酶工程实验 讲义doc.docx

1、酶工程实验 讲义doc实验二 大肠杆菌菌体总蛋白的超声破碎抽提与蛋白质的凝胶过滤纯化 实验原理利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将蛋白分离纯化出来，供进一步的研究使用。超声破碎时要产生大量的热，会引起蛋白的变性。为了避免产生高温，超声时一般使用间隔的脉冲处理，而且应在冰浴中进行。 凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子

2、量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的仪器、试剂和材料 1、 大肠杆菌2、细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0) 3、恒温摇床 4、小型高速离心机 5、超声波组织细胞破碎仪 6、玻璃试管，三角瓶 7、1.5mL和5mL 塑料离心管 8、“枪”，枪头实验操作1、大肠杆菌的培养： 从过夜培养的大肠杆菌LB琼脂平板上挑取2-3个菌落，接种5mL LB的玻璃试管中，放恒温摇床中，37培养过夜。2、超声破碎抽提：将培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中，8000转/分离心5分钟，倾去上清

3、液后，在沉淀上面再加培养物，继续离心，将所有的培养物都收集在一起。每管中加入1.5mL的细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0），用枪吹打，使沉淀悬浮。将离心管放在小试管架上，将超声波破碎仪的金属头插到离心管中，调整好试管的位置后关上超声破碎仪的门，打开仪器的电源，对每只离心管中的菌体进行超声破碎。条件：功率80瓦，工作2秒，间隔2秒，每一次处理5个循环。4次处理后，8000转/分离心5分钟。取出离心管，在显微镜下观察菌体的破碎情况。如果在显微镜下仍能看到菌体，则需进一步破碎。菌体完全破碎后，8000转/分离心5分钟弃细胞碎片，上清转移至1.5

4、ml离心管，即得蛋白粗提液，备凝胶层析用，或冷冻于-20。 3. 凝胶层析实验操作步骤：3. 1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入510倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。表1凝胶型号和层析柱大小与规格及凝胶用量层析柱规格凝胶的规格和用量（g）直径（cm）高（cm）容量（ml）G25G50G100G2000.9

5、159.52.510.60.30.93019521.20.60.960381042.51.21.620401042.51.21.640802085.02.41.67014035149.04.41.6100200502012.562.64021050201272.670370903520122.62.6100605301 00013025050110307017353.2.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的410倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀

6、释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为15125；对于纯化蛋白质来说应为1201100。凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的蓝色葡聚糖2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。3.3.加样与洗脱（1）加样量：加样量与测定方法和层析柱大小

7、有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用280nm波长测定吸光度，对一根2cm60cm的柱来说，加样量需5mg左右。一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的510。样品体积过大，分离效果不好。对高分辨率的分子筛层析，样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定，故高吸水量凝胶如Sephadex G-200，每mL总床体积可加0.30.5mg溶质，使用体积约为0.02倍总体积；而低吸水量凝胶如Sephadex G75，每mL总床体积加溶质质量为0.2mg，样品体积为0.0

8、l倍总体积。（2）加样方法：如同离子交换柱层析一样，凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。（3）洗脱：加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连，根据被分离物质的性质，预先估计好一个适宜的流速，定量地分部收集流出液，每组分一至数mL。各组分可用适当的方法进行定性或定量分析。凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。若无此装置，可用控制操

9、作压的办法进行。样品体积不宜过多，最好为床体积的15%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.020.1mol/L pH 6.98.0的PBS液（0.14mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14mol/L NaCl）。3.4 凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种： 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.

10、02%NaN3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4保存。此法至少可以保存半年以上。 用完后，以水冲洗，然后用60%70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。 长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于 6080干燥后保存。【注意事项】一、超声波细胞破碎仪使用注意事项：1 、切记空载（一定要将超声变幅杆插入样品后才能开机,）2、变幅杆（超声探头）入水深度： 1.5cm 左右，液面高度最好有30mm以上，探头要居中，不要贴壁。超声波是垂直纵波，插入太深不容易形成对流，影响破碎效率。3、超声

11、参数设置：设置键好仪器工作参数（具体设置见说明书或来电咨询），对于对温度要求比较敏感的样品（比如细菌）一般外面采用冰浴，实际温度肯定是低于25，蛋白核酸肯定不会变性。1） 时间：超声时间每次最好不要超过5秒 ，间隙时间应大于或等于超声时间，以便于热量散发。时间设定应以超声时间短，超声次数多原则，可延长超声机子以及探头的寿命。2） 超声功率： 不宜太大，以免样品飞溅或起泡沫， 如小于10ml样品容量，功率应在200w以内,选用2mm超声探头，另将面板后面的变幅杆选择开关打到相应挡；10-200ml样品容量的功率在200400w，选用6mm超声探头，另将面板后面的变幅杆打到相应挡；200ml以上的

12、样品容量功率在300-600w之间，选用10mm超声探头，另将面板后面的变幅杆打到相应挡；（2MM的小探头功率严禁超过350W）3） 容器选择：有多少的样品就选多大的烧杯，这样也是有利样品在超声中对流，提高破碎效率。例如；20mL的处理量最好用20mL的烧杯。 如100ml大肠杆菌样品设置参数： 超声5秒 间隙5秒 次数70次（总时间为10分钟）。功率300W（仅供参考） 500mL左右的量，功率开到500W-800W左右4、若样品放在1.5ml的EP管里请一定要将EP管固定好，以防冰浴融化后液面下降导致空载5、日常保养：用完后用酒精擦洗探头或用清水进行超声！二、凝胶层析注意事项1装柱后要检查

13、柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。2流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。【思考题】1凝胶过滤的原理是什么？是否小的分子流速快？为什么？2凝胶过滤的操作应注意些什么？实验三 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质【实验目的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2. 掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。【实验原理】在酶工程、生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以

14、聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N四甲基乙二胺（简称TEMED）。通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成。（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制

15、聚合时间，也可加入TEMED加速反应。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）； 凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）。浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。因此，样品分离效果好，分辨率高。SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超

16、过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。与此同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋于一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，仅仅取决于蛋白质的分子量。另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂 （巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。本实验采用化学聚合法制胶，进行不连续的凝胶电泳，并用考马斯亮蓝快速染色，以分离和鉴定大肠杆菌菌体、发酵液中和纯化的蛋白

17、产物。【试剂与器材】（一） 试剂 （1）30% 的凝胶贮备液：ACR 30g + Bis 0.8g 溶于 100 mL去离子水中，用3号新华滤纸过滤至棕色瓶中，4 避光贮存（1）。（2）分离胶buffer：1.5mol/L Tris-buffer,pH8.9： Tris base 18.3 g + 5 mol/L HCl 9mL + ddH2O 至100 mL）（3）浓缩胶buffer：1.0mol/L Tris-HCl, pH6.8 : 12.1g Tris base 溶于40mL ddH2O中，加5mol/L HCl 17mL, 加水补至100mL.（4）5Tris-甘氨酸电泳buffer

18、（pH8.3):（配1L）Tris-base 15.1g + 甘氨酸94g + 5g SDS + H2O至1L（用时稀释5倍）。（5）10% SDS:：称10克SDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温中。（6）TEMED（四甲基乙二胺）：浓度10%，20 mL (全班共用)，4保存。（7）10% AP（过硫酸铵）：10 mL，新鲜配制，分装至1.5mL 离心管中，20保存待用（2）。（8）样品溶解液：内含1% SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL缓冲液。* 先配制0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl

19、缓冲液：称Tris 0.6g ，加入50 ml重蒸水，再加入约3 ml 1mol/L HCL,调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100 ml*按下表配制样品溶解液：*如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。*或配制2 X SDS样品缓冲液：100mmol/L Tris-HCl (pH6.8)200mmol/L DTT4% SDS0.2%溴酚蓝20% 甘油必要时加入少量（1%）巯基乙醇。（9）考马斯亮蓝染色液(3)：0.25 g考马斯亮蓝R250溶于100ml固定液中，固定液（50%乙醇和10%冰醋酸水溶液），用滤纸过滤除去不溶物。（10）脱色液： 20%乙醇和7%冰醋酸的水溶液

20、。也可用0.5MNaCl水溶液。（二）器材 电泳仪 垂直板电泳槽，电泳板微量进样器（50L） 染色/脱色摇床。【操作方法】1.胶板模型的安装：在干净的凹形玻璃板的三条边上放好塑料条（有些型号的电泳板已有固定的隔板），然后将另一块玻璃板压上，用夹子夹紧（或装在制板模型中），在两块板之间滴上热融的10 琼脂糖凝胶封边 。2.分离胶的制备10 ml，可供两块板( 11cm x10 cm)使用表1 SDS不连续系统分离胶的配方溶液成分10ml凝胶液中各成分所需体积（C=2.6%）T=6% T=7.5% T=10% T=12% T=15%去离子水/ml5.34.84.03.32.330%凝胶贮液/ml2

21、.02.53.34.05.0分离胶buffer/ml2.52.52.52.52.510% SDS/ml0.10.10.10.10.110%过硫酸铵/ml5050505050TEMED/l55555用手轻摇混匀, 小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间（2.5cm）,轻轻在顶层加入几毫升去离子水覆盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。 刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全，整个过程约需30分钟（25室温）。3.浓缩胶的制备：先把已聚合好的分离凝胶上层的水吸去，再用滤纸吸干残留的水液。 按下列配方制备各种体积的浓缩

22、胶溶液：表2 SDS不连续系统浓缩胶的配方溶液成分5ml凝胶液中各成分所需体积（C=2.6%）T=5% 去离子水/ml3.430%凝胶贮液/ml0.83浓缩胶buffer/ml0.6310% SDS/l5010%过硫酸铵/l25TEMED/l5混合后将其注入分离胶上端，插入梳子，小心避免气泡的出现。4.在浓缩胶聚合的同时，将蛋白样品与2x样品缓冲液等体积混合，置沸水或微量恒温器（100）中加热3分钟，马上插入冰上冷却待用。5.浓缩胶聚合完全后，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入1X电泳缓冲液，小心地拔出梳子，用移液器冲洗梳孔，检查有无漏，并驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。6.按次序上样：

23、用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，所加样品混合液体积要根据样品蛋白浓度而定，一孔加一个样品，同时用已知分子量的标准蛋白作对照。7.电泳：开始时电压为58V/cm（约100V）凝胶，待染料浓缩成一条线开始进入分离胶后，将电压增到1012V/cm（约180V）凝胶，继续电泳直到染料（溴酚蓝）抵达分离胶底部，断开电源。8.剥胶：取下胶板，从底部一侧轻轻撬开玻璃板，用手术刀切去浓缩胶，并切去一小角作记号。9.固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝染色液染色并固定，最好放在摇床缓慢旋转1-2小时。10.脱色：先用水洗去染料，再放入脱色液中浸泡，更换脱色液3-4次，约4-8小时或过夜。11.将脱

24、色后凝胶中的蛋白质分离色带照相或干燥，也可无限期地用塑料袋封闭在含20%甘油的水中。【注意事项与提示】（1) 丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺具有神经毒性，因此称量时要戴手套。两者聚合后即无毒性，但为避免接触少量可能未聚合的单体，所以建议在配胶和制板过程中都要带上手套操作。另外，配好的溶液之所以要避光保存，是因为此溶液见光极易脱氨基分解为丙烯酸和双丙烯酸。（2）过硫酸铵极易吸潮失效，因此要密闭干燥低温保存。配好的10过硫酸铵要分装冷藏。（3）考马斯亮蓝R-250(三苯基甲烷）染色: 每分子含有两个SO3H 基团，偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上。与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色。检测灵敏度约为0.20

25、.5ug。也可用银染色：将蛋白带上的硝酸银还原成金属银、以使银颗粒沉积在蛋白带上。此法比考马斯亮蓝灵敏两个数量级，但步骤较复杂。（4）制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。有些型号的电泳板可在模型中直接安装，免去了封边和拆边的麻烦，还可以同时制备多块凝胶。（5）AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。为避免过快聚合，可将加了催化剂的凝胶先放在冰中。（6）加热使蛋白质充分变性。（7）用移液器冲洗梳孔可将空中的凝胶除去，以免点样孔不平齐或影响蛋白样品的沉降。（8）两玻

26、璃板间凝胶底部的大气泡可阻断电流，因此必须除去。（9）总量一般不超过20l，如果点样量太多溢出梳孔，就会污染旁边泳道。要根据样品浓度来加样品溶解液。每点一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。（10）电泳时间要依据所用电压及待测蛋白分子量大小而定。（11）电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致，不能在凹形板双耳处撬，也不能用死力弄坏玻璃板。（12）考马斯亮蓝染色液盖过凝胶即可，染色后染色液要回收，可重复使用多次。（13）脱色过夜可使背景更干净，谱带更清晰。【实验安排】本实验试剂配制和电泳可在一天内完成，各小组要在上午配好试剂并做好胶，中午或下午即可开始电泳。【实验报告要求与思考题】1. 就实验

27、中出现的各种问题进行分析讨论。2在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?3在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用。4根据下式计算标准蛋白和待测样品的电泳迁移率，然后以标准蛋白的相对迁移率为横坐标，其分子量的对数为纵坐标作标准曲线图，根据标准曲线图准确计算待测蛋白的分子量。粗略估计待测蛋白分子量的方法是直接根据凝胶上的分子量标准进行估算。5为什么样品电泳前要高温加热？6进行凝胶电泳时应如何选择样品点样，设置对照？实验四淀粉酶的固定化及淀粉水解作用 一、实验目的1. 制备固定化的-淀粉酶；2. 进行淀粉水解的测定。二、实

28、验原理（一）酶和固定化酶1酶：酶是生物体内催化各种反应的催化剂。酶作为催化剂与一般的催化剂有共同特点：用量少而催化效率高；不改变化学反应的平衡点，酶本身在反应反应前后也不发生变化；可降低反应的活化能。酶作为生物催化剂的特性有：催化效率高；有高度的专一性；易失活等。通常情况下酶都是在水溶液中催化底物反应，因此酶在反应系统中是与底物、产物混在一起的，反应结束后，即使仍有较高活力，也很难再回收利用。另外，在水溶液中起作用的酶也给产物进一步分离纯化带来了一定困难。2固定化酶：固定化酶又称固相酶、水不溶性酶，它是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定化酶

29、与游离酶相比不但稳定性好，而且与底物和产物容易分离，且易于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于自动化生产。因此，固定化酶在工业、医学和生化分析等方面的应用发展较快。直接使用酶和固定化酶催化的优缺点比较类型优点不足直接使用酶催化效率高，低耗能、低污染等。对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。使用固定化酶酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的。（二）固定化酶的制作原理酶固定化方法由

30、酶的性质和载体特性所决定，主要包括：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。1吸附法：有物理吸附法和离子交换法两种。物理吸附法是将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上，但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，对蛋白质有高度吸附能力的有机硅胶、活性碳和石英砂等。离子交换法是利用蛋白质的两性性质，使其带有电荷的基团与离子交换剂形成离子键，而被交换结合至交换剂上。2共价偶联法（载体偶联法）：酶蛋白的一些基团，包括羧基末端、氨基末端等，在温和的条件下能与载体共价结合，从而被固定。但结合的部位必须不是酶的活性中心，也不是维持其空间结构的必需基团。这种结合稳定性好，酶不易脱落，可使用较长时间。3交联法：是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法，交联法使用的交联剂是二醛等水溶性化合物。4包埋法：是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。（三）实验原理本实验是用吸附法将淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成。（具体过程见下图）淀粉水解产物的检测淀粉水解过程淀粉酶只将淀粉水解为糊精，淀粉溶液