏瓶加入细胞悬液120ml），培养同上，并用于接毒。2.3 地鼠或乳兔肾细胞单层的制备（用于牛、羊伪狂犬病疫苗）选1020日龄地鼠或乳兔，放血致死后，无菌采取肾脏，将其皮质部组织剪成mm小块，用汉克氏液洗23次后，按组织重量的5倍，加入0.25%胰酶-汉克氏液（pH7.47.6），置3637水浴消化3040分钟，除去胰酶溶液后，用细胞生长液制成每1ml含6080万细胞的悬液。细胞 置37培养，24日后形成单层

22、。3 清场和记录 3.1 工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等按规定分别进行处理。 2.2 全面填写生产工序记录。三 病毒的细胞培养细胞培养是培养病毒最常用的技术，可用原代细胞、二倍体细胞或传代细胞系，一般作静止或旋转培养。因病毒与细胞的种类而异，病毒感染细胞可产生自带病毒，可引起杀细胞变化，也可致非杀细胞变化。杀细胞变化的表现为细胞病变（CPE）涉及细胞膜或细胞骨架的损伤，病毒可使细胞坏死或凋亡。致非杀细胞变化的病毒通常为持续感染，被感染的细胞可产生干扰素，干扰素反过来干扰其它病毒对细胞的感染，干扰素的抗病毒作用并无病毒特异性（一） 病毒的细胞养特点体外培养动

23、物在100多年前已获成功，直到20世纪50年代采用了将组织细胞分散的技术，使组织培养变为细胞培养得以病毒研究，诊断及疫苗制备等方面。组织培养（tissueculture）和细胞培养（cell culture）在此领域基本是同义词前者包括后者。 1细胞培养中的每个细胞的生理特性基本一致，对病毒的易感性也一致，没有试验动物的个体差异，而且可用于试验的数量远远超过动物和鸡胚，并且可在无菌条件下进行标准化试验，可重复好2 感染细胞的病变可通过观察细胞产生的变化如细胞病变等来判定结果，也可结合疫学技术检测细胞内是否有所培养的病毒。3 细胞培养的重要途径之一是感染的动物组织内分离病毒以及病毒克隆，从样本分

24、离的病毒可能不是单一的毒株，需要克隆以求纯化。通过细胞培养挑选产生的空斑（蚀斑）可达到克隆的目的（二）细胞培养的类型 1原代细胞（primary cell）动物组织经胰蛋白酶等消化、分散、获得单个细胞，在生长于培养皿中大多数组织均可制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一，鸡胚成纤维细胞（CEF）4h左右即可贴壁，24h可长成致密单层，肾和睾丸生长较慢，原代细胞一般对病毒较易感染，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞2 二倍体细胞株（diploid cell strain）将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性

25、则基本无变化，例如培养猪瘟用的犊牛睾丸细胞、猪传染性胃肠炎用的乳猪肾细胞3 传代细胞系（establishell cell line）与上述两类细胞不同，这类细胞在传代过程中染色体发生异常变异，在体外可无限制分裂的异倍体癌变细胞 优点：传代及培养方便，可节约元材料，因此使用广泛缺点：1有的对分离的野毒不敏感 2实验室传代日久，可能污染支原体、霉形体、或隐性感染病毒。本厂传代细胞有CRFK F81 DK MARC104 MARC- 145 PK15 BHK21 CHO VERO HELA（三）细胞培养的方法 1 静止培养 将细胞悬液接入培养瓶或培养板中置于恒温箱内或温室中静止培养，细胞成长繁殖成

26、单层或克隆。静止培养是最常用的细胞培养方法，广泛用于病毒研究和生物制品制造。例如扁瓶 37 细胞培养板 一般需在含5%的二氧化碳条件下培养。 2旋转培养 将细胞液接入转瓶后放于恒温箱的转瓶机上，转数一般为10-12转/h 3悬浮培养是通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于细胞培养液内的方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细胞，如生产但克隆抗体的杂交瘤细胞。对于正常细胞（贴壁依赖性细胞）某些传代细胞不适用，这些细胞在悬浮下很快死亡。 4微载体培养微载体一细小的颗粒未细胞在载体，通过搅拌悬浮在培养液内使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬浮细胞培养的优点5中空纤维细

27、胞培养 该技术模拟动物体内环境，使细胞能在中空纤维上形成类似组织的多层细胞生长，细胞周围犹如密布微血管，可以不断获得营养物质，同时又可将细胞代谢产物、废物和分泌物送到培养液中被运走。系统由中空纤维生物反应器、培养及容器、供养其和蠕动泵组成（四）单细胞的制备 1 原代细胞的制备 原代细胞制备时首先选取适当组织或器官，如鸡胚体、犊牛睾丸、乳猪肾等，采用机械分散法如剪碎、挤压等使之成为小块（约为1mm3 ）然后用0.25%.5%胰酶(ph7.4.6)消化掉细胞间的组织蛋白,消化的时间长短与温度、组织的来源及大小等有关，一般37 消化1030min，消化需要过夜。消化好的组织块去掉胰酶经吹打成分散的细

28、胞，用于培养。 2 传代细胞的制备 单层细胞传代时多采用FDTA（乙二胺四乙酸二钠）-胰酶消化法，胰酶浓度为0.025%,其作用是消化细胞间的组织蛋白;EDTA 浓度为0.01%其作用是螯合维持细胞间结合的钙镁离子和细胞与细胞间的钙镁离子，使细胞易脱落和分散。单层细胞经EDTA-胰酶消化，洗涤23次，再加入少量消化液消化，待细胞刚刚圆缩时即可加入营养液轻轻吹打，使之分散为单细胞。某些半悬浮培养或悬浮培养的细胞如SP2/0瘤细胞，不需要消化，采用机械吹打即可形成单细胞。 3细胞冻存于复苏细胞株与细胞系均需要保存于液氮中（-196）。为防止细胞在冻存过程中因渗透压、PH值等变化以及机械损伤而影响活

29、力，须向培养液中加入亲水性强、毒性小、易通过细胞膜的DMSO（二甲基亚砜）作为保护剂，从而使冰点降低，在缓慢冻结下能使细胞水分在冻结前透过细胞外，以防止细胞内形成冰晶对细胞造成的伤害。DMSO终浓度为5%15%，常用10%。 为保持细胞最大活率，一般采用慢冻快融法。常用冷冻速度为每分钟下降1，当当温度达-25时，速度可增至5/min，到-100时则可迅速浸入液氮中。也可采用如下程序：取对数生长期细胞消化后离心，将细胞沉淀用冻存液（10%DMSO，20%犊牛血清，70%MEM）悬浮至200万500万/ml细胞数，分装于细胞冻存管后4放置1h，然后-20冰箱放置2h，再放入-70冰箱4h后放入液氮

30、保存。复苏时要求快速融化以防止损害细胞。通常将从液氮中取出的细胞管置水浴s融化，离心后除去冻存液，然后将细胞悬浮于培养液中培养。必要时待细胞完全贴壁后换液一次，以防止残留的DMSO对细胞有害。细胞在液氮中可贮存a。通常，每冻存a应再复苏次。（五）细胞培养要素1培养液 以往多用天然培养液，现多用合成培养液。合成培养液有多种，如Eagle氏液、RPMI-1640、MEM和199等，各有其特点和适用范围。Eagle液主要成分为13种必需氨基酸、8种维生素、糖和无机盐等成分RPMI-1640、199乳汉液还含有其它氨基酸。不同培养液适用于不同细胞，乳汉液多用于鸡胚成纤维细胞培养；Eagle液主要适用于各种二倍体细胞，是最常用的细胞培养液，RPMI-1640、MEM液主要用于传代细胞的培养。2血清 在细胞培养液中必须添加一定量的血清方能获得成功。血清中除了含有细胞生长的部分氨基酸外，还有促进细胞生长和贴壁的成分。血清中的。-球蛋白和白蛋白能促进细胞生长，刺激细胞的生长活力；白蛋白具有解除脂肪酸、胰酶及金属离子等的毒性作用;糖蛋白、-球蛋