鼻气管鸟疫杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用.docx

1、鼻气管鸟疫杆菌SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用鼻气管鸟疫杆菌SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用摘要:【目的】建立一种鼻气管鸟疫杆菌SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，并应用于临床样品检测。【方法】参照鼻气管鸟疫杆菌（GenBank登录号：JF810495.1）基因序列设计1对特异性引物，经PCR扩增，回收214bp的目的片段，与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5中，提取重组质粒，经PCR、酶切及测序鉴定后，筛选阳性质粒，倍比稀释作为模板，用于SYBR Green荧光定量PCR标准曲线的构建，并做敏感性试验、重复性试验和

2、特异性试验。【结果】结果表明，标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，且标准曲线线性关系R2在0.999以上，产物Tm值在81.3-83.2之间，灵敏度为1.44102拷贝/L，特异性结果表明只能检测到鼻气管鸟疫杆菌的扩增曲线，重复性试验变异系数小于0.7%，临床样品检出率为100%。【结论】本试验初步建立了检测鼻气管鸟疫杆菌的SYBR Green荧光定量PCR方法，为该病的早期诊断以及感染程度的定量分析奠定了基础。关键词: 鼻气管鸟疫杆菌；SYBR Green I；实时荧光定量PCRDevelopment and application of SYBR Greenreal-time qu

3、antitative PCR technique for Ornithobacterium rhinotrachealeWANG Li-rong, DIAO You-xiang*, TANG Yi, JU Xiao-jun(College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Taian, Shandong, 271018, China)Abstract:【Objective】The objective of the study is to establish a method for detec

4、ting Ornithobacterium rhinotracheale by SYBR Green I fluorescence quantitative PCR detection method and to application in clinical samples detection. 【Method】A pair of specific primers was designed according to the Ornithobacterium rhinotracheale（GenBank login number: JF810495.1）gene sequence. The t

5、arget 214bp fragment was amplified in PCR gene amplification, and inserted into pMD18-T vector after being purified. Then the restructured vectors were transformed to E.coli DH5. Positive plasmid was extracted as template to establish SYBR-Green fluorescence quantitative PCR standard curve after PCR

6、 identifying, enzyme cutting and sequencing. Sensitivity, Reproducibility and specificity of the method were determined. 【Result】The results indicated that standard curve established by recombinant plasmid showed a good linear relationship between threshold cycle and template concentration. The stan

7、dard curve linear relationship was more than 0.99. The Tm was 81.3-83.2 and the sensitive degree is 1.44102 copies per L, Specific results showed that only amplification curve of Ornithobacterium rhinotracheale can be detectioned, repeatability test indicated the variation coefficient is less than 0

8、.7%; clinical sample detection rate was 100%. 【Conclusion】A SYBR Green fluorescent quantitative PCR assay for detecting Ornithobacterium rhinotracheale was developed for the basis of the early detection and quantitative analyzing of the Ornithobacterium rhinotracheale infection degree.Key words: Orn

9、ithobacterium rhinotracheale; SYBR-Green; Real-time Quantitative PCR0 引言【研究的目的意义】 鼻气管鸟疫杆菌( Ornithobacteriumr hinotrotracheale, ORT) 可引起鼻气管鸟疫杆菌病，是一种值得重视的新的禽呼吸道细菌病。ORT是一种无运动、多形性、不形成芽胞的革兰氏阴性短杆菌，具有化学气管趋向性和嗜常温的特性1-3，有18个血清型，其中以A 型最为常见4-5。在普通培养基上不生长，5%-10%CO2条件下，于5%绵羊血液琼脂37恒温培养，24h后可形成灰白色针尖大小不溶血的圆形菌落，48h后

10、可形成直径为1-3mm的灰色到灰白色奶酪状的圆形小菌落。临床上主要引起火鸡和鸡生长障碍、呼吸困难等。其剖检变化以严重的单侧或双侧纤维素性化脓性肺炎、坏死性肺炎、支气管炎、气囊炎等为特征，常继发并发病毒、细菌和真菌性感染，导致鸡群大量死亡6-7，危害很大。1981年德国学者从5周龄火鸡的呼吸道中最先分离到该细菌，1994年正式称为ORT8。1986年以色列首次报道该国存在ORT，随后荷兰、比利时9、美国10、德国11、法国、加拿大和日本相继报道检测到ORT抗体或分离到ORT。我国陈小玲12等分离出几株不知名的小杆菌，经生化试验、PCR和血清学鉴定，确认其中2株是鼻气管鸟疫杆菌。近年来，鼻气管鸟疫

11、杆菌病的发生呈上升的趋势，因此加强对鼻气管鸟疫杆菌的研究，建立快速有效的检测方法，对预防鼻气管鸟疫杆菌病的发生，保护和促进养禽业的发展具有重要意义。【前人研究进展】控制鼻气管鸟疫杆菌感染的有效措施之一是建立快速有效的检测方法，目前对于鼻气管鸟疫杆菌的检测已经有细菌分离鉴定13、血清学诊断方法、普通PCR14、间接ELISA、地高辛标记探针法15 等方法。鼻气管鸟疫杆菌是一种较难培养的细菌，细菌分离鉴定存在费时费力、易污染和准确率低等缺点，普通PCR方法操作简易、快速，适用于临床样品检测，但其敏感性较低。间接ELISA方法16操作简单，特异性、灵敏性较高，但存在干扰因素，血清特异性及交叉性影响结

12、果，需要多次检测17。地高辛标记探针法不需要特殊仪器设备，一次可以检测多个样品，适合临床检测。但是已建立的方法不能对鼻气管鸟疫杆菌进行定量检测。【本研究切入点】荧光定量PCR ( Fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR) 是近年来发展起来的一项新技术，指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程并对模板进行定量分析的方法。此方法不仅具有灵敏度高、特异性强等优点，更能对核酸模板进行准确定量18。其中SYBR Green荧光染料法以其使用方便、成本低、不需设计探针等优点而被广泛使用。【拟解决的关键问题】本研究以鼻气管鸟疫杆菌为检测对象，旨

13、在建立检测ORT的绝对SYBR Green荧光定量PCR方法，定量检测样品中的鼻气管鸟疫杆菌，为该病病原的早期诊断建立快速灵敏的检测方法，为流行病学调查提供可靠方法。1 材料与方法 试验于2012年2月-2012年9月在山东农业大学禽病学研究室进行。1. 1 病料及菌株来源临床病料样品：24份ORT疑似样品，采自山东部分商品鸡场。菌株：ORT标准阳性血清和参考菌株（编号为ORV94108、B3263191、O-96121）由英特威（Intervet）公司谭子龙博士、丘鹤英博士惠赠。鸡白痢沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和副鸡嗜血杆菌由山东农业大学禽病研究所分离纯化保存。1

14、.2 主要试剂及仪器 pMD18-T载体、SYBR Green I Premix、dNTP等，购自大连宝生物工程有限公司；ROX、DNA Marker DL2000等，购自北京全式金生物技术有限公司。其他化学试剂如氯仿、异丙醇、无水乙醇、MgSO4等，均为国产分析纯产品。DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；实时荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司(7500型)。1.3 引物设计与合成 以GenBank公布的鼻气管鸟疫杆菌16sRNA基因的序列（JF810495.1）为参照序列，用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物，扩增目的片段为214bp，

15、引物序列如下：F：5-GTGCCGTGAGGTGTTAGG-3R：5-GAGATTCGCATCCAGTCG-3以上序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.4鼻气管鸟疫杆菌总DNA的提取 按文献19介绍的方法，用PBS缓冲液收集培养的ORT菌株，用SDS裂解法提取菌体DNA。1.5鼻气管鸟疫杆菌SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及应用1.5.1 阳性标准品的制备 以提取的DNA为模板进行PCR反应，扩增ORT 214bp的目的片段。反应体系为：10PCR Buffer 2.5 L，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 2 L，F (25mol/L）、R (25 m

16、ol/L）各1 L，DNA 2 L，Taq酶（5 U/L）0.3 L，ddH2O 16.2 L，总体积25 L。PCR反应程序：95 5min；95 30，53 30，72 30，35个循环；72 7 min。目的片段为214 bp。将PCR获得的目的片段纯化后克隆到pMD18-T载体中，并将重组质粒导入DH5感受态细胞中进行增殖，提取质粒，经PCR、酶切鉴定和测序，筛选出阳性质粒。用分光光度计测定阳性质粒OD值，按公式计算质粒标准品的拷贝数Copies=(质量/分子量)6.02102320。1.5.2 荧光定量PCR反应条件的优化 结合使用梯度PCR仪，选择最佳的退火温度。在其他变量不变的情

17、况下，以出现最小的样本阈值循环数(Ct值)和最高荧光值以及不出现非特异扩增为标准，分别对退火温度、循环条件、循环次数和引物浓度等条件进行优化。1.5.3 荧光定量PCR标准曲线的建立 用紫外分光光度计测定并计算阳性质粒的纯度和浓度，选取OD260/OD280在1.82.0的阳性质粒制备标准品，10倍梯度稀释作为模板进行荧光定量PCR，并设三个重复，建立标准曲线。1.5.4 敏感性试验 用浓度为101107copies/uL的阳性标准品进行荧光定量PCR。以此计算出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数，同时设阴性对照。将检测结果与常规PCR进行对照，比较两者的检测敏感程度。1.5.5 特异性检

18、验 参照1.4分别提取鸡白痢沙门氏菌、大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌的DNA，进行荧光定量PCR扩增，同时设阴性对照，验证该方法的特异性。1.5.6 重复性检验 选用同一批次不同浓度的质粒(组内试验)和不同批次不同浓度的质粒(组间试验)，进行荧光定量PCR反应，比较Ct值和Tm值的变化情况，验证该方法的重复性和稳定性，同时设阴性对照。运用Microsoft Excel及SPSS16.0软件对结果进行分析。1.5.7 临床样品的检测 取山东部分商品鸡场疑似ORT感染的病料，用建立的荧光定量PCR方法进行检测。同时设阳性标准对照和阴性对照，观察检测结果并对结果进行分析

19、。2 结果与分析2.1 重组质粒PCR鉴定及测序鉴定结果 经质粒PCR扩增出了与预期大小相一致的214 bp的目的片段（图1）。阳性重组质粒命名为pMD18-T-F。重组质粒测序结果与GenBank中所选的设计引物的序列进行对比，其同源性为100%。测其在260 nm处的吸光度，计算其原始拷贝数1.441011个/L。（M：Marker；A: pMD18-T-F；B: 阴性对照 Negative control）图 1 标准品pMD18-T-F质粒的PCR鉴定结果Fig.1 PCR identification of pMD18-T-Fin standard samples2.2荧光定量PCR

20、反应条件的优化 经过多次试验后，确定最佳荧光定量PCR反应条件。反应体系为20.0 L：SYBR Green I Premix 10.0 L，上下游引物各0.4mol/L，模板2.0 L， ddH2O 7.2L。反应条件为：95 预变性10 min；95 15 s，60 60s，进行40个循环。2.3 荧光定量PCR检测鼻气管鸟疫杆菌标准曲线的建立 取103107copies/uL的pMD18-T-F质粒标准品分别进行荧光定量PCR扩增，生成扩增曲线(图2)和标准曲线（图3）。应用Excel软件进行回归分析，得到标准曲线方程和相关系数R2。其中横坐标为拷贝数的对数，纵坐标为ct值。图2 ORT

21、荧光定量PCR扩增曲线Fig.2 Amplified curve of SYBR Green fluorescent quantitative PCR for Ornithobacterium rhinotracheale初始模板量对数 Log starting quantity copy number图3 ORT荧光定量PCR标准曲线Fig. 3 Standard curve of SYBR Green fluorescent quantitative PCR for Ornithobacterium rhinotracheale2.3 扩增产物的溶解曲线分析 在反应结束后进行溶解曲线分析（

22、图4），扩增产物的溶解温度Tm为81.383.2，无非特异性产物和引物二聚体的峰值出现，标准品均一稳定。图4 ORT荧光定量PCR溶解曲线Fig. 4 Melt Curve of SYBR Green fluorescent quantitative PCR for Ornithobacterium rhinotracheale2.4 敏感性试验结果 将已计算出拷贝数的重组阳性质粒按10倍梯度稀释，并计算出梯度浓度分别为1.44108、1.44107、1.44106、1.44105、1.44104、1.44103、1.44102拷贝/L，在荧光定量PCR仪上所能检出的最低拷贝数为1.44102

23、拷贝/L (图5)，阴性对照无扩增。图5 ORT荧光定量PCR敏感性试验 Fig. 5 Sensitivity test of SYBR Green fluorescent quantitative PCR for Ornithobacterium rhinotracheale 2.5 特异性试验结果 分别提取鸡白痢沙门氏菌、大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌的DNA，同时设阳性和阴性对照，进行荧光定量PCR扩增，只有ORT有荧光信号，对ORT的DNA有良好的扩增，对其他细菌核酸无任何扩增，阴性对照无扩增，说明所设计的引物有很好的特异性(图6)。图6 ORT荧光定量P

24、CR特异性试验Fig. 6 Specificity test of SYBR Green fluorescent quantitative PCR for Ornithobacterium rhinotracheale 2.6 重复性试验结果 选取3个标准品，A、B、C进行组内和组间重复性测定，结果样品的Ct值及Tm值组内重复性试验CV值均小于3.0%，组间重复性试验CV值均小于0.7%，表明本方法的重复性好(表1)。D组阴性对照组，未检测到荧光信号。样品sample组内重复CP value 组间重复 CP value copiesnCV(%) CV(%) 108314.320.15 14.0

25、30.18107317.260.63 17.120.31106320.030.55 20.070.49表1 ORT荧光定量PCR重复性试验Tab 1 reproducibility test of SYBR Green fluorescent quantitative PCR for Ornithobacterium rhinotracheale2.7临床样品检测 对24份疑似ORT病料样品进行细菌分离鉴定，确定阳性病例4份，利用SYBR Green 荧光定量PCR及常规PCR对4份阳性病料进行扩增检测，其中常规PCR方法检出2份，荧光定量PCR方法检出4份，阳性检出率分别为50%和100%，

26、表明荧光定量PCR比常规PCR检测灵敏度高。3 讨论实时荧光定量PCR检测技术是通过检测反应体系中荧光强度来检测PCR扩增产物的富集，分为染料法和探针法。SYBR Green I是结合于DNA双链的一种荧光染料，与PCR合成的双链DNA结合后，在激发光照射下产生荧光，可以通过对荧光强度的检测实时监测PCR的产物量。它综合荧光标记技术、PCR技术、数码显相技术、激光技术等于一体，具有很高的检测灵敏度。SYBR Green I方法与荧光探针方法相比，荧光染料适用于任何引物，不需要合成探针，这样既降低了成本，又使检测方法更为简便。但荧光染料能与任何双链DNA结合，易产生假阳性，检测过程中可以通过设立

27、对照，调整引物浓度和优化反应条件来解决21-22。荧光定量PCR技术检测样品具有敏感性高、特异性强、重复性好、线性范围宽、易于标准化、高通量等优点23，同时可对病禽的组织、粪便及体液中的细菌进行定量24-25。本研究建立了鼻气管鸟疫杆菌 SYBR Green 实时荧光定量PCR检测技术，并应用于临床检测。试验过程中标准品DNA各个稀释度的溶解温度均为87.1左右，反应过程中未出现明显引物二聚体和非特异性扩增，表明本试验设计的引物特异性好，反应条件和体系得到了很好的优化。敏感性试验结果表明，该方法的敏感性高，最低检测限可达到1.44102 copies/L，约是常规PCR的1000倍；特异性强，

28、与其他细菌病无交叉反应；线性范围宽，标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，相关系数达0.9999，表明此反应体系具有良好的稳定性和较高的精确度。该方法具有高通量性，可进行大量临床样品检测；不需要设计探针，节约了成本；无需进行扩增后的电泳分析，可减少产物污染的风险。对采自山东商品鸡场的24份疑似ORT病料样品进行细菌分离鉴定，确定阳性病例4份，运用本试验建立的SYBR Green试试荧光定量PCR方法及常规PCR方法对4份阳性病料进行扩增检测，其中常规PCR方法检出2份，荧光定量PCR方法检出4份，阳性检出率分别为50%和100%，说明荧光定量PCR比常规PCR检测灵敏度高。4 结论本研究

29、初步建立了检测鼻气管鸟疫杆菌的SYBR Green 实时荧光定量PCR方法，不仅能进行定性检测，更能准确定量，可以检测到100个拷贝的细菌，为临床上鼻气管鸟疫杆菌的快速诊断和病原监测提供了可靠的方法。参考文献1 Sprenger SJ,Harlvorson DA, Nagaraji KV, et al. Ornithobacterium rhinotracheale infection in urkeys: immnoprophylaxis studies JAvi. Ris.2000, 44(3): 549 55.2 Haefz H M. Diagnosis of Ornithobaceri

30、um rhinotracheale J .International Journal of Poultry Science, 2002, 1(5): 114-118.3SPRENGER S J, HARI, VORSON D A, NAGARAJI K V. et al. Ornithobacterium rhinotracheale in immnoprophylaxisJ. Avi Ris, 2000,44(3): 549555.4 Dr Linda, van Veen. Do we know t he real impact of Ornihtobacerium rhinotrachea

31、le infections J. World Poultry, 2003, 5: 20-23.5 Pyzik E, Rzedzicki J, Kolasa A. Etiopat hogenesis and diagnostics of avian Ornithobacteriosis J. Wydawnictw AkademiiRolniczej, 2007, 62(2): 32-39.6Allymehr M. Seroprevalence of Orntithobacterium rhinotracheale infection in broiler and broiler breeder chickens in west azerbaijan province, IranJ. Vet Med Phtsiol Pathol Clin Med, 2006, 53(1):40-42.7Asadpour Y. Bozorgmehrifard M H, Pourbalhsh S A, et al, Isolation and identification of Ornithobacterium rhinotrcheale in broiler breeder flocks of Guilan province,