第八章细胞信号传导与遗传毒物作用机制.docx

1、第八章细胞信号传导与遗传毒物作用机制p216 第八章细胞信号转导与遗传毒物作用机制 在多细胞生物体内细胞通过相互间的信息交流以调节它们的发育和组合，控制它们的生长和增殖，协调它们的代谢和功能。细胞接受细胞内外的生理性和非生理性信号而产生应答和反应，以调节它们的行为和命运。近年来，有关细胞间的通讯和细胞信号转导通路的研究有长足发展，已知细胞信号转导紊乱和障碍是许多病理状态和疾病的重要发病机制。越来越多的研究结果证明，细胞信号转导也是许多遗传毒物作用的切入部位。自遗传毒物接触细胞开始，细胞信号转导通路即被卷入。紫外线可诱发细胞表面受体的聚簇和内吞，激活SRC和应激信号通路。我们的实验室也证明，烷化

2、剂甲基硝基亚硝胍可诱发细胞表皮生长因子受体和肿瘤坏死因子受体的细胞表面受体的聚簇和内吞，激活细胞应激信号通路和cAMP一蛋白激酶A一转录因子CREB通路。虽然这些改变在遗传毒物引起的细胞突变形成的作用目前还不能作出结论，但无疑是非常值得探索的课题；大部分遗传毒物在体内都需经代谢活化，而这些有关的药物代谢酶的表达受外来化合物的影响。目前所知，与之有关信号通路与核受体如多环芳烃受体(AhR)和某些孤儿受体(orphan receptor)有关；经典的认识认为，遗传毒物的作用主要是通过它对细胞DNA的攻击而最终诱发细胞突变。不仅现已知晓DNA损伤本身就是激活有关细胞信号转导通路的信号，而且也知晓突变

3、并不是全部起源于直接的DNA损伤。体细胞超突变(somatichypermutation)就是通过细胞表面免疫球蛋白构成的受体而驱动基因突变的一个最明确的例子。即使在DNA受攻击过的细胞(在细菌也如此)中，突变还可发生在未直接受攻击的碱基部位，即非定标性突变(nontargeted mutation)。已经证明，它的发生依赖于由细胞信号转导通路介导的基因表达改变；遗传毒物引发的基因突变构成它的致癌活性的基础，细胞的恶性转化是癌基因和肿瘤抑制基因突变积累的结果。许多野生型癌基因和肿瘤抑制基因编码蛋白，实际上就在细胞增殖、分化和运动调控有关的细胞信号转导通路中起信号蛋白的作用；若把致畸物也包括进来

4、的话，可以说细胞信号转导通路是现代研究致畸物作用机制的基础。因为已知细胞分化和胚胎发育的进程，是由不同的活性因子在细胞分化和胚胎发育不同阶段诱导的结果，因此致畸物的作用实质上是干扰了有关的细胞信号转导通路。由此可见细胞信号转导通路与遗传毒物作用的关系是何等密切。由于传统的遗传毒理学对此很少涉及，而细胞信号转导通路研究的进展又是如此神速，因此本章将首先尽可能结合遗传毒物的作用机制对主要的细胞信号转导通路作一概述，使读者对此有一个基本概念，然后阐述某些遗传毒物作用环节中的细胞信号转导通路的研究现状。 第一节细胞信号转导概论14 动物细胞间的信息交流细胞通讯(cell signaling)，在紧密接

5、触的细胞间可以直接通过间隙连接(gap junction)进行信号分子的直接交换或者通过膜结合信号分子进行信号p217的传递。在有一定距离间隔的细胞间的通讯，则通过细胞分泌的信号分子完成。非紧密接触的细胞间通讯都是由靶细胞的特异性蛋白受体与信号发放细胞分泌的细胞外信号分子相互作用进行，并在靶细胞内诱发一连串级联反应(cascade)最终导致靶细胞的应答反应。 亲水性信号分子，如大部分激素、局部化学介质和所有已知的神经递质，这些信号分子都不能直接通过细胞质膜的脂质双层进入信号接受细胞，而作用在后者表面的特异性受体蛋白并发挥信息传递作用；疏水性信号分子，如甾类激素、甲状腺素等，则可直接通过质膜的脂

6、质双层进入细胞，而与细胞内特异性受体蛋白发生作用。疏水性的前列腺素则为例外，它同细胞表面受体结合而触发迅速发生的短效反应。 一、间隙连接细胞间信号传递5,6 间隙连接(gap junction)是间隙连接细胞间信号传递(gap junction intercellular communication，GJIC)的结构基础，它分布于上皮、神经元突触、平滑肌、心肌等细胞间。连接处的邻接两细胞的并列质膜间有23nm的间隙，其间有许多在质膜表面排列成片的跨膜蛋白颗粒横架，在每一颗粒周围有呈正六角形排列的另6个颗粒。跨膜蛋白颗粒是中央为直径约2nm的通道，它由邻近两个细胞各自的称为连接子(connexo

7、n)的间隙连接亚单位组成(图81)。连接子由6个穿膜的连接蛋白(connexin，CX)分子围成。在小鼠已克隆了14个Cx基因。在其他脊椎动物虽然还未获得小鼠的直向同源基因，但也已克隆了至少6个Cx基因。因此，脊椎动物的Cx基因看来已超过了20个，而人和小鼠的有关基因分布在包括X染色体在内的至少4条染色体上。根据序列相似性，把它们分为和两组。除一些主要在神经元中表达的、在结构上与和两组都不相似的以外，它们的编码区都包含在一个外显子中，在其5非翻译区中有l2个内含子。其编码多肽有4个跨膜区，2个胞外环，1个胞内环和胞内的氨基和羧基末端。CX可与相同类型或不同类型的CX聚合形成同源(homomer

8、ic)或异源聚合(heteromeric)连接子。由于细胞间通道跨越两个细胞膜，邻接的细胞可提供不同类型的连接子，因此可生成各种同型(h0motypic)、异型(heterotypic)或异源细胞间通道。再加上已知至少有20个CX编码基因，这样就可形成在结构上和生理功能上非常不同的细胞间通道。 以往都认为通过间隙连接交流的信号分子是无选择性的，各种小于1200 Da的分子都可通透；但根据电压依赖性、pH敏感性、磷酸化程度和传导性观察，现知细胞间的通透作用是有连接子依存性差异的。例如由CX32组成的同源连接子对cAMP和cGMP都可通透，而由CX32和CX26组成的异源基因连接子只可通透cGMP

9、而无cAMP通透性。 间隙连接除在代谢协同作用(metabolic cooperation)、电兴奋传递中起重要作用外，在图81间隙连接模式图(引自White等6)p218细胞发育和分化控制中的作用尤为令人注目。在8细胞胚晚期就有连接蛋白CX43的表达和间隙连接形成，在桑椹胚至少已有5种连接蛋白表达，它对囊胚进一步分化出滋养层和内细胞团起关键性影响。Cx26基因剔除(knockout)小鼠在胚胎第ll天就死亡，这是因为间隙连接在经胎盘的营养物质运输中起重要作用。葡萄糖从母体血液至胎儿血液的转运，需跨越两紧邻的细胞层，合体滋养层细胞I和Il。母体葡萄糖进入l型细胞和从II型细胞的释放由质膜上的转

10、运蛋白GLUTl促进，但它在两合体滋养层细胞间的弥散则由CX26构成的细胞间通道完成。间隙连接功能紊乱和Cx基因突变还与多种疾病及遗传性疾病的发生有关。例如遗传性非综合征性耳聋与Cx26基因突变，人类周围神经病变和Cx32基因突变，白内障与Cx50基因突变，间隙连接与雌性不育的形成，间隙连接与正常心肌传导和心脏发育等有关。间隙连接与肿瘤形成也有关系。许多肿瘤和肿瘤细胞系的间隙连接减少或发生改变；一些致癌物和促癌物也可引起间隙连接细胞间通讯减弱。也有人企图用上调细胞间通讯来恢复细胞生长控制。有报告称，维甲酸(视黄酸)可增强间隙连接细胞间通讯和减少细胞生长和转化。将Cx cDNA转染肿瘤细胞使之高

11、表达，证明有功能的间隙连接可抑制一些转化细胞的生长和成瘤率。转染Cx43、Cx32、Cx26和Cx40 eDNA并获得表达的细胞，间隙连接细胞间通讯增强，但只有一些连接蛋白可在体内或体外，引起与其表达水平相关联的细胞生长的抑制。由化学物诱发恶性转化的小鼠成纤维细胞、大鼠胶质瘤细胞和人的横纹肌肉瘤与其未转化亲本细胞相比，有Cx43表达缺陷，在转染了Cx43后生长延缓，成瘤率降低；同样，人肝癌细胞和HeLa细胞与其亲本细胞相比，分别缺乏CX43，在转染相应的Cx基因后细胞生长减慢。由此可见间隙连接、连接蛋白及其编码基因可能是遗传毒物作用的分子靶。 二、细胞胞内和核受体介导的细胞信号转导 除前列腺素

12、外，疏水性信号分子经简单扩散，通过细胞质膜进入细胞。一旦进入细胞即同位于胞液和核内的相应受体蛋白发生紧密的可逆性结合，并导致受体蛋白构象变化和核转位(nuclear translocation)。配体与受体蛋白的结合提高后者对DNA的亲和力，而使之结合至核内特殊应答基因启动子(promoter)的反应元件(responSe element)上，发挥它对有关基因表达的反式激活作用(transactivation)而诱发细胞的特定应答反应。这类受体蛋白本身就是配体依存性转录因子(1igand dependent transcription activator)并最终定位于核内，因此统称为核受体。核

13、受体根据结构又可分为甾体激素受体(steroid recep-tor)和视黄类受体(retinoid receptor)。前者的配体为甾体激素，后者的配体为视黄酸(维甲酸)、甲状腺素和维生素D等。通过分子克隆技术，还找到一些同源基因，它们编码与已知核受体同源的蛋白，但由于发现受体前其配体不明，因此称为孤儿受体(orphan re-ceptor)。核受体在一些疏水性遗传毒物的作用机制中有重要地位，除了环境中的性激素样污染物的作用可能与有关受体有关外，有些遗传毒物有相应的受体存在，如多环芳烃类遗传毒物的芳烃受体、强致畸物视黄酸的视黄酸受体，它们都属于核受体。还知晓与遗传毒物代谢活化有关的细胞色素P

14、450的诱导和一些外来化合物的受体都与核受体有关。有的孤儿受体被剔除后，还将发生严重的发育异常。因而孤儿受体与遗传毒物作用也有密切关系。p219 (一)甾体激素受体1，3脊椎动物甾体激素，如糖类皮质激素、醛固酮、雌激素、雄激素、孕激素等受体的结构非常相似。它由约800个氨基酸组成，回折形成至少3个功能区(domain)，即由220250个氨基酸组成的相对保守的C末端配体结合区，由70个氨基酸组成的高度保守的中央DNA结合区和50至500个氨基酸组成的N末端调节区或称转录激活区。甾体激素受体在与配体结合前以异型寡聚体形式存在，它含有一受体蛋白分子和两热激蛋白分子、(HSP70和HSP56各一个分

15、子)。热激蛋白与受体蛋白结合的部位也在受体的配体结合区中。甾体激素受体与配体结合后，发生受体二聚化而形成同型二聚体，引起受体二聚化的信号来自配体结合区和DNA结合区。在配体结合区和DNA结合区中有“亮氨酸拉链”(1eueine zipper)。样结构序列，它们负责受体的二聚化。在配体结合区还有核定位信号nuclear localization signal)序列，核定位信号还存在于受体蛋白DNA结合区近氨基端的由约30个氨基酸组成的区域内。受体蛋白在未与配体结合前不会发生核转位，也不能与特异的反应元件相结合。但配体结合区缺失的受体可不需配体作用，而自主地完成核转位并激活有关靶基因。当受体与配体

16、结合后，激素结合区构象发生改变，热激蛋白自复合体解离，受体蛋白分子开始正确折叠并形成特定蛋白构象而导致核转位的发生。在DNA结合区中最引人注目的结构是由其中一串半胱氨酸残基形成的两个“锌指”结构，后者是转录因子与相应反应元件的DNA序列，即激素反应元件(homlone response element，HRE)结合的分子基础(图82)。甾体激素受体的反应元件由反向重复(inverted repeats)序列组成。如糖类皮质激素受体(GR)、盐类皮质激素受体(MR)、睾甾酮受体(AR)和孕激素受体(PR)的HRE的共有序列为GGTACA(N)3TGTTCT，是一种不完全回文重复序列，而雌激素受体

17、(ER)的HRE为AGGTCA(N)3TGACCT，则是完全回文重复序列。在HRE结构中的5一和3一侧各构成一个半位点(half site)，其间由3个不保守的任何核苷酸(N)间隔。GR、MR、AR、PR虽都能与同一HRE特异结合，但其相应配体的生理功能是明显不同的。决定其功能特异性的因素可能主要不是受体的DNA结合特性，而更可能是由受体在不同细胞中的特异性表达及其表达水平不同，不同受体调节染色质结构改变的能力不同，不同受体与其他转录调节因子的相互作用，以及靶细胞中激素种类和浓度不同所决定。 甾体激素受体不仅可以促进靶基因的表达，而且也可抑制某些基因的表达，如糖类皮质激素可抑制l型和IV型胶原

18、、前阿黑皮素、催乳素、a一甲胎蛋白等基因的表达，并通过抑制某些细胞因子的表达而发挥其免疫抑制作用和抗炎作用。甾体激素受体可能通过以图82甾体激素受体结构及其激活示意图p220下三种作用机制抑制基因的表达：受体与靶基因中的负激素反应元件(negative hormone response element，nHRE)结合，受体不与DNA直接结合而通过蛋白质一蛋白质相互作用而抑制其他转录因子(如AP一1、NFJcB)的转录激活作用，或受体与通用辅助因子(如P300一CBP)相互作用使其不能与其他转录因子(如AP一1)进行有效的结合而抑制这些转录因子的转录激活作用。 上述基因组机制(genomic m

19、echanism)，显然不能解释甾体激素的快速作用，如甾体激素诱发的电生理效应、生长因子及肽激素的释放，以及对细胞增殖和凋亡的作用等t非基因组作用”。通过类固醇类同物结合试验、标记类固醇一牛血清白蛋白复合物结合试验、共价亲和性标记法、免疫组织化学和各种受体纯化试验等方法对膜受体作鉴定。目前认为类固醇的膜结合活性可能由核受体相同的或其翻版的膜蛋白，以及其他可与其相互作用的无关膜蛋白如一种ATP酶、钙三醇(calcitri01)受体等实现。许多由肽激素启动的信号机制也被甾体激素膜作用所激活，包括丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)、JUN一氨基末端激酶(JNKs)。还发现肽激素通过其膜受体的信号通路与

20、甾体激素间的“串话，(cross talk)。是否由于甾体激素对肽激素受体的直接作用，还有待阐明7。 (二)视黄类受体家族8，9 这类受体包括甲状腺素、视黄酸(RA)及维生素D受体、蜕皮素(ecdysone)受体等，皆有类似于甾体激素受体的结构。视黄酸受体(RAN)的生理性配体为全反式RA、9一顺式RA、及其代谢产物4一氧一RA、3，4一二脱氢RA和4一氧一视黄醇。其编码基因的克隆和鉴定及其初级序列的比较分析显示，它与甾体激素受体有类似结构。已分离到3种不同的RAR亚型，RAio、RAR和RAR，它们在哺乳类、鸟类和两栖类中都有存在。每一个基因含有两个启动子从而可生成不同N末端和不同剪接变体(

21、splice variant)的同工型受体。不同RAR在发育和成体中以特殊图式表达。另一种视黄酸受体称为视黄类X受体(retinoid X receptor，RXR)代表第二类视黄酸反应性转录因子，它与9一顺一视黄酸有高亲和性，其他活性配体有植烷酸(phytanic acid)和methoprene。RXR可促进视黄酸受体和甲状腺素受体(TR)与DNA的结合。也已鉴定了3种不同的RXR(RXR、)。RXR可与RAR、TR、维生素D受体(VDR)和孤儿受体形成异型二聚体，从而扩展视黄酸的潜在生理功能(图83)。视黄类受体识别DNA结合基序，其反应元件的共有序列为AGGTCA。它可组成直接重复(d

22、irect repeat，头对尾重复)、反向重复(inverted repeat,头对头重复)和反卷重复(everted repeat，尾对尾重复)结构，而在其半位点之间有不同数目的非特异性核苷酸组成的间隔存在，它决定反应元件与何种受体特异结合。这种非特异性核苷酸数为l、2(5)、3,4时分别可与RXR和PPAR(r过：氧化物酶体增殖子激活受体)、RAR、VDR(维生素D受体)和TR(甲状腺素受体)特异结合。视黄酸受体同型二聚体或异型二聚体的特定组合赋予识别特殊类型的反应元件。根据二聚体中每一个受体蛋白是否都结合有特异性配体，RXR和RAR可以激活或抑制转录作用。RARRXR异型二聚体结合在一

23、定位核小体染色质的表面而有助于阻遏性染色质结构的装配。转录作用的共阻遏物(cor印ressor)有核受体共阻遏物，nuclear receptor corePressor，NcoR)、视黄类和甲状腺素受体沉默介体(silencing mediator for retinoid and thyroid rec印tors，SMRT)，以及结p221图83 核受体的共同结构、功能域及其分类(引自0lefsk87)合蛋白如SIN3和组蛋白去乙酰酶(histone decetylase，HDAC一1)等。配体结合导致受体二聚体的构象改变而引起与共阻遏物的解离和与共激活物(coactivator)的结合，

24、从而导致局部染色质结构的酶性解体。视黄类受体的共激活物包括转录中介因子1(transcriptional intermediary factor l，TIFl)、TIF2、甾体受体共激活N-子(steroid receptor coactivator一1，SRC一1)、CBPcAMP反应元件结合蛋白(CREB)的结合蛋白cAMP response elementbinding protein(CREB)一binding protein及其同源蛋白P300和SUGTRIPl等。P300、CBP和P300CBP结合因子(P300一CBPassociated factor，PCAF)使组蛋白乙酰化。

25、核受体最强的共激活物为SRC一1和TIF2。一个SRCTIF2辅助因子，视黄类受体激活因子(activator of retinoid receptor,ACTR)gCBP和P-CAF募集在一起而形成一三聚激活作用复合体。但它们与细胞的转录机器如何耦联还不清楚。 视黄类受体在肿瘤发生与视黄酸致畸作用中的作用将在下文介绍。 (三)孤儿受体1,10,11 指的是在结构上与核受体超家族成员非常相似，但其配体不明的受体蛋白，在人类已知有40个由不同基因编码的孤儿受体。孤儿受体的克隆开拓了反向内分泌学reverse endocrinology)的新领域，即先发现受体然后再寻找未知的激素。研究较深入的孤儿

26、受体家族有过氧化物酶体增殖因子激活受体(peroxisome proliferatoractivatedreceptors，PPARs)、肝X受体(1iver X receptors，LXRs)、孕甾烷X受体(pregnane X receptor，PXR)、组成型雄甾烷受体(constitutive androstance receptor，CAR)、法尼醇X 体(farnesoid X receptor，FXR)、鸡卵白蛋白上游启动子转录因子(chicken ovalbumin upstream promotertranscription factors，COUPTFs)、肝细胞核因子4(

27、hepatocyte nuclear factor 4，HNF4)等。孤儿受体的配体除了内源性物质外，不少药物和毒物等外源性化合物也可成为其配体，从而与它们的生物学和毒理学作用有关。有的孤儿受体还在胚胎发育、细胞分化过程中起首要作用。p222 1过氧化物酶体增殖子激活受体(PPAR)家族 PPAR家族由3个相关的基因产物PPARa、PPAR7和PPARp()组成。受体名称的 来由是因为PPARa可被在啮齿类动物中引起过氧化物酶体数目和体积增大的化学物质 所激活。这三种受体的组织分布有很大区别，PPARa在肝、肾、心和肌肉中表达最丰富， PPART在脂肪细胞、大肠和单核细胞系列细胞中表达最高，而

28、PPARp()则几乎所有组织 中都有表达。它们与RXR形成异型二聚体。降低高甘油三酯水平的药物fib，ate是 PPARa的配体，抗糖尿病药triazolidinediones(TZDs)则是PPAR7的配体，PPAR的天然 配体，则是生理浓度的各种不同链长和饱和度的脂肪酸，和一些多不饱和脂肪酸的环加氧 酶和脂加氧酶代谢产物。通过PPAR调节一系列影响脂蛋白和脂肪酸代谢的基因的转 录。在单核细胞和巨噬细胞PPARa和PPAR7激活后，抑制炎性细胞因子及其下游炎性 标记物的表达，这些受体的激活在有些细胞中还有调节细胞分化和细胞生长的作用。 2肝x受体(LXR)家族 LXR家族也有多个成员。LXR

29、a在肝脏中有高丰度表达，它与RXR结合成一异型二 聚体而可结合至负责将胆固醇转化为亲水性胆汁酸的胆固醇7a一羟化酶编码基因 cyP7A的启动子中的反应元件上。生理浓度的两个胆固醇氧甾类(oxysteroid)代谢衍生 物24(S)，25一环氧胆固醇和24(S)一羟基胆固醇可与之结合，因此LXRa是调节过多的 食饵性胆固醇分解代谢的氧甾类受体。LXRfl在许多组织中都有表达而且也可为氧甾类 所结合，但它的生理功能不明。 3孕甾烷X受体(PXR) 在肝脏和小肠中有选择性表达，它与RXR结合成一异型二聚体而结合于细胞色素 P450 3A4 9NIN(CYP3A4)启动子的反应元件上。天然存在的甾体类

30、中最强力的激活物 为C21类固醇(孕甾烷)如孕酮的代谢物5p一孕烷一3，20一二酮，但皮质类固醇和雌激素 也可激活PXR。许多被广泛应用的药物如抗生素、抗霉菌素、糖类皮质类固醇和抑制素 (statin)类一羟一一甲基戊二酸单酰辅酶A(hydroxy一一methylglutaryl-COA，HMG CC)A)抑制剂等外源性化合物也可激活PXR。通过对CYP3A4基因转录的激活而调节这 些化合物的代谢和灭活，因此PXP为外源化合物传感器和类固醇内稳的调节器。 4组成性雄甾烷受体(CAR) CAR在肝内有丰富的表达，最近证明它是编码类固醇羟化酶的基因CYP28的转录 调节因子，因此它在类固醇内稳调节

31、中起作用如同PXR那样。CAR在没有外源性配体 添加时有很强的转录活性，但后者可被睾酮代谢物3a，5a雄烯醇和3a，5a雄烷醇所阻断。 这种配体介导的受体失活作用，在其他孤儿受体中也常存在。FXR同RXR形成可与 DNA结合的FXRRXR异型二聚体。 5法尼醇x受体(FXR) 它虽不能直接与法尼醇(farnesol)结合，但法尼醇和它的代谢产物可激活FXR-RXR的p223转录激活作用。FXR还可被合成的视黄酸衍生物TTNPB和超生理浓度的全反式视黄酸所激活。但最近发现FXR是生理浓度胆汁酸的受体，鹅脱氧胆酸(CDCA)是最强的激活物。CDCA调节参与胆汁酸内稳的许多基因的表达，包括CYP7A基因表达的抑制和肠胆汁酸结合蛋白(ileal bile acid binding protein)编码基因IBABP表达的增强。FXF在胆汁酸循环的组织，肝、肠和肾中有丰盛的表达，因此它被认为是核胆汁酸受体。