黄芩蛋白的分离与表征.docx

1、黄芩蛋白的分离与表征黄芩蛋白的分离与表征中文摘要黄芩作为我国传统中药药材之一，具有广泛的药理作用。黄芩活性成分已被广泛研究，但较少涉及黄芩蛋白。本课题研究对黄芩的蛋白质成分进行了分离，得到了两个电泳纯的蛋白质组分，并分别对其进行了表征。经过硫酸铵分级沉淀和多步离子交换层析后，从黄芩抽提液得到了一个纯的蛋白组分，命名为Pro-1。该蛋白属于糖蛋白，糖含量达14%，单链，分子内部存在一定的键内二硫键，蛋白分子量为62.23kDa，N端前8个氨基酸残基为GSAVGFLY。Pro-1具有凝集素活性，其凝集能力具有选择性。对Pro-1蛋白性质表征的结果显示，其凝集素活性的pH稳定范围大，在pH4.0-1

2、0.0范围内，凝集活性不受影响；凝集素活性热稳定性较差，高于60，凝集活性降低明显；Pro-1是一种金属依赖型凝集素；Pro-1凝集素对番茄尖孢镰刀菌和水葫芦链格孢菌有明显的抑制作用，但对大肠杆菌及葡萄球菌没有抑制能力；Pro-1能明显促进正常肝细胞L02增殖，但对MDCK的增殖作用不明显；Pro-1蛋白对肝癌细胞HepG2的生长具有明显的抑制作用，最大抑制率达83.43%。在Pro-1的分离过程中，通过离子交换层析，还纯化得到了另一个电泳纯的蛋白质组分，命名为Pro-2。Pro-2为单链蛋白，分子内部有键内二硫键，分子量为33.8 kDa，糖含量为16.2%。Pro-2中丝氨酸含量最高，含量

3、为14.6%，酪氨酸和胱氨酸含量都很低。Pro-2蛋白对正常肝细胞L02的生长具有促进作用，对正常狗肾上皮细胞MDCK毒性较大，具有轻微抑制肝癌细胞HepG2作用。关键词：黄芩蛋白，凝集活性，抗真菌，增殖作用，抑制作用Isolation and characterization of the Scutellaria baicalensis proteinAbstractScutellaria baicalensis herbs with a wide range of pharmacological effects，are one of traditional Chinese medicine

4、 in China.The active ingredients of scutellaria baicalensis have been extensively studied, but the scutellaria baicalensis proteins involved relatively few studies. This paper studied the separation of scutellaria baicalensis proteins and obtained two-dimensional pure protein components and respecti

5、vely characterized the two pure proteins.Through the ammonium sulfate fractionation and more than one step ion exchange chromatography，a pure protein was obtained from the extraction of scutellaria baicalensis.The protein was referred to as Pro-1 protein. The protein was a kind of glycoprotein with

6、sugar content of 14%, single-chain protein, intrachain disulfide in molecular structure and molecular weight of 62.23kDa. Eight amino acid residues of Pro-1 protein N-terminal were GSAVGFLY. Pro-1 had lectin activity, and its ability to agglutinate was selective. By characterizing the Pro-1 protein,

7、 the results were showed. The lectin protein Pro-1 were stable in a wide range of pH which were from 4.0 to 10.0, and its agglutination activity was unaffected. The lectin activity of Pro-1 protein had poor thermal stability.When the temperature was over 60 degrees celsius, the hemagglutinating acti

8、vity decreased significantly. The Pro-1 protein was a metal-dependent type lectin. Pro-1 protein significantly inhibited tomato Fusarium oxysporum and Water hyacinth tenuis. It did not inhibit the E. coli and Staphylococcus. But it has no obvious promotion of MDCK proliferation.It obviously promoted

9、 the proliferation of normal liver cells L02 , but it was not obvious on the MDCK proliferation. Pro-1 protein significantly inhibited the growth of HepG2 cells with maximal inhibition rate of 83.43%.In the process of separation of Pro-1 protein，another protein were obtained by ion exchange chromato

10、graphy. This protein was referred to as Pro-2 protein.The protein with sugar content of 14% was a kind of single-chain protein with the intrachain disulfide in molecular structure and molecular weight of 33.8kDa. The serine was the highest amino acids in the purified protein, the content of which wa

11、s 14.6%.The content of tyrosine and cystine were very low. Pro-2 protein could promote the growth of L02 (normal liver cells) and was very toxicant for MDCK (normal canine kidney epithelial cells) and had slightly inhibited HepG2 cells.Keywords: Scutellaria baicalensis proteins，agglutination activit

12、y, antifungal, proliferation, inhibition 第一章 引言1.1中药黄芩概述1.1.1中药黄芩简介黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）属唇形科植物，多年生草本，总状花序顶生，花偏生于花序一侧，花冠二唇形，紫红色至蓝紫色（如图1-1）。黄芩主根粗壮，圆锥形，有茎痕或残存茎基，表面棕黄色，质硬而脆，断面黄色，中间红棕色（如图1-2）。老根中央呈棕黑色，枯朽状或为空洞，习称“枯芩”；根色鲜黄，内部充实的小黄芩（生长不足4年者）及新根（子根）称为“子芩”（条芩）。黄芩的根可以入药，是我国著名的传统中药，在我国有多年的使用历史。图1-1

13、 图1-2黄芩作为药材始记于东汉神农本草经，随后在历代本草中及历版中国药典均有收录。黄芩性寒、味苦，清热燥湿、泻火解毒、止血安胎，可清肺火，药理作用广泛，具有悠久的研究历史和使用历史。在治疗热病时，矫正黄芩过偏之性有不同的配伍，发挥更强大治疗功效。“葛根黄芩黄连汤”，黄芩为臣药，有清热燥湿作用；“黄芩-半夏”，二药参合，温寒相伴，调和阴阳，有泻火解毒功能。黄芩药理功能是国内外研究的热点之一，不仅按传统药效方面进行研究，还对单一成分的抗病机理进行研究。黄芩中涉及黄芩中属于黄酮类且含量较高的化合物的研究较多，不仅涉及化合物的分离、结构表征、活性研究，且有一定临床应用研究，系统性较强。但黄芩的其他成

14、分的研究不多见。黄芩生态适应能力较强，喜欢温暖而稍寒冷的气候，大多生长在向阳山坡和山顶草地等地，都以散生为主。历代本草记载显示黄芩没有特定的产地，主要分布在湖北、陕西、甘肃、辽宁、内蒙古等地1,。近年，随着黄芩需求量的增加和野生资源的枯竭，引种黄芩的规模不断在扩大，人工栽培黄芩已成为黄芩药材的主要来源。中国植物志记载我国黄芩属植物有102种，其中黄芩亚属(Subg.Scuteiiaria)的植物有99种。除了正品黄芩Scutellaria baicalensis Georgi作为药物外，同属其它种植物的根也可入药，如粘毛黄芩、滇黄芩、大黄芩等。其它种黄芩属药材与Scutellaria baic

15、alensis Georgi黄芩有相似的药效，但药效比正品黄芩低。1.1.2中药黄芩化学成分黄芩中含有的主要成分为黄酮类化合物，包含黄芩苷( baicalin)、黄芩素( baicalein)、汉黄芩苷( wogonoside)、汉黄芩素(wogonin)、黄芩新素等。此外还有甾醇类化合物和蛋白质（如已报道的黄芩酶，可促进黄芩甙和汉黄芩甙水解成黄芩黄索和汉黄芩黄）和糖类（黄芩细淀粉）等生物大分子。1.1.2.1黄酮类化合物（flavonoids）黄酮类化合物是一类存在于自然界，具有2-苯基色原酮（flavone）结构的化合物。目前，已从黄芩中发现并分离出41种黄酮类化合物。黄酮类被认为是黄芩的

16、主要有效化学成分，主要包含黄芩苷( baicalin)、黄芩素( baicalein)、汉黄芩苷( wogonoside)、汉黄芩素(wogonin)等6-，药理作用明显。黄芩苷是黄芩中含量较高的黄酮类化合物，又名黄芩甙(baicalin，分子结构式C21H18O11，化学结构如图1-3-A所示)，纯品呈淡黄色结晶粉末。黄芩苷作为黄芩中的有效成分之一，是黄芩及其制剂的主要质量控制指标成分。黄芩苷药理作用广泛，其降压、镇静、保肝、抗菌、抗肺炎衣原体、护大脑- 和保护心脏的缺血及灌注损伤的保护等活性在已有研究中均有报道。正品黄芩Scutellaria baicalensis Georgi黄芩苷的含

17、量最高可以达到6.2%，黄芩苷在黄芩植株根、花、叶、茎等器官中均有分布，但在各器官中的含量之间具有显著性差异。图1-3四种黄酮类化合物结构图黄芩素又名黄芩苷元，黄芩黄素(baicalein，C15H10O5化学结构如图1-3-B所示)，是黄芩根中的主要有效成分，在生药中占其含量的 5.41%。黄芩药品保存不当下易变成绿色，主要的原因是黄芩素结构中有3个邻位酚羟基，羟基性质不稳定，容易被氧化成醌类衍生物而显绿色。汉黄芩苷又名汉黄芩甙(wogonoside，C22H20O11化学结构如图1-3-C所示)，黄色结晶，熔点不明显，几乎不溶于水或常见有机溶剂。其具有一定的药理作用，使它成为黄芩特有药效成

18、分之一。汉黄芩素又名汉黄芩黄质（wogonin，C16H12O5化学结构如图1-3-D所示），黄色针状结晶，具有广泛的生物活性，是国内外研究的热点。汉黄芩素在免疫、抗肿瘤细胞、抗菌等研究越来越引起重视。黄芩中含有的其他黄酮类成分，因为含量比较低，研究相对较少。1.1.2.2其他成分除黄酮类化合物外，黄芩中还含有萜类成分,，包括二萜苷类、倍半木脂素苷类、三萜类；丰富的微量元素，铁、铜、锌、锰、镉、铅等。黄芩中低含量的铅和镉，导致了黄芩低毒性质。此外，还含有-谷甾醇、p-谷甾醇、苯甲酸、苯甲酸、黄芩粗多糖、14种氨基酸（脯氨酸proline含量最高）、蛋白质、挥发油类，如异戊二烯、 乙酰苯、 薄荷

19、酮等成分等。1.1.3黄芩成分研究中涉及的提取方法1.1.3.1水提法水抽提多见与黄芩黄酮类成分的分离表征等研究。该方法简单方便、环保，但是提取率比较低，分离困难。因为水是一种强的极性溶剂，植物中的亲水成分，如无机盐、有机酸盐、生物碱盐及多糖类、糖类、氨基酸、蛋白质等都易溶于水中导致后续分离麻烦。目前相关研究中为了提高总黄酮的得率，很少单一使用水抽提，很多是改进后再采用。1.1.3.2微波提取法微波提取是利用超高频率的快速震动产生的微波电磁场，导致被提取的极性分子快速转向及定向排列，产生相互碰撞、挤压、摩擦引起发热，利于有效成分的溶出和释放。该方法是一种新技术，有提取率高、操作简单、副产物少及

20、产物易提纯等特点。1.1.3.3超声提取法超声提取原理是利用超声能产生空化效应，导致黄芩植物组织细胞中在溶剂中发生破裂，有利溶剂穿透细胞膜渗进植物细胞内部，助于黄酮类化合物的释放与溶出。该方法具有设备简单方便、提取效率高、无需加热、提取时间短等特点。此外，针对胞内产物提取，可以选择酶解法对植物细胞壁进行破壁，该方法提取率高，效果好；根据黄酮类化合物与杂质极性不同来选择适合的有机溶剂进行有机溶剂提取，常用乙酸乙酯、丙酮、乙醇等有机溶剂；根据体系中分子的大小和性状，利用膜的筛选作用在分子水平上进行分离提取黄酮类化合物的超滤法。超临界流体萃取法、双水相萃取分离法、水浴回流提取法等方法在黄酮类化合物的

21、提取上均有采用。1.1.3.4黄芩中黄酮类成分含量测定方法黄芩中黄酮类成分含量测定可用的方法有红外光谱法、薄层扫描法、脉冲极谱法、导数光谱、二阶导数差示脉冲极谱法和高效液相色谱法等。目前采用的主要方法是高效液相色谱法。徐纪文等采用反相高效液相色谱法测定黄芩中叶、茎、茎皮、根、根皮、须根、须根皮中黄芩苷的含量，结果显示，同一采收期不同部位黄芩苷含量在根及根皮、须根及须根皮的含量较高，而同一部位中黄芩苷的含量在皮层的含量较高，与中国药典规定药用部位基本一致。1.1.4中药黄芩的研究进展对国内外主要期刊中有关黄芩的文献进行综述和比较分析，结果显示近年来国内外对黄芩研究仍然处于持续升温的趋势，发表相关

22、论文近百篇。能达到这种研究热度的中药并不多见，黄芩受到的关注应归因于其具备的重要生理功能。黄芩作为我国传统中药药材之一，具有广泛的药理作用：传统药理作用中有清热泻火、解毒、止血、安胎等；现代药理研究进一步证实，黄芩还具有抗氧化、清除自由基作用、抗肿瘤作用、抗菌抗病毒、抗炎抗过敏作用和对中枢神经系统的保护等生物学效应。因为其广泛的药理作用，黄芩在临床上有着重要应用价值，并不断引起国内外广泛研究者的重视，持续推动黄芩的各项研究。1.1.4.1安胎作用黄芩作为当今常用安胎药之一，是经过长期临床应用筛选，并通过现代药理实验研究证实的结果。黄芩及成分黄芩苷和黄芩素可调节Th1/Th2细胞因子，提高孕酮的

23、含量，提高免疫功能 -。黄芩苷、黄芩素等成分可以通过不同环节起到抗血小板聚集及抗凝作用，稳定升高孕激素水平，抑制子宫平滑肌收缩。黄芩的黄酮类成分通过在免疫、内分泌、子宫影响等方面多重调节、互相结合发挥保胎作用。1.1.4.2抗氧化、清除自由基作用黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素4种黄酮成分，具有清除自由基能力，抑制不同体系诱导的线粒体氧化损伤。研究证明黄芩素BAI具有较强的清除氢过氧化物酶、超氧化物阴离子等氧自由基能力，是高效的抗氧化剂-；黄芩苷还具有增强红细胞超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)的活性作用，提高消除DPPH自由基活性的速度，阻断恶性循环

24、；在不同溶液体系中，黄芩苷金属配合物，可加强生物利用度及抗氧化活性，生物学功能大于单纯的黄芩苷。1.1.4.3抗肿瘤作用黄芩及其化合物黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷等具有一定的抗肿瘤作用-。黄芩苷能够诱导Hep-A-22 肿瘤组织细胞、前列腺癌细胞 DU145、黑色素瘤A375细胞、肝癌HepG-2细胞-等癌细胞凋亡。黄芩素能够诱导人肝癌细胞株和膀胱癌细胞链凋亡，抑制癌细胞的增殖41-，且抗增殖活性存在量效依赖关系。目前仅从免疫、酶活性、对瘤细胞的抑制等方面进行探讨研究，筛选黄酮类成分中抗癌活性成分，但活性成分的抗癌作用的具体诱导机制还需进一步研究，结合其他成分一起深入研究。1.1.4.4抗菌抗病毒

25、国内外实验研究表明黄芩有较广抗菌范围，对多种革兰染色阳性菌、革兰染色阴性菌及螺旋体、葡菌、绿脓杆菌、白念珠菌、大肠杆菌等有不同程度的抑菌作用-。BAI是黄芩中抗菌的最有效成分，研究最多。研究表明黄芩苷也有抗菌作用，具有一定的抗白念珠菌作用，可能通过抑制白念珠菌的DNA、 RNA和蛋白质的生物合成导致菌细胞死亡47。黄芩还具有广谱的抗病毒作用-。近来的研究结果表明黄芩苷、黄芩素可抗人类免疫缺陷病毒 (H-I-V)的作用，能诱导感染 H-I-V的细胞发生凋亡；对流感病毒、呼吸系统综合征病毒(PRRS)等多种病毒有一定的抵抗作用。1.1.4.5抗炎抗过敏作用黄芩抗炎作用与抑制炎性介质的生成和释放有关

26、，黄芩素、黄芩苷、黄芩黄素等能调节花生四烯酸代谢，显著影响白细胞的多种功能，并而抑制大鼠膜肥大细胞释放组胺 (HA)-。黄芩素和黄芩苷抗炎作用最强，存在量效关系。黄芩苷的抗过敏作用主要是通过破坏肥大细胞的酶激活系统(SH.酶)，即抑制巯氢基酶的活化，防止肥大(嗜酸性) 细胞脱颗粒以及组织胺、5-羟色胺等过敏介质的释放以及对平滑肌的直接松弛作用，同时降低毛细血管通透性的作用，从而实现抗过敏作用。1.1.4.6保肝、降压作用研究表明黄芩素是一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，可治疗肝炎。黄芩苷能增加肝细胞抗损伤能力，提高膜结构的稳定性，减轻肝细胞的凋亡与坏死，一定程度保护肝功能。血管紧张素作用通过12-LO实

27、现，研究发现黄芩素是LO的特异性抑制剂，有拮抗血管紧张索引起的血压升高作用。1.1.4.7改善糖尿病肾病作用糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetes) 引起的最常见的微血管并发症之一，始动因素是高血糖通过肌体内的一系列过程可引起肌体内部氧化应激和炎症反应，最终导致糖尿病肾病。实验证实，黄芩苷影响凋亡基因Bax和Bcl-2表达，具有抑制糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡。1.1.4.8保护中枢神经系统的作用黄芩中黄芩苷具有降低大鼠大脑动脉栓塞模型（MCAO）的神经功能缺损功能，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等含量，从而提高抗氧化能力，减少氧化

28、损伤保护脑组织。1.1.4.9抗凝血和抗血栓形成作用黄芩素可抑制凝血酶诱导的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，抑制花生四烯酸诱导的血小板聚集，形成降低Ca2 +的升高机制起到抗凝血和抗血栓作用。黄芩素已成为国内外治疗动脉硬化和抗血栓形成的药物研究热门之一。1.1.4.10 其他作用黄芩除了具有上述功能外，还具有其他多种功能，如解热作用、抑制胰酶活性、脑损伤的修复保护作用、降低血脂等作用，黄芩还有保护神经元细胞、防辐射等功能。可见，目前对黄芩活性成分的研究大多集中在黄酮类成分上，相关研究比较多，但黄芩中含有的大分子化合物的相关研究比较少。为黄芩的开发开辟更广阔的前景，有必要开展黄芩活性成分的综合研究。1

29、.2中药蛋白研究在药物筛选的研究流水线上，中草药已经成为一个天然药物分子的资源库，给开发新型药物成分提供了极大的便利和参考。中草药不仅是一个天然小分子化合物的资源库，同样也是一个巨大的的蛋白和肽的天然资源库。对中草药蛋白成分的研究不但能为植物的生理现象提供解释，也能为蛋白质药物的研发提供更多的研究模型和候选分子。近年来，研究证实植物类中药来源的蛋白具有各种各样的生物活性，包括抗肿瘤、抗病毒、抗菌等，分别叙述如下：1.2.1抗肿瘤活性中药桑寄生的蛋白组分中，有一类碱性糖蛋白。它的相对分子量在31kDa和33kDa 左右，它能通过特异性抑制肝肿瘤细胞el-7402生长而造成el-7402细胞的凋亡

30、。人参中可检测的蛋白质种类达到300多种，其中水溶性蛋白显示了较好的抗肿瘤活性：人参水溶性总蛋白能够诱导人喉癌细胞Hep-2及非洲绿猴肾细胞Ver凋亡，高浓度的水溶性蛋白组分对小鼠成纤维细胞L929具有抑制作用。通过细胞调控因子活性的测定发现一种来源于鹿茸的，分子量达10kDa的类胶原蛋白具有促肿瘤细胞分化因子的作用，表现出一定的抗肿瘤作用。龙葵含有一种分子量为150kDa的糖蛋白，它可通过激活caspase超家族级联反应，促进NO的释放等多种途径来诱导肿瘤细胞的调亡，抑制肿瘤细胞生长而达到抗肿瘤作用。相思子毒素(abrin)是一种分子量在6065kDa 左右高分子糖蛋白毒素，毒性猛烈，却显示

31、出较好的抗肿瘤活性。它对L1210白血病、小鼠艾氏腹水瘤细胞、B16 黑色素瘤和Lew-is肺癌等均有诱导肿瘤细胞凋亡作用从而达到明显的抗肿瘤作用。葫芦科植物中提取的毒蛋白-天花粉蛋白(TCS)，是一种含有247 个氨基酸的单链碱性蛋白质，有较好的抗肿瘤活性，能够诱导胃癌细胞株MKN45、白血病细胞株HL60和黑色素瘤细胞凋亡。此外，相关研究还显示了蓖麻毒素、芦荟蛋白等中药蛋白具有抗肿瘤活性。1.2.2抗病毒活性GP4是一种从人参中分离的热核糖核酸酶，分子量约为64kDa，含27kDa和29kDa两个亚基，研究显示GP4具有明显的抗病毒活性。苦瓜蛋白MAP30，具有抑制HIV-1整合酶活性、N

32、糖苷酶活性等作用，特异地作用于病毒DNA，影响其复制与表达，发挥抗HIV病毒作用。此外，天花粉蛋白、丝瓜毒素、肥皂草毒素、老鼠拖瓜粗蛋白大、叶木鳖子粗蛋白等中药蛋白均有显著抑制HIV增殖的作用。1.2.3抗菌活性黄芪中分离出一个带有亚基分子，分子量为61.1kDa糖蛋白，在天然状态下以同源二聚体的形式存在。该糖蛋白经鉴定为凝集素，具有明显的抗真菌活性，特别对灰葡萄抱菌抑制效果最明显。此外，还有其他中药，如天麻和荨麻根等分离得到的凝集素蛋白，都有很强的抗真菌活性。望江南种子纯化得到的蛋白，是一种相对分子量约为28kDa单链，具有较好的抗真菌活性。1.2.4增强免疫调节功能白花蛇舌草分离纯化得到的糖蛋白，临床实验证明该活性蛋白通过刺激机体的免疫系统杀伤或吞噬肿瘤细胞，对小鼠和人起到免疫调节作用。白头翁糖蛋白、中药白附子糖蛋白、甘薯糖蛋白等对免疫调节系统中免疫细胞的分泌与释放均有一定的调节作用。芦