虾青素对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的爱惜作用.docx

1、虾青素对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的爱惜作用虾青素对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的爱惜作用【摘要】 目的 研究虾青素对脂多糖（LPS）所致急性肺损伤（ALI）小鼠的爱惜作用。方式 雄性昆明种小鼠60只，随机分为正常对照组、急性肺损伤模型组、地塞米松阳性对照组(5 mg/kg)和虾青素低、中、高剂量组(10、1五、20 mg/kg)共6组。不同剂量虾青素给大鼠持续灌胃30 d后，腹腔注射脂多糖 mg/kg成立ALI模型。在注射后6 h，搜集腹主动脉血并进行左侧支气管肺泡原位灌洗以搜集灌洗液，测定血中淋巴细胞亚群（CD+3、CD+4、CD+8）、肿瘤坏死因子(TNF )、白细胞介素8(IL 8)及丙二醛

2、（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）活性；测定各组的肺湿重/干重比、肺组织中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)含量及肺组织匀浆TNF 、白细胞介素10(IL 10)含量。结果 虾青素各剂量组均能降低因LPS诱发的血TNF 、IL 八、MPO、MDA含量与肺组织湿重/干重比的升高，同时抑制肺组织IL 10含量、血SOD与GSH Px活性的降低，改善血中淋巴细胞亚群散布。结论 虾青素对LPS所致ALI具有预防性爱惜作用。 【关键词】 虾青素；急性肺损伤；脂多糖 【Abstract】 Objective To study the protective effect o

3、f astaxanthin on acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide （LPS） in mice and research its possible mechanisms. Methods 60 male Kunming mice were randomly divided into control, ALI, dexamethasone (DXM, 5 mg/kg) and low, middle, high different dose astaxanthin (10, 15, 20 mg/kg) groups. Af

4、ter lavaged for 30 days, control group were given physiological saline, and ALI, astaxanthin, DXM groups were injected with LPS mg/kg) to induce ALI models. After injected six hours, the contents of serum lymphocyte subpopulations(CD3+, CD4+, CD8+), tumour necrosis factor (TNF) , interleukin (IL) 8,

5、 malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and the activity of glutathione peroxidase (GSH Px) were measured, lung wet weight/dry weight ratio, the activities of lung neutrophil myeloperoxidase (MPO), TNF , IL 10 were Different dosage astaxanthin could significantly decrease serum contents o

6、f TNF , IL 8, MPO, MDA and lung wet weight/dry weight ratio, while inhibit the reducation of IL 10 in lung and the serum activities of SOD, GSH Px, and improve the percent of lymphocyte subpopulations. Conclusions Astaxanthin has protective effects on ADL induced by LPS in mice. 【Key words】 Astaxant

7、hin; Acute lung injury; Lipopolysaccharide 急性肺损伤(ALI)是全身炎症致使多器官功能障碍综合征的肺部表现，其严峻时期即为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。研究说明，在ALI/ARDS的发生进展中，免疫细胞功能紊乱和免疫炎性因子失衡在致病进程中作用显著1。虾青素是一种类胡萝卜素，要紧以全反式异构体形式存在于自然界海洋动物体、藻体及多数陆生植物体（如冰凉花）内并具有多种生物学功能，其中尤以抗氧化、避免心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用突出2。由于虾青素国际市场需求的日趋增加，针对其潜在防病、治病功能的研究越发引人关注，在以往流行病学统计中就虾青素为预防与医

8、治呼吸性疾病提供帮忙的可能性仅有零星报导，但尚存在必然的争议3。为此围绕此类课题开展研究显然具有很重要的理论与临床意义。因此，本实验旨在通过虾青素对脂多糖诱导小鼠ALI模型进行研究，初步揭露其对此类损伤潜在的预防爱惜作用。 1 材料与方式 要紧仪器和试剂 Labconco冰冻真空干燥仪（法国乐高公司），752分光光度计（中国伯乐公司），960型荧光分光光度计、J2 SH高速冰冻离心机（日本岛津公司），C30柱（YMC Carotenoid S 5，Waters），HPLC（Waters 600E溶剂输送系统，PDA 2996二极管阵列检测器Waters），脂多糖、地塞米松（美国SIGMA），F

9、ITC标记的抗大鼠CD3单克隆抗体、PE标记的抗大鼠CD4和CD8单克隆抗体(美国Caltag公司)，小鼠TNF ELISA试剂盒(武汉博士德公司)，小鼠IL 八、IL 10 ELISA试剂盒(美国RB公司)，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒及髓过氧化酶(MPO)测定试剂盒(南京建成生物工程公司)，虾青素乳化颗粒（瑞士罗氏DMS公司），乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚（MTBE）（美国迪马公司），大孔吸附树脂（天津农业股分公司）。 乳化剂破乳制备虾青素 有机萃取 称取10 g乳化颗粒加入少量水，超声波促溶后，加入300 ml

10、丙酮 正己烷萃取。静置2 h后，将脂溶性相搜集（反复萃取直至水相成无色）。再利用减压旋转蒸发仪进行提取液浓缩处置。 虾青素提取液柱色谱纯化 装柱。将活化好的氧化铝装填于玻璃层析柱中，装填高度为12 cm，用正己烷润湿。洗脱。别离取2 ml虾青素提取液上柱，用50 ml正己烷 丙酮淋洗，搜集洗脱液。将洗脱液用氮气吹干制粉，装入充满氮气的玻璃瓶内，-70贮存备用。 虾青素鉴定 参照全反式虾青素标准品，依照其HPLC中保留时刻和紫外可见吸收光谱的特点峰进行鉴定。取得的虾青素提取液通过滤后用高效液相色谱分离。色谱条件：色谱柱：Waters YMC Carotenoid S 5 mm250 mm)；流动

11、相A：乙腈 甲醇（VV=7525）；流动相B：MTBE；流动相A与B中别离加入%三乙胺作为改性剂避免虾青素降解；线性梯度洗脱：B在8 min内由0%增加至55%；835 min B维持55%；3540 min B由55%减至0%；流速： ml/min;检测波长：l/nm=480；波长范围260700 nm；进样量：20 l。并搜集后观看其光谱特点峰行为。通过色谱和光谱分析结果说明实验所用灌胃物为全反式虾青素，纯度为95%。 动物实验 ALI模型的成立与动物分组 实验小鼠（购自中国军事医学科学院实验动物养殖中心）按体重随机分为6组：正常对照组、ALT模型组、虾青素低、中、高剂量组（10、1五、2

12、0 mg/kg）和阳性对照组（地塞米松5 mg/kg），每组10只。虾青素组动物天天给予不同剂量的虾青素，正常对照组、ALI模型、阳性对照组给予溶剂(食用色拉油)，持续灌胃30 d，每周称体重1次，依照体重调整灌胃量。30 d后，各剂量虾青素组、ALI模型组、阳性对照组小鼠别离腹腔注射LPS mg/kg，成立ALI动物模型，正常对照组小鼠腹腔注射生理盐水。造模6 h后，股动脉放血处死，结扎右肺，暴露气管进行气管插管，用生理盐水 ml分3次进行支气管肺泡灌洗，搜集BALF，取BALF离心后上清2 ml冷冻干燥成干粉；并搜集小鼠腹主动脉血。 肺湿重/干重比测定 各组小鼠开胸取全数左肺，滤纸吸干，称

13、量湿重，60烘烤48 h，称量干重，计算肺组织湿重/干重(W/D)。 肺组织TNF 、IL 10及MPO的测定 取肺组织匀浆液，采纳酶联免疫吸附法测定各组小鼠肺组织中TNF 及IL 10的含量。按试剂盒说明书测定MPO，测定进程中需注意低温及避光操作。 动脉血T淋巴细胞亚群CD+3，CD+4和CD+8的检测 搜集小鼠腹主动脉血 ml，EDTA抗凝后别离取60 l加入2个流式细胞仪检测专用试管中。具体操作参照文献4，并严格按试剂说明书进行。 动脉血抗氧化指标检测 经3 000 r/min离心10 min，分离血清，测定各组血清中SOD、GSH Px、MDA水平。MDA含量测定方式：硫代巴比妥酸（

14、TBA）比色法；SOD活性测定方式：亚硝酸盐法；GSH Px活性测定方式：5，5 双硫代对硝基苯甲酸（DTNB）显色法。 TNF 和IL 8的检测 采纳酶联免疫吸附法测定，用生理盐水300 l溶解BALF冷冻干粉，别离用TNF 和IL 8酶联免疫测定试剂盒，测定该溶液中TNF 和IL 8含量。 统计处置 所有数据用xs表示，用统计软件进行统计，组间不同比较用单因素方差分析。 2 结 果 虾青素对肺组织W/D的阻碍 与对照组(W/D=相较，ALI模型组（W/D=），W/D值显著升高(P；与ALT模型组比较，虾青素各剂量组和阳性对照组W/D那么别离降低至（虾青素低剂量组）、（虾青素中剂量组）、（虾

15、青素高剂量组）、（阳性对照组），不同显著(P，并显示出必然的量效关系；但虾青素组的疗效不如阳性对照组(P。 肺组织TNF 、IL 10及MPO的测定 表1可见，与对照组比较，ALI模型组小鼠肺组织TNF 、MPO含量显著升高，而IL 10含量显著降低(均P。与ALI模型组比较，虾青素各剂量组和阳性对照组IL 10含量明显升高，TNF 、MPO含量明显降低(均P，显示出必然的量效关系；但虾青素组的疗效不如阳性对照组(P。 动脉血T淋巴细胞亚群CD+3、CD+4和CD+8的检测 表2可见，与对照组比较，ALI模型组小鼠动脉血中T淋巴细胞亚群CD+3、CD+4和CD+8含量显著降低(P。而与ALI模

16、型组比较，虾青素各剂量组和阳性对照组T淋巴细胞亚群CD+3、CD+4和CD+8明显升高(P，显示出必然的量效关系；虾青素组的疗效不如阳性对照组(P。 动脉血抗氧化指标检测 表3可见，与对照组比较，ALI模型组小鼠血中SOD、GSH Px活性显著降低，而MDA含量显著增加(均P。而与ALI模型组比较，虾青素各剂量组和阳性对照组血中SOD、GSH Px活性明显升高，MDA含量明显降低(均P，显示出必然的量效关系；但虾青素组的疗效不如阳性对照组(P。表1 各组肺组织TNF 、IL 10及MPO含量与正常对照组相较：1）P；与ALI模型组相较：2）P；与阳性对照组相较：3）P，下表同 表2 各组小鼠动

17、脉血T淋巴细胞亚群CD+3、CD+4和CD+8转变表3 各组小鼠血清SOD、GSH Px活性和MDA含量 TNF 和IL 8的检测 表4可见，与对照组比较，ALI模型组小鼠肺组织BALF中TNF 、IL 8含量显著升高(P。与ALI模型组比较，虾青素各剂量组和地塞米松阳性组TNF 、IL 8含量明显降低(均P，显示出必然的量效关系；但虾青素组的疗效不如阳性对照组(P。表4 各组小鼠肺BALF中TNF 、IL 8含量 3 讨 论 诱发ALI的因素众多，但不管开始的刺激因素是细菌性仍是非细菌性，其引发的几乎都是一种不易调控的全身性免疫紊乱，免疫细胞过度活化和免疫炎性因子大量释放，致使病理损伤。机体

18、在严峻的细菌感染、创伤、烧伤或应激状态下，大量的内毒素与巨噬细胞表面受体结合，巨噬细胞被过度活化，释放大量炎性细胞因子，引发系统性炎性反映综合征(SIRS)，最终致使机体的病理损害乃至死亡5。 研究说明当机体摄入LPS，体内肺组织细胞中的自由基代谢平稳就会失调，对自由基的防御能力也会下降，过量自由基可使生物膜脂质双分子层中的不饱和脂肪酸过氧化，而形成脂质过氧化产物，从而使膜结构和功能发生障碍。过氧化脂质的代谢产物MDA，进一步与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，生成无活性脂褐质，沉积于组织细胞，破坏细胞膜结构，最后致使细胞无法维持正常代谢而死亡6。本实验的结果说明，与ALI模型组比较，虾青素各剂量组均

19、升高血SOD、GSH Px活性，降低MDA含量，说明虾青素能够改善LPS所致ALI模型小鼠抗氧化能力。 T细胞对机体细胞免疫和体液免疫类型、强度都有重要调剂作用，T淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。CD+3反映总T细胞；CD+4散布于T细胞的辅助细胞诱导亚群和抑制细胞诱导亚群表面，其要紧生理功能是诱导B淋巴细胞增生和分化产生抗体，诱导和辅助细胞毒T细胞前身成为细胞毒T细胞，辅助性T淋巴细胞要紧通过度泌细胞因子调剂杀伤淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等活性； CD+8散布在抑制性和杀伤性T淋巴细胞表面，CD+8通过自身和抑制因子在免疫反映中起负向调剂作用，是机体免疫和调剂

20、的重要因素。T细胞调控网络失去平稳，可致使机体发病，如辅助性T细胞功能低下，机体易发生感染，抑制性T细胞功能低下可能发生过强免疫反映7。本研究结果显示，ALI模型组小鼠CD+3、CD+4、CD+8有降低趋势，而虾青素不同剂量组均高于ALI模型组。 TNF 是ALI炎症反映中重要的启动因子，也是介导初期ALI的要紧细胞因子。它能够直接损伤肺血管内皮细胞，活化中性粒细胞(PMN)，使得PMN黏附并脱颗粒及呼吸暴发，造成肺组织损伤，并能刺激IL 一、IL 六、IL 8等的产生，形成纵横交织的细胞因子作用网络，介导炎症反映损伤肺组织8。IL 8是PMN最有效和最要紧的趋化因子。在游离IL 8形成的浓度

21、梯度的趋化下，PMN穿过内皮进入肺间质与肺泡腔，抵达肺组织的PMN继续受到IL 8的强烈刺激，发生呼吸暴发和脱颗粒现象，释放出大量的损伤介质引发肺损伤。ALI时IL 8升高较晚但持续时刻长，因此IL 8在ALI发病后期损伤及预后转归上起着更为重要的作用9。而IL 10为抗炎因子，主若是由单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞产生，阻碍前炎症细胞因子的产生10。本实验说明：虾青素呈剂量依托性地抑制TNF 、IL 8的分泌，而提高IL 10。 综上所述，虾青素能降低由于LPS诱发的肺组织W/D、TNF 、IL 八、MPO活性升高，增强IL 10分泌与抗氧化能力，改善T淋巴细胞亚群CD+3、CD+4、CD+

22、8散布，说明虾青素可能通过调剂促炎性因子、抗炎因子的释放和拮抗氧应激对肺组织产生爱惜作用，其确切机制有待进一步研究。另外，虾青素虽作用成效略逊于地塞米松，但由于其是一种天然食用平安的化合物，因此以后应用前景更显优势。【参考文献】 1 凌亦凌，黄新莉.呼吸衰竭发病机制的研究进展J.临床内科杂志，2004；21（3）：649 52.2 惠伯棣主编.类胡萝卜素化学与生物化学M.北京：中国轻工业出版社，2005：156 68.3 刘 敏，胡嘉想，秦光和，等.虾青素的毒理平安性评判J.毒理学杂志，2020；15（3）：25 8.4 蒋灿华，叶冬霞，陈万涛，等.中药参阳方冲剂对舌鳞癌SD大鼠外周血淋巴细胞

23、亚群的调剂作用J.中华口腔医学杂志，2005；40（3）：118 21.5 徐淑云，卞如濂，陈 修.药理学实验方式学M.第3版.北京：人民卫生出版社，2002：34 61.6 李红梅.氧化应激和TLR4信号转导通路是致使急性肺损伤的关键途径J.中国病理生理杂志，2020；20（5）：52 5.7 孙秀泓，罗自强.肺的非呼吸功能基础与临床M.北京：人民卫生出版社，2003：320 71.8 Yu Z，Ohtaki Y，Kai K,et roles of platelets in lipopolysaccharide induced lethality：effects of glycyrrhizi

24、n and possible strategy for acute respiratory distress syndromeJ.Int Immunopharmacol，2005；31（5）：571 80.9 Matsui S，Matsumoto H，Sonoda Y,et and related compounds down regulate production of inflammatory chemokines IL 8 and eotaxin 1 in a human lung fibroblast cell lineJ.Int Immunopharmacol,2004；21（4）：1633 44.10 Zhao XQ，Zhang JF，Kuang XC,et effect of diammonium glycyrrhizinate on the expression of IL 10 and IL 18 of pulmonary alveolar marcophage from acute lung injury ratsJ.Chin J Tuberc Respir Dis,2004；27（3）：126 7.