PGPR在根际定殖机理文献综述.docx

1、PGPR在根际定殖机理文献综述PGPR在植物根际的定殖机理研究摘要：随着人口速度的快速增长、环境的日益破坏，人类在面临粮食短缺的生存危机的同时，粮食安全问题也严重影响着我们的生活质量。农药、化肥的大量施用所带来的粮食高产，越来越引起人们的关注，思考如何在保证粮食高产的情况下，生产出健康的食品，成为近年研究的热点。生物防治在保护生态环境的同时，能够很好地把田间杂草、病害虫等除去，符合可持续开展的要求。植物根际促生菌PGPR通过在植物根际定殖，发挥防病、促生的作用。研究PGPR的定殖机理，对影响其定殖因素进展人为干预，使PGPR在根际定殖数量显著增加，从而获得粮食大丰收，具有很大意义。关键词：粮食

2、安全PGPR 定殖 根际是指受植物活根影响的土壤微区，它的围是围绕根外表12mm厚的土壤。根据其对植物的作用，根际细菌(rhizobacteria)分为有益(25)，有害(815)和中性(8090)3类。PGPR属于有益的一类，相对于PGPR，DRMODRMO=deleterious rhizosphere microorganisms如此是根际有毒有害的微生物。由于植物根系不断地分泌各种代产物，包括糖类、氨基酸、有机酸、脂肪酸和甾醇、生长素、核苷酸、黄酮、酶类以与其他化合物，为微生物提供营养；加上根表组织陆续死亡和脱落，改良周围土壤的物理和化学性质，丰富了土壤有机质，也为微生物的大量繁殖创造

3、了条件，使植物根际具有很高的生物活性，因而植物根际是土壤微生物生活特别旺盛的区域根际中微生物的数量和活性远高于远离根的土壤，由于细菌对各种根分泌物的利用率与敏感性远远超过放线菌、真菌和原生动物等，因而在根际中占主导地位。PGPR作为对植物有益的微生物群体，对它的研究可以获得更大的生态、经济和社会价值。PGPR指的是植物根际促生菌，英文名称为Plant growth-promoting rhizobacteria，它是指能够促进植物对矿质营养的吸收和利用，或者产生促进植物生长的代物，甚至抑制有害微生物的根际细菌。一般具有固氮、溶磷、解钾能力，或能产生植物激素、分泌抗生素等功能的细菌、蓝细菌等。其

4、具有的特色功能是防病、增产。这对于提高目前的粮食产量以与改善日益恶化的土壤环境具有重要的意义。正是由于PGPR的重要性，才吸引世界上各国的科学家对其争相研究。由于PGPR不是单独地生长在土壤中的，它是通过与植物的相互作用，即PGPR定殖到植物体上才能发挥其作用，因此，PGPR定殖机理的研究又成为研究的热点中的特点。关于定殖，不同研究者有不同的概念，有的学者将细菌能在植物根际建立相对大的群体的能力称为该菌的定殖能力1，另一些如此认为定殖包括细菌在根际的移动、竞争力，也包括繁殖能力2。无论是何种概念，定殖都包括以下几个方面：一时能够在植物根际生存下来，二是能以植物根际作为细菌本身适合的环境繁殖，随

5、着植物根系的兴旺而繁殖，通过与其他生物竞争而形成一个较大的群体3。1 PGPR的研究背景自从1978年Burr等人首先在马铃薯上报导PGPR以来，国外已发现包括荧光假单孢菌、芽孢杆菌、根瘤菌、沙雷氏属等20多个种属的根际微生物具有防病促生的潜能，最多的是假单胞菌属(Pseudomonas)，次为芽胞杆菌属(Bacillus)、农杆菌属(Agrobacterium)、埃文氏茵属(Eriwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、巴斯德氏菌属(Pasteuria)、沙雷氏菌(Serratia)、肠杆菌(Enterobacter)等。国际上这一领域的研究非常活跃，每3年开一次国际性专业性

6、研讨会议4。目前研究的促生PGPR主要有：芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、根瘤菌属、放线菌、木霉，可以看出细菌的研究最多。据统计，从PGPR提出到1998的短短20年间，就有4000篇关于PGPR的学术论文发表5。事实上，最早开展PGPR研究的是原联，20世纪50年代就报道应用有益微生物促进作物增产，而中国农业大学研制的增产菌大面积的应用自70年代末就开始了我国在田间应用PGPR增产菌始于1979年，已在30多个省、市、自治区的55个不同作物上应用，到1994年，我国在3.93107hm2的土地上使用了增产菌，在不同作物上平均增产1020不等6。作为既能防病又能增产的PGPR生物制剂产业化前景广阔产

7、业化品种主要有两种：活体制剂和PGPR代产物制剂，前者即应用PGPR活菌体，直接进展植物病害的防治，其生防机制包括拮抗作用、交叉保护作用和诱导抗性作用从生态学观点看，活菌应用还有利于改善土壤和植物体的微生态环境。目前，国外的活体PGPR生物制剂主要有粉剂和颗粒剂两种产业化品种PGPR代产物制剂即应用PGPR菌在深层发酵过程中的代产物，应用时直接针对植物病原菌或针对病原菌的代产物如抗菌素、细菌素、溶菌酶等等，其作用主要为抑菌或杀菌生产针对寄主植物的代产物，主要称作激发子，其主要作用是激发寄主植物产生防卫反响，微生物来源的激发子近年来已发现的有寡糖类、寡聚糖类、肽类、小分子蛋白、脂肪类和糖蛋白类等

8、7。2 PGPR的功能主要表现在以下四个方面：固氮作用；提高植物根际养分的可利用性；增强其它有益的共生作用；复合促生作用。已经实际应用到生产中的如根瘤菌、溶磷菌如巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌等等。在有机肥中添加这些菌剂可以制成新型的肥料生物有机肥，以其环境友好型，且能提高粮食作物抗病性、产量的功能，得到国家的大力资助。有些PGPR发挥功能，是通过产生植物激素、ACC脱氨酶、挥发性物质等促进植物生长，并且能促进植物生长、改变根形态、增加根长度、根毛数、侧根数、根质量与根外表积。PGPR代产生的这些物质，对于植物根的发育和生长具有重要作用，这是通过根对各种环境胁迫的适应性，使得植物能够很好的抵抗各种致

9、病菌以与提高贫瘠环境中养分的有效性。微生物在根际定殖最大的障碍之一就是如何保证它们能够在土壤中存活下来。我们都知道如果把豆科植物根瘤的根瘤菌移出，那么它不但会丧失固氮能力，而且也会使其本身的生长受到严重胁迫。因此，如何保证功能菌种在土壤中存活并具有生物活性成为限制快速开展的一项技术难题。对受到农药、化肥、重金属、有机废弃物等不同性质的污染物污染的土地的治理措施，可以采用PGPR生物修复的方法，科学家通过研究筛选出了降解污染物的根际细菌，它可以利用植物根际分泌物作为主要营养，并发挥讲解作用处理污染物。目前获得一株能高效利用根际分泌物，又能降解根际污染物萘的恶臭假单胞菌PCL1444，保护植物免受

10、萘伤害。目前研究的多得是ACC脱氨酶，其可以降低植物体乙烯水平。并可解除植物病原细菌、多环芳烃碳氢化合物、重金属Ni2+和Ca2+、盐、干旱与淹水等生物和非生物压力对植物的危害。有证据明确，植物根表上大量PGPR细胞的存在会导致根上“根定殖真菌Root-colonizing fungi群体数量的下降。根细菌对根定殖真菌的抑制作用是非常明显的，一般可使根定殖真菌的群体数量减少33%63%8。因此我们似乎可以这样认为，有效的根部定殖和生态位竞争优势作为PGPR的一个重要作用机制，正是与其他根际细菌相比，PGPR较快的生长速率46h/代为它在根上的定殖提供了竞争上的优势。PGPR沿根迁移和占据根表某

11、些位点的能力是影响“生态位排除的决定性因素。由于PGPR细胞能够沿根迁移或被根尖所携带，因而在其他细菌和真菌远未到达某一位点之前，PGPR细胞在该位点上可能已经生长和定居了好长时间，利用根的分泌物质，不断繁殖形成较大的种群，从而排斥其他有害的根际微生物的定殖扩展，减少它们对植物的有害影响9-11。3 PGPR定殖研究PGPR的定殖不仅已成为揭示其在植物根际的微生态学特征，提高其根际适应性和生防效果稳定性的必不可少的研究容，而且也是揭示PGPR作用机制的重要组成局部，因为有效的根部定殖和生态位竞争优势正是PGPR的作用机制的一个重要方面，同时，能否有效地定殖更是PGPR防病促生其他机制发挥作用的

12、前提12。3.1 PGPR的定殖部位根部定殖位点因接种量和生长期而异，也因同一植物的不同部位或不同外表状况而异，并且定殖细菌在植物体能转移。元等13用激光共聚焦扫描显微镜和电子显微镜观察了用绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62在玉米根部的定殖，发现多数都是定殖在根面，能够进入根的很少。友国等14在大豆盆栽系统中，费氏中华根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)HN01DL接种量对应的早期根圈定殖动态和水平有明显差异，但随着寄主植物根系的生长其差异逐渐减小，整个定殖动态曲线的变化和定殖密度趋向一致。所以种子外表接种根瘤菌在

13、大豆根圈中的较高定殖水平是竞争和结瘤的根底，但增大种子外表初始接种量并不是提高结瘤数量和占瘤率的一条理想途径。胡小加等15采用基因标记技术和常规方法跟踪巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)A6(gusA)菌株在缩影系统油菜根际的定殖情况。发现A6(gusA)在油菜不同根段部位的定殖密度表现从上到下逐渐递减的现象，明确接种菌在根层的上部区域定殖，很难随着根生长向下移动并繁殖，而根的功能活跃区恰恰在根冠区域。杜立新等16对拮抗枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-208和BS-209菌株在番茄叶面和土壤中的定殖情况进展了研究，发现在番茄叶面分布不均匀，大多定殖于

14、伤口周围、叶面的凹陷处和绒毛的根部。并且都能够在自然土和灭菌土中定殖，自然土中的菌量低于在灭菌土中的菌量。龙良鲲等17本文对生细菌012144进展抗药性标记，并借助其标记菌株012144k初步探明，一定浓度的012144菌液对番茄浸种或直接灌根处理，均可使其定殖于番茄根茎之，尤其在根能较稳定的定殖，其在根定殖能力明显强于茎，而在茎下部定殖力又强于茎上部。晓斌等18在对黄瓜PGPR菌株根部定殖的扫描电镜研究时发现：根部定殖具有宏观不均匀性，只在根面的少局部能够定殖，即存在有利于PGPR生长繁殖的生态位点,它们往往是表皮细胞间隙或裂缝处、以与侧根、根毛或其它突起物基部或发生处。从根基部、根中部、根

15、尖不同根短看，根基部种群密度最高，根中部根段次之，根尖最低，显现一个急剧下降的梯度。忠梅等18用链霉素和利福平抗性标记蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)B946菌株，叶部接种，能在小麦接种叶定殖，并能向茎基部、其他叶和根转移；浸种处理，该菌也能向茎基部和叶转移；菌悬液浓度、浸种时间和栽培温度都影响B946在小麦体的定殖转移。据推测,运动性在根部定殖中的作用可能是菌株通过运动到达富含根分泌营养成分的部位19-20。为研究鞭毛在根部定殖中所起的作用是否建立在趋化性运动的根底上，生防菌P.fluorescens WCS365、P.fluorescens OE28.3、P.fluoresce

16、ns SBW25和P.fluorescens F113的趋化基因cheA突变株与失去运动能力的突变菌株一样在番茄根尖的竞争定殖能力降低10-1000倍，明确趋化性运动在根部定殖中也发挥了重要作用21。脂多糖在定殖中的作用：在许多植物与细菌的相互作用中，胞外多糖起着重要作用，它参与细菌粘附到根表秒和在根部定殖的过程22。除此之外，NADH脱氢酶、位点特异性重组酶等与根部定殖也表现出一定的关系。碳源、氮源 假单胞菌编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf突变体PCL1083在葡萄糖、果糖、蔗糖和木糖中生长受损，但是该突变体在番茄根尖能够与野生菌株竞争定殖，明确对分泌糖的利用在根际定殖中并不占有重要地位2

17、3。柠檬酸、苹果酸、乳酸和琥珀酸是根分泌物中主要的有机酸,WCS365突变菌株PCL1085的突变位点位于编码苹果酸脱氢酶单基因mdh操纵子的上游, 该突变株在苹果酸和琥珀酸中生长较差,在柠檬酸中生长适中,在番茄根尖定殖较差甚至被野生菌株完全取代,说明番茄根系分泌的有机酸是假单胞菌能够在其根部定殖的营养根底24。维生素早在1961年就报道,维生素存在于10种被测试的植物根分泌物中,数量足以影响根际微生物的生长。水溶性维生素H、维生素B1和核黄素可以促进菌株在根际的生长25。Smith等26在用Bacilluscereus UW85进展生物防治时，首次证实了有关植物与抑制病害的细菌相互作用的遗传

18、学根底；即使是定殖在根际的PGPR在促进植物生长时可能也是受植物影响的。Smith和Goodman27证明，植物的健康状况与其所携带的微生物区系十分密切；同时也证实了植物基因型对其所具有的微生物群落的影响。所以，改善植物与PGPR之间的关系，是提高PGPR根际定殖的有效措施。van Elsas等田间实验明确，在一样的气候条件下，一种遗传改造过的荧光假单胞杆菌，在质地较好的粘土中的种群数量比在劣质的沙土中的高得多。土壤孔隙的构成不仅影响短期种群数量变化，还会影响长时期的群落变化。在土壤孔隙大小分布不同的粉砂和壤质砂粒中引入Pseudomonasfluorescens，接种3年的监测结果明确，细菌

19、种群数量在粉砂壤土中的下降趋势较为缓慢28。温度是影响微生物生长和代最重要的环境因素。微生物生长需要一定的温度，温度超过最低和最高限度时，即停止生长或死亡29。据研究，引入微生物在植物根围的定殖数量随土壤温度的升高而减少，可能的原因是植物本身，其次是根围微生物。植物在较低温度条件下，生长缓慢，从而为根围微生物提供更有效的占领机会；其次，土著微生物包括病原生物通常习惯于它们存活于根表根围的温度，一旦温度降低，它们的活动受到影响,从而有利于引入的微生物在根围的定殖活动30。因此，适当的降低土壤温度，能够提高PGPR的定殖数量。水是微生物细胞生命活动的根本条件之一。水分对微生物的影响不仅取决于它的含

20、量，更取决于水的有效性。水分有效性用水的活度aw表示。纯水的水活度为1.00，土壤中水活度为0.90-1.00。不同环境水活度不同，微生物对其适宜性差异很大。如果溶液中溶质浓度过高盐碱土壤，渗透压过大，水活度很小，对于微生物失去了可给性，甚至使细胞脱水，造成生理枯燥，引起质壁别离，细胞停止生命活动31。因此，土壤水分状况不仅可以影响到植物的生长，而且对土壤有益微生物的生长也起到至关重要的影响。在PGPR定殖时要提供适宜的水分状况，以便高效率定殖。3.2.2.4土壤pH、Eh土壤pH 32。在PGPR定殖前，对其最适pH进展确定，然后调节土壤pH到这一水平，这有利于PGPR的定殖，同时，也可以起

21、到控制土壤中土著微生物的竞争能力。4 PGPR定殖状况的检测方法PGPR的定殖情况是保证这些微生物发挥预期作用的首要前提。现已报道的检测方法主要有:DNA和RNA探针技术、免疫学方法、抗生素标记、外源基因标记33。4.1 核酸探针法特异的DNA或RNA序列作为核酸探针检测根围微生物，探针与土壤或植物样品中的DNA杂交，可以检测根围特定微生物的与探针相匹配的DNA。DNA探针法具有较高灵敏度，不但可以检测活的细胞，还可以检测死的细胞，直接检测能够可培养和不可培养的细胞。DNA探针的应用有两种途径:菌落杂交法:探针与生长在培养基上的菌落的DNA杂交34；直接检测法:探针与从土壤中或植物样品中提取的

22、DNA杂交。探针可以建立在整个染色体DNA上；1个克隆载体上特殊的插入片段；整个质粒DNA;16s rRNA序列的一局部或其它特殊的寡核苷酸序列上。探针的大小和类型取决于它在检测环境中的特异性35。4.2 免疫学方法外源基因能产生新的细胞外膜蛋白，可以用相应的抗体去检测，抗体与目标细菌细胞外膜的抗原成分结合，发生特异性反响，以此同其它微生物相区别。荧光标记免疫反响结合流式细胞光度技术，可以提高检测方法的专一性和灵敏度；另外，也可以用酶联免疫吸附法(ELISA)、Western印迹法，将细菌细胞转移到硝酸纤维素滤膜上，再进展免疫荧光细胞染色(Immuno fluorescent Colony S

23、taining IFCS)36。细胞外膜上抗体与抗原结合,可在光学显微镜和电子显微镜下对免疫荧光阳性细胞计数，也可以测定ELISA的吸光值。细菌细胞也可以发生免疫反响，比如:在带有lacZY基因标记的微生物中，抗体与细胞的半乳糖苷酶结合，这可用透射电子显微镜观察。 免疫学检测技术对革兰氏阴性和阳性菌均适用，可进展原位观察，而且能定量统计是免疫学检测方法的最大优点，并且无论是死细胞或活细胞、可培养的或不可培养的细胞均能检测到。但是免疫学方法并不能展示土壤中特种生物群体的存活力与生理活性，而且技术要求高，费用高、操作复杂，有一定的局限性，标记基因应运而生，并逐渐显示出其应用潜力。4.3 标记基因法

24、基因标记是指将外源DNA引入受体菌株，经表达以后，受体菌株细胞能够在环境中与其他微生物相区别。标记基因分为两种:选择基因和报告基因。选择基因是担负富集转化细胞的作用，而报告基因如此是用于易于检测表达产物，是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，利用外源DNA的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体37。4.3.1 抗生素抗性标记利用微生物对抗生素的抗性，采用抗生素选择性培养计数是检测引入微生物在根际定殖的传统检测方法38。可通过物理或化学诱变筛选抗某种抗生素的突变体，最常用的是利用外源基因标记微生物使其获得抗生素抗性。常用的主要包括利福平、卡那霉素、氯霉素和潮霉素等抗生素基因。抗生素抗

25、性作为检测标记具有简单、快速、费用低、实验结果可以进展统计分析等优点。但是由于土著微生物会产生不同程度的天然抗性，对回收的目标菌数量有影响。所以抗生素抗性常常须与其他报告基因联合检测、跟踪标记微生物。4.3.2 报告基因标记-半乳糖苷酶基因lacZp一半乳糖苷酶基因(lacZ)是第一个采用的非抗性标记基因。lacZY基因编码-半乳糖苷酶和乳糖渗透酶，可利用乳糖，裂解x一galA一4一溴一3一吲哚半乳糖或其它合成半乳糖，形成蓝色菌落39。由于常见的微生物多有半乳糖苷酶的本底活性，使其应用受到一定影响。与lacZ基因存在相似问题的还有碱性磷酸酶基因phoA)和邻苯二酚2，3一双加氧酶基因(xylE

26、)。-葡糖苷酸酶(GUS)GUS活性检测在微生物中十分方便。GUS酶很稳定，耐多种洗涤剂和各种离子浓度，作用时不需要辅酶，无任何离子要求，最适pH值为5.0-8.0，因而可在各种生理条件下进展分析，且有一定的热稳定性(55下半衰期约2小时)，由于此法简单、方便、灵敏，GUS基因被广泛用于土壤微生态学研究中。Yates等(1997)用GUS标记玉米生真菌F.moniliform，分析了其在玉米体的活性。Green(1995)等用GUS基因标记生防木霉研究其在作物根际、体表的定殖分布并测得作物不同发育期菌丝的活性。王平等40利用GUS基因标记的华癸根瘤菌发现其不但可以在水稻、小麦、油菜和棉花4种非

27、豆科作物的根围，而且还能进入根。另外，GUS基因的一局部(3端)与其他结构基因所产生的嵌和基因可以正常表达，所产生的融合蛋白仍有GUS酶活性，这一点是其它报告基因所不与的。生物发光酶基因(luc、Lux)发光酶(luciferase)是生物体催化发光反响的酶，能够催化底物并最终发射荧光的一类酶家族。依其作用机制可分为两种:一种是萤火虫发光酶luc，它催化发光反响的机理是通过催化ATP至底物萤火虫荧光素(D一luciferin)之间能量的转移产生光能。另一种是细菌发光酶lux，它催化的反响包括长链脂肪醛和FMNH2的氧化并产生蓝绿色的光。lux作为标记基因因具有灵敏和线性围宽；检测快速、简便、灵

28、敏；在非发光生物体中无本底荧光酶活性；价廉；对细胞一般无害；光不扩散也不在原位聚集，基因表达可在菌落进展高分辩率的空间定位41-42，而在环境微生物的检测中备受青睐。健等43通过三亲本杂交的方法成功将1uxAB基因导入根际促生菌巨大芽抱杆菌ATCC14581，所获得的标记菌株在不同条件下稳定发光，并利用土壤微缩影系统进一步研究了其在小麦根际的定殖动态和散布规律。何琳燕44应用luxAB标记硅酸盐细菌NBT，获得了与野生型菌株一样解钾能力的转化菌株，并将其成功用于在辣椒根部定殖的研究。绿色荧光蛋白(GFP)基因来自海洋多管水母的绿色荧光蛋白(GFP)是近年来出现的一种革命性的标记分子，它独具的分

29、子结构、简单的发光机理、稳定的化学性质、在多种活体细胞表达无毒性和检测方便且灵敏度高等优点使它在标记基因中脱颖而出。在微生物的生态学研究中，GFP可进展原位、实时跟踪监测目标微生物在环境中的生长繁殖、定殖、分布与与其他微生物或植物的互作关系，因此，GFP被认为是当前用于分子生态技术中最理想的报告基因。GFP所具有的特性使其在研究自然环境如突土壤、水体、植物根际、活性污泥、生物膜和复杂的微生物群落中的微生物分布、定殖具有极大的潜力。GFP标记基因可用于研究微生物在环境介质中的迁移。GFP标记菌能够通过紫外灯箱、荧光计、荧光分光光度计、荧光激活细胞分类器(FACS)、荧光显微镜和共聚焦激光显微镜，

30、其中用的最多的是荧光显微镜和共聚焦激光显微镜(laser scanning confocal microscope)。小结PGPR在根际的定殖状况，因PGPR的物种类型、植物种类、土壤环境状况等外界因素的不同，差异比拟大，但是，总体来说，PGPR在根际定殖位置的一般是根基部高于根中部，根中部高于根尖，呈现逐渐递减的趋势。而且对PGPR适宜生长的环境因素进展控制，保证良好的定殖环境也是限制PGPR在根际定殖状况的重要因素。参考文献：1K loepper JW ,Schroth M N.1981. Relationship of in vitro antibiosis of plant growt

31、h promoting rhizobacteria to plant growth and the displacement of root microflora Phytopathology,71:1020-1024.2Scher FM,Baker R .1982 .Effect of Pseudomonas putida and a synthetic iron chelator on induction of soil suppressiveness to Fusarium wilt pathogens.Phytopathology,72:1567-1573.3年洪娟，丽梅.土壤有益细菌

32、在植物根际竞争定殖的影响因素.生态学杂志，2010,296：1235-1239.4晓斌，炳欣.PGPR机制研究的进展.2000.5Raupach-GS;Kolepper JW Mixtures of plant growth-promoting rhizobacteria enhance biological control ofmultiple Cucumber pathogensJ 1998(11)6兴都，王卫卫，郭利伟，等.大豆根际土壤中氢氧化细菌的别离、筛选和根本特征J.应用生态学报，20079.7胡江春，薛德林，马成新，等.植物根际促生菌PGPR的研究与应用前景J.应用生态学报，2004，1510：1963-1966.8Suslow TV,Schroth MN.Rhizobacteria of sugarbeets:Ef