分子生物学2 染色体与DNA.docx

1、分子生物学2 染色体与DNA第二章 染色体与DNA 1第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点一、计划学时: 2学时二、教学准备: 教案、多媒体课件、练习题三、教学目的1. 帮助学生建立唯物主义世界观2. 了解DNA复制的新发现、端粒的DNA复制过程有两个检验点、大肠杆菌染色体DNA的复制调控、ColE1质粒DNA的复制调控3.使学生理解岗崎片段与半不连续复制、复制的引发和终止、DNA聚合酶、真核细胞DNA的复制调控4. 使学生掌握DNA双螺旋的解旋、真核生物DNA的复制特点四、重点难点1.重点：（1）岗崎片段与半不连续复制（2）复制的引发和终止（3）DNA聚合酶（4）真核细胞DNA的复制调

2、控（5）DNA双螺旋的解旋（6）真核生物DNA的复制特点2.难点：（1）复制的引发和终止（2）DNA双螺旋的解旋（3）真核生物DNA的复制特点五、授课方式：讲授六、教学过程1.复习旧课：上次课我们学习绪论，分子生物学的基本含义、DNA的发现、分子生物学与其他学科的关系等是必须了解的内容。2.讲授新课第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点一、原核生物DNA的复制特点 1.原核生物DNA复制的主要方式（1）型：A.单向复制 B.双向复制大肠杆菌中常见。（观看FIASH课件）（2）滚环型 （观看FIASH课件） 是噬菌体中常见的DNA复制方式。许多病毒DNA的复制、质粒、F因子在接合(conuf

3、gation)转移时其DNA的复制，以及许多基因扩增时都采用这种方式。 在复制起始点打开一条DNA母链，产生一个3羟基端和5磷酸基团端。3端一另一条母链为模板进行前导链的合成子链。5磷酸基团端作为另一子链的模板按后随链的方式合成子链。（3）D环型D环复制：双螺旋的两条链并不同时进行复制，重链先开始复制，稍后轻链再开始复制，当复制沿轻链开始时，重链上产生了D环，随环形轻链复制的进行，D环增大，轻链随后亦开始复制，最后两条链完成复制形成两条新的DNA又螺旋。 线粒体DNA和高等植物的叶绿体DNA的复制方式。双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，最初仅以一条母链作为新链合成的模板

4、，迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的单链环。2.复制起始点的保守序列 大肠杆菌基因组以双链环状DNA分子的形式存在，复制起始点（oriC）含有3个13bp的串联重复序列（CATCTNTTNTTT）和4个9bp的保守序列（TTATNCANA）组成的能结合DnaA的起始结合位点。复制起始后，在oriC上形成的复制叉能单向或双向移动。3.DNA双螺旋的解旋DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉。复制叉的形成过程是一个有多种蛋白质及酶参与的复杂过程。首先在拓扑异构酶I的作用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起始点出解开双链。一旦双链局部解开，就必需有SSB蛋白来稳定解开的单链，以保证该

5、局部结构不会恢复成双链，接着由引发酶等组成的引发体迅速作用于两条单链DNA上。不论是前导链还是后随链，都需要一段RNA引物以起始子链DNA的合成。4.参与DNA复制的酶和蛋白因子（1）DNA解链酶 （DNA Helicase）又称螺旋酶DNA复制时，DNA双螺旋并不会自动打开。DNA解链酶能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。目前，大肠杆菌中发现有两种参与这个过程，一种称为螺旋酶或螺旋酶，与滞后链的模板DNA结合沿53方向运动；第二种称为Rep蛋白，和前导链的模板DNA结合沿35方向运动。Rep蛋白与解链酶或分别在DNA的两条母链上协同作用，以解开双链DNA。（2）单链DNA结合蛋白（si

6、ngle-strand binding protein,SSBP）解链酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNA不会长久存在，会很快重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。然而，在细胞内有大量单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein SSBP)能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。SSBP与解链酶不一样，它不具备解链的活性，不和ATP结合。在肠杆菌细胞中主要SSBP是177肽所组成的四聚体，可以和单链DNA上相邻的32个核苷酸结合。一个SSBP四聚体结合于单链DNA上可以促进其他SSBP四聚体与相邻的单

7、链DNA结合，这个过程称为协同结合(cooperative binding)，SSBP结合到单链DNA上后，使其呈伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链DNA作为模板。SSBP可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置时，该处的SSBP便会脱落，并被重复利用。（3）DNA拓扑异构酶（DNA Topoisomerase） 大多数天然状态下的DNA分子都具有适度的负超螺旋，可以形成部分的单链结构，利于蛋白质与DNA的结合。在复制过程中，随着DNA的解旋，双螺旋的盘绕数T减少，而超螺旋数W的增加，使正超螺旋增加，未解链部分的缠绕更加紧密，形成的压力使解链不能继续进行。拓扑异构酶能使正超螺旋向负超螺旋

8、转化，消除解链造成的正超螺旋正超螺旋的堆积，使复制得以延伸。DNA拓扑异构酶有两类，大肠杆菌的蛋白(MW-110000)就是一种典型的拓扑异构酶.它的作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛化，然后再将切断的单链DNA连接起来，而不需要任何辅助因子。而大肠杆菌中的DNA旋转酶(DNAgyrase)则的典型的拓扑异构酶，能将负超螺旋引入DNA分子，该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，同时需要ATP水解为ADP以供能。（4）引物酶 Primase引物酶催化引物RNA分子的合成。但它和传统的RNA聚合酶（RNA Polymerase）不一样。1引物酶既可以利用核糖

9、核苷酸，又可以利用脱氧核糖核苷酸，而RNA聚合酶只能利用核糖核苷酸；2引物酶只在复制起点处合成RNA引物而引发DNA的复制，而RNA聚合酶则是启动DNA转录合成RNA，从而将遗传信息由DNA传递到RNA。但在单链噬菌体M13 DNA和质粒Co1E1 DNA复制时，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。噬菌体T7的Gene4蛋白，T4的Gene41和61蛋白等也具有引物酶的活性和具有大肠杆菌引物酶相似的功能。（5）DNA聚合酶（ DNA Polymerase）A.概念：是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶。B. 特点：a. 以dNTP为前体催化合成DNA；b. 需要模板和引物；c. 催

10、化dNTP加到DNA链的3-OH端；d. 催化合成方向53 。C. 分类： 大肠杆菌中存在DNA聚合酶、和。DNA聚合酶 I不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，它有35核酸外切酶活性，这种活性与聚合酶活性紧密结合在一起，既可合成DNA链，又能降解DNA，保证了DNA复制的准确性。另外，它还有53核酸外切酶功能，可作用于双链DNA，又可水解5末端或距5末端几个核苷酸处的磷酸二脂键，该酶被认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起着重要的作用。它也可以除去冈崎片段5端RNA引物，并按碱基互补配对原则补齐缺口，保证连接酶将片段连接起来，使冈崎片段间缺口消失。DNA聚合酶II具有53方向聚合酶活性，

11、但酶活性很低。其35核酸外切酶活性可起校正作用。目前认为DNA聚合酶II的生理功能主要起修复DNA的作用。其聚合酶活性只有DNA聚合酶 I的5%。DNA聚合酶III（DNA复制的主导酶）其生物活性形式为二聚体。它有53核酸外切酶活性，又有35核酸外切酶。它的聚合酶活性较强，为DNA聚合酶 I的15倍，为DNA聚合酶II的300倍，是大肠杆菌DNA 复制中链延长的主导聚合酶，包括前导链和后随链中的冈崎片段的复制。DNA聚合酶和分别由dinB和umuD2C基因编码，主要在SOS修复过程中发挥作用。（6.）DNA连接酶(DNALigese)功能是将双链DNA上的切口连接起来；主要用于冈崎片段的连接，

12、DNA修复、重组，两个复制单元间片段的连接。连接双链DNA的要求：切口、3-OH、5-磷酸基团、需要能量5.冈崎片段（Okazaki fragments ）与半不连续复制由于DNA的两条链为反向平行，以复制叉移动的方向为基准，一条链为35，其新合成的DNA链沿53连续进行前导链。由DNA聚合酶III催化合成。另一条链为53，新生的DNA链先合成短的冈崎片段，不连续合成滞后链，再由DNA连接酶连接成完整的DNA链。由DNA聚合酶I催化合成。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制称为半不连续复制。（观看FIASH课件）6.复制的引发（1）引发 所有的DNA聚合酶都只能从3羟基端起始DNA合成。D

13、NA复制时往往先由引物酶（RNA聚合酶）在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物的3端开始合成新的DNA链。 对于前导链来说，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点一直合成下去。后随链的引发由引发体（primosome）来完成。引发体由6种蛋白质n、n、n、DnaB、C和 I共同组成。只有当引发前体（priprimosome）把这6种蛋白质合在一起，并与引发酶（primase）进一步组装成引发体，才能发挥其功效。引发酶是dnaG基因的产物，是在特定环境下发挥作用的RNA聚合酶，仅用于合成DNA复制所需的一小段RNA。引发体在滞后链分叉的方向上移动，并在模板上断断

14、续续地引发生成滞后链的RNA引物，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直到遇到下一个引物或冈崎片段为止。由RNase H降解RNA引物并由DNA聚合酶I将缺口补齐，再由DNA连接酶将两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA。(2)由大肠杆菌oriC复制起始点处引发的DNA复制过程（a）在ATP作用下，大约有20个DnaA蛋白与oriC处的4个9bp保守序列相结合，形成寡聚复合物；（b）在HU蛋白和ATP 的共同作用下，DnaA复制起始复合物使3X13bp碱基串联重复序列变性，形成开链；（c）DnaC的协助下，六聚化的解链酶DnaB替换了DnaA，与DNA链相结合，进一步解开双链。在一些重要的酶和

15、蛋白质的相互作用下，DNA开始复制。7.复制叉前进的过程 （观看FIASH课件）8.复制的终止. （图2-23）当复制叉前移，遇到20bp重复性终止序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后停止复制，其间仍有50-100bp未被复制，由DNA修复机制填补空缺，其后两条链解开。在拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。9.DNA复制的机制（观看FIASH课件）二.真核生物DNA的复制特点1.真核生物DNA的复制由于真核生物DNA分子很大，每条染色体上有多个复制起点，有多个复制叉。每个复制叉都进行双向复制。只有在细胞周期的S期进行复制，当一

16、个DNA分子DNA全部复制完毕后，进入下一个细胞周期的S期才进行第二轮复制。参与DNA复制的酶和蛋白因子主要有DNA解链酶 （Helicase）、单链DNA结合蛋白（SSBP）、拓扑异构酶（Topoisomerase）、DNA聚合酶（DNA Polymerase）、DNA连接酶（Ligese）、复制因子c（Replication factor c）。已经发现的真核生物DNA聚合酶有15种以上。在哺乳动物细胞中主要有5种，即聚合酶、。聚合酶、分布在细胞核内。DNA聚合酶的主要功能是引物合成，即能起始前导链和后随链的合成。DNA聚合酶活性水平稳定，可能主要在DNA损伤的修复中起作用，属于高修复性酶

17、。DNA聚合酶是DNA复制的主导酶，参与前导链和后随链的合成。DNA聚合酶与后随链的合成有关，在DNA合成过程中核苷酸切除以及碱基的切除修复中起重要的作用。DNA聚合酶在线粒体DNA的复制中发挥作用。2.与原核生物相似（1）半保留、半不连续复制（2）复制过程：引发延伸终止三个阶段（3）需要酶和蛋白因子（4）聚合酶的基本性质3.与原核生物不同（1）原核生物是单复制子，既可单向复制，又可双向复制；真核生物是多复制子（每条染色体上有多个复制起点），只有双向复制。（2）DNA全部复制完毕才进行第二轮复制；原核生物在整个细胞生长过程，第一轮复制未完成就进行第二轮复制。（3）真核生物有5种DNA聚合酶，即

18、聚合酶、；原核生物有3种DNA聚合酶，即聚合酶I、II、III。（4）真核生物聚合酶控制前导链，聚合酶控制后随链；原核生物前导链与后随链的合成由聚合酶III同时控制。4. 与原核生物不同 （1） 原核生物是单复制子，真核生物是多复制子（每条染色体上有多个复制起点）； （2） 真核生物DNA全部复制完毕才进行第二轮复制，原核生物在第一轮复制未完成就进行第二轮复制。 （3）真核生物有15种以上DNA聚合酶，主要有聚合酶、；原核生物有5种DNA聚合酶，即聚合酶I、II、III、。（4）真核生物聚合酶是复制的主导酶，参与前导链和后随链的合成，聚合酶负责后随链中引物片段核苷酸的切除并补缺；原核生物链聚合

19、酶III是复制的主导酶，参与前导链和后随链的合成，聚合酶I负责后随链中引物片段核苷酸的切除并补缺。 （5）真核生物DNA聚合酶不具核酸外切酶活性，复制过程中的校对作用由别的酶担任；原核生物DNA聚合酶具有核酸外切酶活性，在复制过程中边合成边校对。三、DNA的复制调控1.大肠杆菌染色体DNA的复制调控2.ColE1质粒DNA的复制调控3.真核细胞DNA的复制调控（3个水平）真核细胞的生活周期可以分为4个时期：G1、S、G2和M期。G1是复制预备期，S期是复制期，G2是有丝分裂准备期，M期为有丝分裂期。DNA复制只发生在S期。（1）细胞生活周期水平调控也称为限制点调控，即决定细胞停留在G1期还是进

20、入S期。许多外部因素和细胞因子参与限制点调控。促细胞分裂剂、致癌剂等都可以诱发细胞由G1期进入S期。一些细胞质因子如四磷酸二腺苷和聚ADP-核糖也可诱导DNA复制。（2）染色体水平调控决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在S期起始复制。这种有序复制的机理还不清楚。（3）复制子水平调控决定复制的起始与否。这种调控从单细胞到多细胞生物是高度保守的。四、DNA复制的新发现激活Clb-Cdc28蛋白激酶可以起始DNA复制（S），并且通过作用于三个目标分子（ORC，Cdc6和Mcm2-7）从而防止第二轮复制的发生。有丝分裂期（M）之后激酶的失活可以带来新一轮的复制。当细胞分裂时，自然要求

21、对此严格控制。一个正在分裂的细胞必须对DNA复制进行严格控制，从而确保每个子代细胞获得确切一个拷贝的DNA。事实上，这种控制和遗传稳定性的失败会导致细胞死亡或者甚至导致癌症的发生。尽管十年前细胞生物学家就鉴定了保证DNA复制只发生一次的蛋白质，但是他们不知道这种蛋白质是如何发挥功能的。现在这个谜的部分谜底已经揭开。 在2001年6月28日出版的Nature上，一个由加州大学旧金山分校的Joachim Li领导的研究组报告说，在一个主控协调因子名为Clb-Cdc28的蛋白激酶的控制下三个独立的途径，必须协同工作以防止第二轮DNA合成在细胞分裂之前发生。目前的发现是过去5年工作的结果，表明Clb-

22、Cdc28在控制DNA复制方面发挥双重功能。当细胞分裂开始时，一组名为前复制复合物（pre-RC）的蛋白质聚集到DNA合成开始的众多复制起始位点的每一个上。一旦组装完成，pre-RCs做好准备起始DNA复制，但是在细胞突然激活Clb-Cdc28激酶之前不会开始复制工作。这时候这种酶表现出其多能性。 组装的pre-RCs首先激发复制的发生，但是一旦它们离开了复制起始位点，就抑制了新的pre-RCs的组装，后者可以重新起始DNA的合成。结果，Clb-Cdc28只激起一轮复制。然后一旦细胞分裂，Clb-Cdc28失活，新的pre-RCs可以组装起来进入下一轮的细胞分裂。尽管Clb-Cdc28如何防止

23、重新起始复制的细节目前还不清楚，但是研究者们在过去的几年里发现了几个防止组装的可能的目标分子。作为一个激酶，Clb-Cdc28具有将磷酸基团加到其它蛋白质上的功能。被磷酸化的蛋白质中包括三个pre-RC成员。两个称为起始蛋白质：被Clb-Cdc28磷酸化后成为降解目标的Cdc6，和当发生修饰后被从核内去除的蛋白复合物Mcm2-7。起始点识别复合物（ORC）是一组同样是pre-RC成员的蛋白质，含有那些看起来象Clb-Cdc28磷酸化位点的序列，但是科研人员还未证明这一点。他们在证实这三个目标分子帮助防止重新起始的发生方面遇到了困难，因为分别让它们对Clb-Cdc28的磷酸化作用不做反应不能去除

24、这种妨碍效果。这令他们推测所有这些蛋白质，而且可能还有其它蛋白质，一起工作防止重新起始复制。 现在Li的研究组已经提供了实验证据证实这种合作关系，他们使酵母细胞的三个可能靶分子同时不受Clb-Cdc28的控制。研究者通过清除ORC上可能的磷酸化位点，并且增加了一个序列到防止Mcm复合物离开核的蛋白成员之一的基因上，实现了这一目的。他们还将抗降解的Cdc6的基因置于一个可诱导的启动子的控制下。从而使得细胞表达Cdc6，甚至是在Clb-Cdc28高活性和Cdc6被正常降解的情况下也是如此。改变的酵母细胞不再能阻断DNA的复制。但是酵母细胞不能一次一次地复制DNA：原因现在还不清楚，这些细胞只能产生

25、相当于一个基因组大小的额外的DNA。 这一结果的一个重要意义在于对复制激活的控制与阻断pre-RC的组装是分离的。当Li开始这项工作时，他认为与Clb-Cdc28本身相似，在复制起始以及抑制pre-RCs的形成时应该需要这些靶分子。他说，如果这是事实的话，细胞根本就没有复制。Li补充说，结果发现事实并非如此，表明在那些蛋白质或其它激起复制起始的蛋白质上还有其它磷酸化位点。 麻省理工的分子生物学家Stephen Bell说，实验结果表明存在着对防止重复复制的多重水平上的控制。他说这个发现强调了功能是如何的重要。Bell同时也对抑制pre-RC的组装和激活复制起始被分别控制感到很有兴趣。“最简单的

26、模型是它们是协调耦联的，但是细胞又一次证实我们的猜想是错误的。五、端粒的DNA复制端粒的DNA复制过程有两个检验点。因为DNA损伤和复制叉（replication fork）可以激活修复通路，所以基因组非常稳定。但是，端粒一直被认为是防止此类事件发生，以此保护染色体末端免受“伤害”的。然而，最新的一项研究证据表明，在细胞周期的两个重要检验点上，端粒事实上是需要这个DNA损伤机器（DNA damage machinery）的。几项报告揭示端粒复制是需要DNA损伤机器的，Verdun和Karlseder对人类细胞系中该复制过程及相关蛋白进行深入研究。他们使用端粒蛋白的染色质免疫共沉淀，并结合Brd

27、U分析的方法，表明复制发生在细胞周期的两独立检验点上。深入的染色质免疫共沉淀分析表明，在这些检验点上，端粒发出了不同DNA损伤信号：第一个检验点上，端粒处的复制叉发出DNA损伤(DNA Lesion)信号，被ATR (ataxia telangiectasia and Rad3 related)依赖性的损伤机器识别；第二检控点上，端粒复制的钝端(blunt end)发出双链断裂信号，由ATM (ataxia telangiectasia mutated)依赖的信号通路激活同源重组机器。文章作者使用体外分析的数据表明，同源修复机器(homologous repair machinery)对于保护

28、环（成熟功能性端粒的重要特征）的形成是必需的。他们从而提出了一个端粒加工的两步骤模型，在这个模型中端粒加工也可被识别为损伤，DNA损伤机器（DNA damage machinery）在这个过程中有着重要地位。生物在进化过程中获得的DNA修复功能，对生物的生存和维持遗传的稳定性是至关重要的。对有些DNA的损伤，细胞能将其完全修复到原样，如可将嘧啶二聚体切开、DNA单链断裂可重新连接、碱基缺失可再配对插入、加成的烷基可以移除、一条链上的碱基或核苷酸的错误可以切除并依赖互补链作模板而复制重新修复等。对DNA较严重的损伤，细胞可采取重组修复、SOS修复等方式进行反应，以期提高细胞的存活率，但不能完全消

29、除DNA的损伤，会带给细胞较高的突变率。DNA损伤检验点：生物有机体基因组DNA经常会受到内源或外源因素的影响而导致结构发生变化，产生损伤；在长期进化过程中，有机体也相应形成了一系列应对与修复损伤DNA，并维持染色体基因组正常结构功能的机制.其中DNA损伤检验点(DNA damage checkpoint)就是在感应DNA损伤的基础上，对损伤感应信号进行转导，或引起细胞周期的暂停，从而使细胞有足够的时间对损伤DNA进行修复，或最终导致细胞发生凋亡.DNA损伤检验点信号转导途径是一个高度保守的信号感应过程，整个途径大致可以分为损伤感应、信号传递及信号效应3个组成部分.其中3-磷脂酰肌醇激酶家族类

30、成员ATM(ataxia-telangiectasia mutated)和ATR(ataxia-telangiectasia and Rad3-related)活性的增加构成整个途径活化的第一步.它们通过激活下游的效应激酶，Chk2/Chk1，通过协同作用许多其他调控细胞周期、DNA复制、DNA损伤修复及细胞凋亡等过程的蛋白质因子来实现细胞对DNA损伤的高度协调反应.近十几年，随着此领域研究的不断深入，人们逐步揭示了DNA损伤检验点途径发生过程中，各种核心组分通过与不同调节因子、效应因子及DNA损伤修复蛋白间的复杂相互作用，以实现监测感应异常DNA结构并实施相应反应的机制;其中，检验点衔接因子

31、(mediators)以及染色质结构，尤其是核小体组蛋白的共价修饰在调控ATM/ATR活性，促进ATM/ATR与底物间的相互作用以及介导DNA损伤位点周围染色质区域上多蛋白复合物在时间与空间上的动态形成发挥着重要的作用.同时，人们也开始发现DNA损伤检验点途径与DNA损伤修复、基因组稳定性以及肿瘤发生等过程之间某些内在的联系.该反应途径在通过协调细胞针对DNA损伤做出各种反应的基础上，直接或间接地参与或调控DNA损伤修复过程，并与DNA损伤修复途径协同作用最终保证染色体基因组结构的完整性，而检验点途径的改变，则会引起基因组不稳定的发生，包括从突变频率的提高到大范围的染色体重排，以及染色体数量的畸变.如:突变发生在肿瘤形成早期，会大大增加肿瘤发生的几率。第二章 染色体与DNA 2第五节 DNA修复第六节 DNA的转座一、计划学时: 2学时二、教学准备: 教案、多媒体课件、练习题三、教学目的1.帮助学生建立唯物主义世界观2.了解转座作用的遗传学效应、分子针线DNA连接酶、DNA修复中重要的通用酶、抗癌基因的双刃剑3.使学生理解转座子的分类与结构特征、转座作用的机制、真核生物中的转座子4.使学生掌握错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、DNA的直接修复、重组修复四、重点难点1.重点：（1）错配修复（2）碱基切除修复