泽泻化学物质基础及其毒性研究进展.docx

1、泽泻化学物质基础及其毒性研究进展泽泻化学物质基础及其毒性研究进展 在中医药传统使用中，泽泻是一种常见的中药。随着临床应用中毒性报道日益增加，而其肾毒性逐渐得到关注。该文系统回顾了化学物质基础的相关研究，包括其化学成分和可能的毒性成分;以网络毒理学研究为基础，叙述了泽泻毒性作用。基于泽泻肾毒性研究的争议，剖析了可能存在的原因，认为泽泻肾毒性可能与药材的毒性物质基础组分导致的毒理网络调控差异、采用的样品炮制工艺存在差别、代谢功能强弱导致的成分蓄积、实验的剂量与时间长短及其复方配伍等因素有关。该文为提高泽泻的质量控制水平和科学合理使用泽泻提供了一定的参考和思路。标签： 泽泻;毒性成分;肾损伤 主产于

2、福建，四川，江西等省区。生于湖泊、河湾、溪流、水塘的浅水带，沼泽、沟渠及低洼湿地亦有生长。泽泻具有利水、清湿热和泄热等功效，可用于治疗小便不利、水肿胀满、泄泻尿少、痰饮眩晕、热淋涩痛等病症1。单味药材及其复方均有使用，比如常见的六味地黄丸，其中一味即为泽泻。在传统的使用中，泽泻潜在的毒副作用一直不为人知。本草史籍对其毒副作用记载一直较少，如神农本草经云：“其味甘，寒，无毒”;直到现代，随着药理学、病理以及色谱技术等迅速发展，为揭示泽泻潜在毒副作用提供了便利条件。在现代记载泽泻的文献中，泽泻毒性相关的记载逐渐增多。中草药不良反应及防治记录：泽泻“大剂量或长期应用，可致水电解质失衡以及血尿，甚至发

3、生酸中毒”2。南方有毒药物及其中毒的处理一书中描述其为全株有毒，根部较毒3。本草蒙筌中也记载：“泽泻多服”， 可致“目昏”4。这些文献都提示泽泻具有毒副作用，尤其是肾毒性作用。但是对泽泻是否有肾毒性研究结果存在差异，有学者认为长期大剂量服用泽泻水提物对于小鼠有慢性肾毒性;而有一些研究结果显示尽管对肾脏相关指标有一定影响，但仍未达到有毒的水平。最新研究证明泽泻可引起肾间质炎症细胞浸润和肾小管损害5-8。泽泻是临床常用中药之一，素问等记载的方剂中均有泽泻的使用，因为其含有多种化学成分，如含有萜类、多糖、挥发油等多种组分。研究人员依据植物化学方法已经分离获得多种成分，这些成分或起到药效作用，或起到毒

4、性作用。但是，引起肾毒性的化学成分依然不明确，且毒理机制也不明了。目前，尚未存在文献对泽泻肾毒性进行系统的剖析。因此，本文系统梳理了泽泻的化学成分及其导致肾毒性的化学成分，并系统提出依据组分结构理论思想解决泽泻毒性物质基础及毒理机制的思路和方法，为合理应用泽泻，实现有效质量控制起到了一定的参考作用。1 泽泻化学物质基础泽泻作为药物使用，首载于东汉神农本草经，列为上品，以后历代本草多有记载9。本草图经、本草纲目、植物名实图考等本草史籍中均有泽泻的原植物图，与当代药用泽泻基本相同。人们对泽泻的药用研究从未停止，随着现代分析技术，尤其是色谱质谱技术的发展，研究者们对泽泻成分的分析研究越来越普遍，越来

5、越深入。总结以物质基础研究为主的泽泻成分分析研究发现，泽泻含有多种组分，常见的包括三萜类、倍半萜类、二萜类、挥发油、生物碱类、黄酮类等主要组分，除此之外，还包括多糖、蛋白质、氨基酸等成分。1.1 三萜类 三萜类成分是泽泻中的主要成分之一，在泽泻的功效中起着非常重要的作用。泽泻醇A及其乙酸酯、泽泻醇B及其乙酸酯、泽泻醇C单乙酸酯是首次从泽泻中分离出的三萜类化合物10。随着对泽泻分析研究的深入，目前，已从泽泻中获得多个三萜类化合物，均为原萜烷型四环三萜，主要为泽泻醇A， B， C， D， E， F， G， H， I， J， K， L， M， N， O及其衍生物11-14。归纳其生源途径，这些化合物

6、主要由23-乙酰泽泻醇B（图1）衍生而来。1.2 倍半萜类 倍半萜类化合物是泽泻中另一主要组分，最早分离得到的主要是泽泻醇和泽泻二醇。目前，从泽泻中分离得到倍半萜类化合物，多数为愈创木烷型，吉玛烷型、桉叶烷型以及O-plopanane型较少（图2）。常见的有：新倍半萜orientalol D， 如alismol，alismoxide，泽泻萜醇AE，sulfoorientalols AD，10-甲氧基-泽泻二醇，桉叶烷型倍半萜桉烯二醇，泽泻萜醇E，F，oplopanane，泽泻酮，泽泻醇，泽泻二醇，倍半萜吉玛烯C和吉玛烯D等。1.3 二萜类 二萜类也是泽泻中的重要成分之一，泽泻中二萜类化合物主要

7、是贝壳杉烷型四环二萜类。目前，分离鉴定出的泽泻二萜类主要有3种，分别是16（R）-ent-kaurane-2，12-dione15，oriediterpenol16， oriediterpenoside16（图3）。1.4 挥发油 泽泻属植物中含有丰富的挥发油类，成分比较复杂。吴启南等采用GC-MS法分析鉴定泽泻挥发性成分50余种，-榄香烯、三甲基正丁醛、二甲基正丁醛、己酸己酯、-石竹烯、二戊基呋喃、蛇麻烯和氧化石竹烯等含量较高。其中，-榄香烯含量高达30%左右，三甲基正丁醛、二甲基正丁醛含量可达6%左右17-18。而异长叶烯、3，5-二甲苯酚、柠檬烯、-石竹烯、-榄香烯、三甲基正丁醛等都具有

8、一定的毒性。1.5 黄酮 目前，从泽泻干燥块茎中分离得到的只有大黄素和2，2，4-三羟基查耳酮19-20。1.6 多糖 多糖在抗肿瘤等方面都发挥着重要生物活性，是目前研究的重点。泽泻多糖主要包括蔗糖、D-葡萄糖、-D-甲基呋喃果糖苷等多糖。李小凤等采用水提醇沉法提取泽泻多糖，并以苯酚-硫酸法测定泽泻多糖质量分数为5.783%。随着对泽泻的多糖类成分的研究逐渐深入，先后从泽泻提取物中提取分离出泽泻PII， PIIIF， SI多糖。其中，PII 和PIIIF均为酸性多糖，PII为典型的阿拉伯-3，6半乳糖聚糖并带有末端的葡萄糖醛酸单位，相对分子质量约为5.2510<sup>4</

9、sup>。它是由摩尔比为492的L-阿拉伯糖， D-半乳糖， D-葡糖醛酸构成。PIIIF为阿拉伯3，6-半乳糖聚糖和鼠李糖半乳糖醛酸单位。泽泻多糖SI为中性的葡聚糖，其相对分子质量为1.110⁴，完全是D-葡萄糖组成，为-1，4苷键连接的D-葡萄吡喃糖，带有部分-1，6苷键及3，4和4，6连接的分支点21-23。1.7 氨基酸 氨基酸也是泽泻中的主要有效成分。吴水生等测定了不同产地泽泻的游离氨基酸和全氨基酸成分，并对其含量与构成做了相应的分析。结果显示泽泻中含有17种常见的氨基酸：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、

10、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬草氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，大多数属于非必需氨基酸。泽泻中全氨基酸含量高达12%20%。尽管不同产地的泽泻含有的总氨基酸和游离氨基酸含量存在一定的区别，但其结构组成比例有其共同的规律性24。1.8 其他 除了以上组分外，泽泻中还有生物碱、胆碱、糠醛、乳糖六磷酸酯、肌醇六磷酸酯钠盐、尿嘧啶核苷及胸腺嘧啶脱氧核苷等成分，这些成分种类较少，含量较低。2 泽泻毒性成分及其毒性通常认为泽泻在一定剂量范围内是不具有毒性的25。张伯礼院士等结合FDA荧光标记和MTT 2种方法评价猪肾近曲小管上皮细胞LLC-PK1细胞损伤来筛查肾毒性组分，并采用液-

11、质联用解析鉴定毒性最明显的化学组分泽泻醇C，16，23-环氧泽泻醇B和泽泻醇O（图4） 7。Yue Yu等采用UPLC-MS代谢组学方法，揭示泽泻所致肾损伤病理状态下的13个代谢产物，分别为马尿酸、肌酐、2，8-二羟基喹啉-D-葡萄糖醛酸苷、2，8-二羟基喹啉、C16二氢鞘氨醇、二氢鞘氨醇、7-甲基鸟嘌呤、苯乙尿酸、酮胆汁酸、胆酸及3个未知化合物26。Xu 等研究显示泽泻醇B，泽泻醇B-23-乙酸酯可抑制HepG2，MDA-MB-231，MCF-7细胞增殖，并诱导细胞凋亡27。张宏达等研究结果表明，24-乙酰泽泻醇A 能明显促大鼠肾小球系膜细胞增殖，提示24-乙酰泽泻醇A可能是泽泻肾脏毒性的物

12、质基础之一28。此外，未见与泽泻毒性物质基础的研究报道。这对泽泻的临床用药安全及其毒性研究都有较大的参考依据。有研究泽泻水煎剂对正常大鼠肾脏并无明显毒性作用，但可致1/2肾切除大鼠残肾间质炎症细胞浸润和肾小管损害6。但是也有研究显示，对正常小鼠，长期大剂量服用泽泻水提物可导致慢性肾毒性，可减轻体重降低肾脏系数，提高血清中血尿素氮、肌酸酐、尿N-乙酰-葡萄糖苷酶含量。但是不同性别小鼠之间无显著性差异8。姜淋洁研究显示，泽泻组分1高剂量均能极显著升高两性小鼠血尿氮素（BUN）、肌酐（CR）、N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶（NAG）及谷氨酰转移酶（-GT）的含量，并且能显著性降低BMP-7的表达量，同时升

13、高MCP-1的表达量，其高剂量组对小鼠的肾脏损伤最严重5。而段雪英研究表明，给予大鼠泽泻水煎煮液低、中、高3个剂量（剂量分别相当于临床用量的50， 100， 200倍），60 d后，中、高剂量组的大鼠尿-谷氨转移酶指标有异常改变，但病理组织学检查未见明显病理性损伤29。尽管泽泻肾毒性的研究报道逐渐增多，但是泽泻引起肾毒性的机制尚不清楚。有学者认为泽泻醇提物对肾脏Na⁺-K⁺-ATP酶有抑制作用可能是泽泻产生利尿作用的机制之一，即通过抑制肾小管上皮细胞Na⁺-

14、K⁺-ATP酶活性，干扰钠、水的重吸收30。3 泽泻毒性成分作用Hopkins首次提出了网络药理学，以网络方法为基础，建立药物、靶点和疾病三者之间的关系，设计具有多种药理学作用的药物。随着系统生物学的深入研究，网络药理学迅速成为药学领域研究的重点，为药理学和毒理学的研究开辟了一种新颖的研究途径。范骁辉等31在系统生物学和网络药理学研究的基础上，提出了“网络毒理学”的概念，通过构建网络模型来描述研究对象的毒理学性质，对所建立网络模型因果关系进行分析，认识药物对机体的毒副作用并探讨其毒性机制等。网络毒理学的发展，为泽泻肾毒性原理及其机制研究提供了一种新

15、的思路。采用Pathway Studio 6.1软件对PUBMED数据库中以”泽泻”为关键词搜索，发现其作用的有限靶点如TNFSF11，TGFB1，NR1H4，NOS2A等，这些靶点影响细胞生理过程包括NO合成、线粒体膜电位、钙调控、细胞周期、细胞凋亡等过程，因此可建立泽泻毒性作用靶点-疾病网络（图5）。通过构建网络模型来描述泽泻的毒理学性质，分析所建立网络模型因果关系，有利于认识泽泻对机体的毒副作用并探讨其毒性机制等。目前，由于有限的信息，泽泻对有机体的生物机能及作用机制研究还比较肤浅，因此网络毒理学为泽泻肾毒性研究提供一种新的方法。对于泽泻可能的作用靶点，目前未见深入的研究报道。泽泻多成分

16、通过多靶点发挥药效作用，但是某些靶点与相应的毒副作用有关，这就导致泽泻在发挥药效的同时会引起毒性作用。通过分子模拟对接的研究，泽泻中泽泻醇M-23-乙酸酯和泽泻醇A-23-醋酸酯可作为拮抗剂作用于孕激素受体与糖皮质激素受体，作为激动剂作用于雄激素受体和法尼酯X受体32-33。而在泽泻诱导大鼠肝脏毒性的研究中显示泽泻甲醇提取物能提高环氧化物水解酶和谷胱甘肽S-转移酶，清除有毒的环氧化物;也可减弱BB诱导增加氨基比林N-脱甲基和苯胺羟化酶，产生有毒的中间产物34。这给泽泻的肾毒性作用靶点提供了研究。4 泽泻致毒差异性泽泻的毒性研究结果存在较大争议，有些研究结果显示长期大剂量服用泽泻水提取物对机体有

17、慢性肾毒性;有些研究结果显示泽泻对肾脏的影响尚未达到毒性损伤水平，只是对相关指标有一定影响;还有一些研究结果显示泽泻对正常大鼠肾脏并无明显毒性作用，但是可导致1/2肾切除大鼠残肾间质炎症细胞浸润和肾小管损害。针对这些研究结果存在的差异，结合组分结构理论，笔者归纳总结可能存在以下几个方面的原因：第一使用药材的毒性物质基础组分导致的生物网络调控差异。中药发挥药效作用是通过多靶点、多层次、多环节整体调控机体生物网络从而达到防病治病的功效。对于毒性，也存在同样的调控方式，只是这种调控超出了原有的平衡范围（图6）。不同的物质基础组成在产生药效作用的同时，也同样产生了毒性作用。文献对泽泻的毒性存在不同的记

18、载，可能与实验研究使用的药材有密切关系。泽泻主产于福建、四川、江西等地，有建泽泻、川泽泻、江泽泻之分;商品中以福建、江西产者称“建泽泻”，个大，圆形而光滑;四川、云南、贵州产者称“川泽泻”，个较小，皮较粗糙。不同的药材含有的化学成分组成也不一样，这不是意味着某些批次或产地药材含有某些成分或不含有某些成分，而是不同成分之间存在一个组成结构特征。色谱分析结果显示不同产地的泽泻物质基础确实存在明显差异，以23-乙酰泽泻醇B为例，福建产的泽泻（建泽泻）的23-乙酰泽泻醇B含量普遍高于非福建产地的泽泻（川泽泻和江西泽）。建泽泻的1，2，3号峰构成一个明显的“川”字型，2，3，4号峰构成一个明显的“山”字

19、型;而川泽泻的1，2，3号峰则构成一个“山”字型，2，3，4号峰构成一个倒“川”字型35。 这些组成结构的不同导致的肾毒性也存在差别。组分结构理论是我们课题组首次提出36-37，认为方药物质基础是一个有序的整体，具有“三个层次多维结构”特征：第一层次是组成物质基础的最基本单元，为单体成分，具有稳定的结构特征;同一化学类别成分构成组分，即第二层次，组分中各成分间存在量比关系（组分内结构）;第三层次是由多组分构成的整体即中药物质基础，组分间存在量比关系（组分间结构）。这为解释泽泻毒性差异提供了理论依据，也为进一步揭示其肾毒性提供了切实可行的思路和方法。第二采用的样品炮制工艺存在差别：中药炮制前后药

20、效物质的改变是引起炮制品药性和功效改变的根本所在，因此，研究中药炮制前后化学成分性质和含量的变化成为中药炮制机制研究的重要内容38。中国药典（2010年版）规定泽泻的炮制方法为盐炙，现在临床使用的泽泻主要有生泽泻、盐炙泽泻、麸炒泽泻等。炮制品利尿而不伤阴，但是其作用机理尚不明了，可能就是所谓的减轻毒副作用。在对泽泻炮制饮片与生品饮片之间指纹图谱进行比较，发现存在显著性的差异。泽泻生饮片在炮制过程中化学成分发生了较大的变化，而这些变化较大的一组化学成分，可能是生品与炮制品药效差异的内在原因（图7）。第三代谢功能强弱导致的成分蓄积：蓄积是指物质逐次进入生物体，在靶器官内聚集或者物质对生物体所致效应

21、的累加现象，这种累加最终造成组织或器官的损害。正常大鼠代谢功能正常，化学成分经体内代谢产生的代谢产物等在体内能保持一个较低范围的蓄积量;但是在1/2肾切除大鼠体内，仅一个残肾，在实验研究中给予的药物量是相同的，这就导致代谢物质在体内甚至残肾内蓄积，超过了机体正常承受范围，所以产生肾毒性。这为不同泽泻毒性研究结果存在差异，提供了一种可能的解释。第四实验的剂量与时间长短：除了上述提到的原因之外，不同实验的实验条件之间也存在差异，比如实验给予的药物剂量不一致;另外，给药时间也各不相同，有的实验是6个月，有的实验是2个月。不同剂量、不同给药时间，体内化学成分的蓄积也存在着显著差异，这是不同实验存在结果

22、差异的另一原因。第五泽泻复方配伍：复方配伍的目的在于优化组合处方，增效、减毒，扩大治疗范围，适应复杂病情，预防药物中毒。复方配伍是中药使用的一大特色，其主要作用是增效或者减毒。在泽泻的复方制剂中，六味地黄丸最为大家熟知。但是，使用如此广泛的一个配方，历经上千年的使用，也未见相关的肾损伤的报道。在六味地黄丸的组方中，泽泻仅占3/25，以宛西六味地黄浓缩丸为例，每8丸相当于原药材3 g，【用法用量】规定：口服，一次8丸，一日3次。按此计算，每天服用泽泻仅1.08 g，这远未达到毒性剂量。这就可能是复方制剂肾毒性低的原因之一。泽泻作为南药的道地药材，在临床和中药制剂中使用广泛，其毒副作用需要引起足够

23、的重视。但是，目前对于泽泻的研究仍旧处于起始阶段，这与中药现代化和国际化标准还相距甚远。尽管目前对泽泻的化学成分信息逐渐增多，但是迄今为止，泽泻的毒性物质基础、毒性范围、质量控制指标、作用机理、体内的代谢过程等研究尚少，因此，借助现代色谱、药理学、分子生物学等手段，从组分结构特征角度加强泽泻毒性物质基础和作用机理研究39，这对于提高泽泻的质量控制水平和科学合理使用都有较好的参考依据。参考文献1 罗张炎， 周爱存， 张朝凤， 等. HPLC同时测定泽泻中4种泽泻醇成分的含量J. 中国中药杂志， 2010， 35（24）： 3306.2 丁涛. 中草药不良反应及防治M. 北京： 中国中医药出版社，

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