植物细胞培养技术.ppt

1、植物下细胞培养技术,植物细胞培养技术的概念,植物细胞培养：是指从植物体中获得 植物细胞，然后在一定的条件下培养，以获得所需的细胞或各种产物的技术过程。,植物细胞培养技术的理论基础,植物细胞的全能性：植物的每个细胞都包 含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。细胞分化：细胞在生长发育的过程中，在形态、结构、生理功能等方面发生某些特异性差异的过程。脱分化：在某些特定条件下，分化细胞的基因活动模式会发生可逆的变化，重新回到未分化状态，这个过程成为脱分化。,植物单细胞的获取,一、从外植体直接分离细胞（一）、机械捣碎法 先将叶片等外植体轻轻捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞。,优点：1

2、、获得的植物细胞没有经过酶 的作用，不会受伤害。2、不需要经过质壁分离，有利于进行生理生化研究。缺点：由于受到机械作用，细胞结构会受到一定的伤害，获得完整的细胞团或细胞数量少。,（二）、酶解法 利用果胶酶、纤维素酶等处理，分离出具有代谢活性的细胞。该法不仅能降解中胶层，还能软化细胞壁。所以，用该法分离细胞时，对细胞给予渗透压保护，如添加适量甘露醇。,二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞,（一）、概念 愈伤组织：植物各种器官的外植体在离体的条件下，细胞经过脱分化等一系列过程，重新转化为未分化细胞，继而形成一种能快速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团，称为愈伤组织。,（二）、影响愈伤组织诱导的因素,1

3、、要有合适的外植体。一般来说，外植体细胞分化程度越高，脱分化越困难，所需时间越长2、要有适宜的培养基和培养条件。植物激素的种类和浓度最为重要。3、光照和温度也影响愈伤组织的发生。4、NH4+/NO3-的浓度比对愈伤组织的诱导也有影响。浓度比为4:1时，诱导率最高。,（三）、从愈伤组织分离得到植物细胞,诱导获得的愈伤组织可以用小刀或镊子分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到液体培养基中，加入杀菌的玻璃珠，振荡培养，使愈伤组织分散成小细胞团或单细胞，然后过滤，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。,三、通过原生质体获取植物细胞 原生质体：出去细胞壁后得到的微球体。,（一）、原生质体的分离 1

4、、机械法：使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁使原生质释放出来。特点：排除了外加酶对原生质体结构和代谢的不利影响，但产生的原生质体少，对于细胞质浓密、液泡小的分生组织不适用。,2、酶解法：将果胶酶和纤维素酶混合处理材料。特点：能在较短时间内获得大量原生质体，并能从分生组织获得原生质体，但是，酶可能对原生质体有毒害作用。3、影响因素：材料的种类与生理状况、酶的种类与浓度、酶解时间、渗透压稳定剂和质膜稳定剂等。,（二）、原生质体的纯化,供体体材料经酶处理后，除有完整的原生质体外还有未被消化的细胞、破碎的原生质体，叶绿体、线粒体等，可以用镍丝网除去较大碎屑，进一步纯化方法有下三种：1、沉降法：离心，使

5、原生质体下沉，碎片留于上清液。2、漂浮法：根据密度不同，利用密度大的高渗溶液，离心后使原生质体漂浮其上，碎片等沉底。3、界面法：采用两种不同密度的溶液，离心后使完整的原生质体处于两液相的界面。,（三）、原生质体再生形成植物细胞,原生质体分离后，经过技术和适当稀释，在一定条件下进行原生质体培养，使细胞壁再生，从而得到植物单细胞，单细胞培养，长成细胞团，再经过继代培养，形成由原生质体形成的细胞系。采用固体培养或者液体静止培养，形成植物细胞。,植物单细胞的培养方法,（一）、看护培养法 1、概念；采用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单细胞，使单细胞持续分裂和增殖，而获得单细胞形成的细胞系的方法。,2、基

6、本过程：,（1）、配制好宜于愈伤组织继代培养的固体培养基。（2）、将生长活跃的愈伤组织块植入固体培养基中间部位。（3）、愈伤组织上方放置一片面积为1平方厘米的滤纸，滤纸下方紧贴培养基和愈伤组织块。（4）、取一小滴经过稀释的单细胞悬浮液接种于滤纸上方。（5）、置于培养箱，在一定的温度和光照条件下培养若干天，单细胞在滤纸上进行持续分裂和增殖，形成细胞团（6）、将细胞团转移到新鲜的固体培养基中进行继代培养，获得由单细胞形成的细胞系。,（二）、微室培养法,1、概念；将接种有单细胞的少量培养基，置于微室中培养，使单细胞生长繁殖的方法。2、特点：使用培养基用量少，可通过显微镜观察个体细胞的生长、分裂、分化

7、、发育情况。利于对单细胞全过程进行跟踪。,（三）、单细胞培养法,1、概念：将单细胞接种于固体培养基，在培养皿中进行培养，使细胞生长繁殖，获得由单细胞形成的细胞系的培养方法。,2、基本过程,（1）、单细胞悬浮液的密度调整（2）、固体培养基的配制（3）、接种单细胞（4）、培养（5）、继代培养,（四）、条件培养法,将单细胞接种于条件培养基中进行培养，使细胞生长繁殖，而获得有单细胞形成的细胞系的培养方法。,植物单细胞培养的条件,（一）、培养基。不同种类植物单细胞对营养成分的要求各不相同，要根据不同的要求配置培养培养基。（二）、细胞密度。单细胞培养要求接种的细胞有一定的密度。过低，不利于细胞生长繁殖，过

8、高，则难得到单细胞系。（三）、植物生长激素。主要是生长素和分裂素。,（四）、温度。一般控制在25度左右，许可范围内适当提高温度可加快单细胞生长速度。（五）、PH。一般控制在5.26.0（六）、CO2含量。植物细胞培养系统中CO2含量对细胞生长繁殖有一定影响。,细胞悬浮培养,（一）含义及特点,2、特点 1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。,1、含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养,3、悬浮培养类型和方法,成批培养,连续培养,（1）、成批培养/分批培养,含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭

9、容器中进行培养。它是进行细胞生 长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。,A、成批培养特点,（1）培养基体积固定；（2）必须适当搅拌；（3）培养过程中，细胞生长，其数目不 断发生变化，呈S增长；（4）但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。,B、成批培养的方法,(1)旋转培养(2)往返震荡培养(3)旋转震荡培养(4)搅动培养,（2）、连续培养,含义：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。,A、连续培养的特点：,（1）新鲜培养基的不断加入,保证了养分的充分供应；（2）可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中；（3）适于

10、大规模工业化生产,(1)半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液(2)连续培养：封闭式和开放式,B、连续培养的种类：,Production of anthocyanin,（二）、细胞悬浮培养主要应用,1、植物有用物质的生产2、诱发和筛选突变体3、原生质体培养和细胞分离4、食品生产。,植物细胞培养技术的应用,（一）、在细胞转化方面的应用 1、药物的合成。手性药物、天然药物的合成以及现有药物的修饰改造。2、食品添加剂的合成。辣椒素、香兰素等的合成。（二）、在农业上的应用 1、植物种质的保存。2、人工种子的制备。3、植物的快速繁殖。,植物细胞培养技术的意义,与从植物中提取分离产物相比，植物组织培养生产天然产物具有以下显著优点：产率高、周期短、产品质量高、易于管理，减轻劳动强度。因此对于农业产品的工业化生产具有深远意义。,