体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的研究.docx

1、体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的研究体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的研究【摘要】 目的 建立人破骨样细胞体外培养的方法，探讨1,25 (OH)2D3、巨噬细胞集落刺激因子(M CSF)、前列腺素E2(PGE2)等骨吸收刺激因子对破骨细胞分化、增殖和功能的影响，为进一步研究正畸牙齿移动的生物力学机制奠定基础。方法 将脐血单核细胞接种于预置盖玻片和骨片的24孔培养板中，实验组分别加入诱导因子1，25 (OH)2D3、M CSF、PGE2，对照组不加，每3d换液一次，培养7d。采用倒置相差显微镜、TRAP染色等方法观察破骨样细胞的形成情况。结果 第3天实验组单核细胞出现融合趋势，第7天T

2、RAP染色可见阳性的多核破骨样细胞，但尚未形成骨吸收陷窝，以1,25 (OH)2D3组破骨样细胞形成数量最多。结论 脐血单核细胞经1,25 (OH)2D3、M CSF、PGE2体外诱导培养后可分化为TRAP(+)多核的破骨样细胞，且10-8mol/L的1，25 (OH)2D3具有最强的生物学效应。【关键词】 脐血单核细胞；破骨样细胞；细胞培养；1,25 (OH)2D3；M CSF；PGE2Differentiation of osteoclast like cells inducedfrom umbilical cord blood cells in vitroABSTRACT: Object

3、ive To establish a stable and useful method for culturing human osteoclast like cells in vitro, and investigate the effect of 1, 25 (OH)2D3, M CSF and PGE2 on osteoclasts differentiation, proliferation and activation so as to lay the foundation for further study of the biological mechanism for tooth

4、 movement. Methods The HCMNC were isolated and cultured in 24 well plate with coverslips and human dentine slices. The experiment group was cultured with 1, 25 (OH)2D3, M CSF and PGE2, respectively, while the control group was not. The liquid was changed every 3 days and the whole culture process la

5、sted for 7 days. The phase contrast microscopy and TRAP staining were adopted to identify osteoclast like cells. Results On the 3rd day the monocytes began to fuse and on the 7th day positive multinucleated cells could be seen with TRAP staining, but absorption pit was not formed on the dentin slice

6、s. The group with 1, 25 (OH)2D3 had the largest number of osteoclast like cells. Conclusion After the monocytes in UCB are cultured by 1, 25 (OH)2D3, M CSF, PGE2 induction, they can turn into TRAP(+) multinucleate osteoclast like cells, the 1, 25 (OH)2D3 10- 8mol/L being the most effective.KEY WORDS

7、: mononucleated cell of umbilical cord blood; osteoclast; cell culture; 1, 25 (OH)2D3; M CSF; PGE2破骨细胞(osteoclast cells, OC)是具有独特骨吸收功能的多核巨细胞，来源于造血细胞系，OC由单核细胞(mononucleated cells, MNC)融合而成，不能增殖和传代。破骨样细胞(osteoclast like cells, OLC)是指实验中原代培养或诱导生成的，具有OC性质，用于细胞学或分子生物学研究的细胞。OLC与OC的不同是前者用于实验研究，而后者位于骨改建部位。体

8、外培养OC，在MNC融合的过程中，受到多种细胞因子以及产生这些细胞因子的细胞及其相关刺激的影响，研究表明：1,25 (OH)2D3、巨噬细胞集落刺激因子(M CSF)、前列腺素E2(PGE2)等是OC分化发育的关键因子，可支持血缘性MNC向OC分化。Fujikawa 等1证明在人外周血中存在破骨细胞前体细胞，而人脐血中含丰富的更原始的血缘性前体细胞，特别是粒 单核系祖细胞(CFU GM)或CFU 混合多核细胞集落含量高。因此，本实验通过对脐血单核细胞(HCMNC)的体外诱导培养，观察1，25 (OH) 2D3、M CSF以及PGE2对人OLC形成的影响。1 材料与方法材料实验对象 非高危妊娠的

9、健康孕妇，于胎儿娩出后、胎盘未完全娩出前自脐静脉穿刺，无菌条件下收集脐带血(UCB)，肝素抗凝。主要试剂 MEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(浙江金华生物制剂公司)，人淋巴细胞分离液(天津灏洋公司)，1,25 (OH)2D3(Sigma公司)，重组人M CSF (Sigma公司)，PGE2(Sigma 公司) ，萘酚AS BI磷酸盐(Sigma公司)。方法玻片及骨磨片的处理 将盖玻片超声清洗后浸入硫酸重铬酸钾溶液中过夜，高压灭菌后备用。取新鲜牛股骨，制备成厚100-200m的骨片，超声清洗10min3次，浸入10倍双抗中20min3次，紫外线照射消毒后存放于-20备用。分离HCMNC 取

10、健康产妇抗凝UCB 50mL，与PBS等体积混合；将稀释血液以体积比11沿管壁轻轻加于Ficoll液面上，使二者形成一个清晰的界面；2000r/min离心20min，吸取呈云雾状的白膜层(主要含单个核细胞)，收集于离心管内；用PBS洗3次，1000r/min离心5min，弃上清，加入含15%(体积分数)FBS的 MEM培养液重悬计数，调整细胞浓度为1106/mL。实验分组和诱导培养HCMNC 将收集的HCMNC接种于预置盖玻片和骨片的24孔培养板中，每孔加入HCMNC悬液，在37，5%(体积分数)CO2孵育箱内培养2h，全量换液后分组加入诱导培养液，实验分5组：A组为空白对照，不加任何诱导因子

11、；B组加入1，25 (OH)2D3 110-8mol/L；C组加入1，25 (OH)2D3 110-7mol/L；D组加入M CSF 2010-6g/L；E组加入1，25 (OH)2D3 110-8mol/L和PGE2110-6mol/L。每3d全量换液1次，培养7d。细胞形态学观察 用倒置显微镜观察贴壁生长的细胞形态，融合现象以及多核细胞形成的情况。TRAP染色 取培养第7天的细胞爬片，用%(体积分数)戊二醛固定液4固定10-15min，蒸馏水洗3次；浸入TRAP染色孵育液37，50min，双蒸水洗3次；细胞爬片的面向下，中性树胶封片，光镜观察。骨吸收陷窝观察 取培养第7天的骨片经%(体积分

12、数)戊二醛固定液固定7min，/L氢氧化铵超声清洗1min3次，系列酒精脱水，自然晾干，1%(体积分数)甲苯胺蓝染液室温染色4min，蒸馏水洗后光镜下观察。OLC及骨吸收陷窝计数 以TRAP染色(+)、细胞核2个的细胞为OLC，对培养第7天盖玻片上的OLC进行计数，每张玻片计数5个随机视野(200)，取其均值为每张玻片的OLC数。光镜(100)下对整张骨片作陷窝计数，每张骨片任选5个视野，记录其均值，结果以陷窝数/骨片表示。所有数据均用s 表示，进行多组间的单因素方差分析及t检验，使用进行计算。2 结果细胞形态学观察 初培养时，细胞数量较多，2h后换液，去除了未贴壁的淋巴细胞，留下已贴壁生长的

13、MNC，未见到多核的成熟OC。A组：培养前3d，细胞形态及数量未有明显变化(图1A)，第5天，细胞数量减少，可观察到部分单核细胞的融合现象，第7天，可观察到很少量的OLC，核的数目2-3个不等(图1B)；B组：培养3d后，细胞数量减少，可观察到单核细胞的融合现象，核大，数目2-5个不等，多核细胞数量开始增多(图1C)，培养5d时，可见大量多核OLC，圆形或不规则形，胞体大，折光性强，有的细胞出现细长伪足，核的数目3-20个不等(图1D)；C、D、E组细胞的变化基本同B组。TRAP染色结果 培养第7天细胞作TRAP 染色，显微镜下可见胞浆染为红色，胞核呈淡黄色的TRAP(+) OLC。个别单核细

14、胞也呈阳性染色，可能为OC前体。A组可见少量TRAP(+)的细胞，细胞体积较小，多为2-3个细胞核(图2A)；B、C、D、E组TRAP(+)的细胞数量明显较A组多()，且多为5个以上细胞核(图2B)，尤其在B组可见到有14个核的强阳性破骨样细胞，胞体大，多有伪足伸出(图2C)；B组与C组间TRAP(+)细胞的数目差异无统计学意义()，B组与D组，B组与E组间差异有统计学意义()，D组与E组间TRAP(+)细胞的数目差异无统计学意义()。骨吸收陷窝观察结果 接种培养7d后的骨片，经甲苯胺蓝染色后各组均未观察到典型的骨吸收陷窝。统计分析结果 各组OLC计数比较结果见表1。与A组相比，B、C、D、E

15、组OLC数量明显增多()，B组与D组，B组与E组间差异有统计学意义()，而B组与C组及D 组与E组间OLC的数目差异无统计学意义()。图1 培养破骨样细胞倒置显微镜观察Observation of phase contrast microscope for OLC (400)A: group A cultured for 3 days; B: group A cultured for 7 days; C: group B cultured for 5 days; D: group B cultured for 7 days (pseudopodium occurred). Group A: T

16、he control group; Group B: The group with 1, 25 (OH)2D3 110-8mol/L图2 培养破骨样细胞TRAP染色Results of TRAP staining for OLCA: results of group A (200); B: results of group B (200); C: TRAP(+) multinucleate osteoclast like cells (400)Group A: the controlled group; Group B: the group with 1,25 (OH)2D3 110-8mol

17、/L表1 各组培养破骨样细胞数比较Table 1 The number of multinucleate osteoclast like cells in culture systems* vs. group A; vs. group B3 讨论 OC是终末细胞，不能传代，且生命周期短暂，体外培养非常困难。目前，体外分离培养OC 的基本方法有3 种：机械分离培养法、凝胶纯化培养法和诱导培养法。其中，诱导培养法多用于对OC的细胞生化和分子生物学研究，以往采用不同的诱导因子在成骨细胞(OB)的参与下从骨髓细胞、脾细胞及外周血单核细胞中诱导出OLC，实验步骤较为繁琐。而本实验在没有OB的情况下，采用

18、1，25 (OH)2D3、M CSF、PGE2等骨吸收刺激因子诱导HCMNC，获得大量TRAP(+)多核的OLC。 以往的大多数观点认为：没有OB的参与，在体外无法诱导出OLC。因为OC表面不存在1，25 (OH)2D3、M CSF、PGE2等骨吸收刺激因子的受体，故不能对其直接发生反应；而OB却表达这些因子的受体，并能对这些因子发生反应。因此这些促进骨吸收的因子主要通过作用于OB，使OB表达骨吸收信号，并通过特定的信号转导通路，作用于MNC和破骨细胞前体，从而发挥其生物活性的。然而，本实验结果表明：即使没有OB存在，1，25 (OH)2D3、M CSF、PGE2等仍可以诱导HCMNC分化为T

19、RAP(+)的多核OLC，但是这些OLC尚未具有骨吸收能力，其功能成熟的条件仍需进一步研究。 1，25 (OH)2D3作为钙、磷代谢的重要调节激素，在OC的分化发育中具有独特的调节作用，体外培养条件下可支持脐血微环境中血缘性MNC向OC分化和功能成熟。Takahashi和李铁军等对小鼠的OC培养研究表明，1，25 (OH)2D3的效应呈剂量依赖性，在高于10-9mol/L浓度的单一刺激下，骨髓细胞的混合培养可于第6天分化形成TRAP(+)多核细胞，在骨髓细胞培养中，MNC募集、融合并形成OLC 的能力与1，25 (OH)2D3的浓度(10-6-10-10mol/L)呈正相关。本实验结果显示，B

20、组与C组中所生成的OLC的数量差异无统计学意义，倒置显微镜观察发现C组MNC开始融合的时间早于B组，然而B组TRAP(+)的细胞中，多核的OLC(核数9)数量较多。因此认为，单纯增大1,25 (OH) 2D3的浓度并不会使OLC的数量增多，10-8mol/L的1，25 (OH)2D3具有最强的生物学效应。 M CSF在OC形成中的作用存在较多争论，Kacena认为M CSF 能够刺激破骨前体细胞的分裂、增殖；Zaidi、Moonga等在实验中证实，如果在骨髓细胞培养中只加入核因子B受体活化因子配体(RANKL)或M CSF一种因子时，不能生成具有骨吸收功能的OC，只有在同时加入RANKL和M

21、CSF时，才可形成典型的OC。本实验D组中所形成的TRAP(+)细胞数目较A组增多，但是比B、C组细胞数量少，认为可能是缺乏RANKL的协同作用所致。 PGE2对OC的分化具有双重作用，低浓度的PGE2可诱导OC的分化，高浓度的PGE2对分离的OC有抑制作用，这可能是cAMP 生成增加而引起的暂时性效应。Udagawa等报道应用10-6mol/L的PGE2诱导骨髓细胞，培养7d，可明显增加OC的数量。本实验中，当1，25 (OH)2D3与PGE2联用时，由于协同作用，可能使PGE2局部浓度过高，导致OC分化受到抑制，使得E组中TRAP(+)的细胞数量少于B、C组。 正畸牙移动中的牙槽骨改建过程

22、涉及多种细胞参与，其中OC和牙周膜细胞(PDLC)是两种最重要的细胞。施加正畸力后，可以激活多个信号通路，刺激血缘性单核细胞分化发育为成熟的OC。其中，OPG/RANK/RANKL是OC分化成熟的最重要的调节系统。目前，发现OC内与RANKL相关的信号转导通路主要有4条：NF B通路、MAPK通路、PI3K/Akt通路和CN/NFAT通路10。 本实验在没有OB参与的情况下，采用1，25 (OH)2D3、M CSF、PGE2等骨吸收刺激因子诱导HCMNC分化为TRAP (+)多核的OLC，建立了体外培养人OLC的简易方法。为研究施加正畸力后牙周膜微环境中PDLC和OC相互作用的信号转导通路奠定

23、了基础，也为进一步探讨正畸牙齿移动的生物力学机制提供了新的思路。【参考文献】 1Fujikawa Y, Quinn JM, Sabokbar A, et al. The human osteoclast precursor circulates in the monocyte fraction J. Endocrinol, 1996, 137(9):4058 4060. Lee JN, Jung MH, Lee HY, et al. Functional and phenotypic characteristics of CD14+ monocytes and CD34+ hematopoie

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