狗头枣ACOI基因的克隆.docx

1、狗头枣ACOI基因的克隆 分类号： Q7 单位代码： 109 密 级： 一般 学 号：1090208014034 本科毕业论文（设计） 题 目：狗头枣ACO基因的克隆专 业： 生物技术姓 名： 刘咪咪指导教师： 陈国梁职 称： 讲 师答辩日期： 二零一二年六月二日狗头枣ACO基因的克隆摘 要：以冬枣ACO基因序列（登录号：EU216549.1）为基础设计引物，狗头枣叶片总DNA为模板，采用PCR技术进行目的基因扩增并测序，并利用NCBI/Blast对其核苷酸序列和氨基酸序列进行分析，结果表明：所得目的基因大小为1294 bp，编码319 个氨基酸，该序列与GenBank中的冬枣ACO基因核苷酸

2、序列和氨基酸序列的同源性分别为100%和99%，表明成功的克隆了狗头枣ACO基因；ORF在线搜索软件分析发现该基因具有4个外显子和3个内含子，分别在106201、430541与8771002 bp碱基处。该基因序列已成功提交GenBank（登录号：JF812966.1）。关键词：狗头枣；ACO基因；基因克隆；序列分析Cloning of ACO Gene from Goutou JujubeAbstract: A pair of primers were designed according to the sequence of ACO gene from ZiZiphus jujuba(ac

3、cession number:EU216549.1).Total DNA of the leaves of Goutou jujube was taken as template.The purpose gene was gone on PCR amplification and sequencing. Nucleotide sequence and amino acid sequence of the gene acquired were analysed by NCBI/Blast.The result showed that the gene acquired had the lengt

4、h of 1294 bp,which encoded a total of 319 amino acids.Compared with nucleotide sequence and amino acid sequence of ACO gene from ZiZiphus jujuba which is in Genbank,the homology were 100% and 99% respectively,which showed the successful cloning of ACO gene from Goutou jujube;The analysis of ORF onli

5、ne search software showed that the gene contained four exons and three introns,which are located in 106201,430541 and 8771002 bp respectively.This gene have been successfully submitted to GenBank (accession number: JF812966.1). Key words: Goutou jujube; 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase

6、gene; Gene cloning; Sequence analysis果实成熟过程是基因有序表达并与环境相互作用的结果1。乙烯作为植物五大内源激素之一，介导植物对诸多信号和环境刺激作出响应2，特别是对果实成熟有明显的促进作用3-5。在果实的成熟过程中，乙烯的大量生成启动了果实内部一系列与衰老有关的酶的活性，从而导致采后旺盛的新陈代谢，使果品迅速衰老变质。高等植物中乙烯的生物合成途径为：Met（蛋氨酸）SAM（S-腺苷蛋氨酸）ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）Ethylene（乙烯）6，而ACO（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase）是乙

7、烯生物合成途径中的最后一个关键酶，可直接催化ACC转变为乙烯且催化的反应是不可逆的，其活性高低直接决定植物体内乙烯的生成量7。枣原产我国，枣树是我国具有特色和优势的果树之一，近年来以冬枣为代表的鲜食品种的快速发展以及人们对鲜枣营养价值的重新认识，带动了国内外市场对鲜枣的需求，然而鲜枣采收后不易保鲜、不耐贮藏大大缩短了鲜枣市场的货架期。本试验旨在利用基因重组技术克隆到狗头枣ACO基因，并对其序列进行有关生物信息学的分析，为以后深入探究该基因在枣果实成熟过程中的分子调控机理，培育耐储藏的枣新品种奠定理论基础。1 材料1.1 狗头枣叶片：于2010年9月采自延安市延川县。1.2 PCR引物：根据冬枣

8、ACO基因的核苷酸序列8（登录号：EU216549.1）组成以及克隆载体pGM-T Vector质粒的核苷酸序列组成、限制性酶切位点等，利用oligo6.0软件设计引物，命名为ACO-U、ACO-L，并委托上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：上游引物ACO-U，其碱基序列为5-ATGGAGAATTTCCCAGTTATCA-3下游引物ACO-L，其碱基序列为5-TTAAGCTGTAGCAATTGGACC-31.3 克隆载体pGM-T Vector：购自北京百泰克生物技术有限公司1.4 菌株：DH51.5 酶与试剂盒：EcoR、T4 DNA Ligase、Taq DNA Polymerase、

9、EcoRbuffer、PCR buffer 、RNase A与PCR产物凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司。2 试剂（1）2CTAB细胞提取液：2%CTAB，100 mmol/L TRIS-HCl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA(pH8.0)，0.7 mmol/L NaCl，40 mmol/L -巯基乙醇。（2）10TBE存储液：TRIS 108 g，硼酸55 g，EDTA 5.8450 g、pH8.0，加水定容至1000 ml。（3）50TAE存储液：TRIS 242 g，57.1 ml 冰醋酸(17.4 mol/L)，EDTA 37.2 g、pH8.0，加水定容至1000 m

10、l。（4）6loading buffer：0.25% 溴酚蓝，40% 蔗糖水溶液。（5）LB培养基(pH7.0)： 配制1000 ml需要加入胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，若是固体培养基，加入15 g 琼脂。（6）X-gal(20 mg/ml )：将X-gal溶于二甲基亚砜，配成20 mg/ml，分装避光-20 保存。（7）IPTG (200 mg/ml )：取2 g IPTG溶于8 ml双蒸水中，再补至10 ml ，用0.22 M滤膜过滤除菌，每份1 ml分装，-20 保存。（8）Amp (100 mg/ml)：称取1 g氨苄青霉素至于15 ml离心管中，加入9 ml

11、无菌水，充分混合溶解后定容至10 ml，用0.22 m滤膜过滤除菌，小份分装(1 ml/管)后，置于-20 保存备用。（9）TRIS-饱和酚:氯仿:异戊醇混合液：按25:24:1的比例配制。（10）溶液：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。（11）溶液：0.4 mol/L NaOH，2%SDS，等体积混合（现配现用）。（12）溶液：5 mol/L乙酸钠 60 ml，冰乙酸 11.5 ml，水 28.5 ml。（13）CaCl2溶液（0.1 mol/L）：称取无水氯化钙1.111 g，置于小烧杯中，加入80 ml无

12、菌水充分溶解后定容至100 ml，灭菌后4 保存备用。3 仪器高速离心机（HC-2518 科大创新股份有限公司中佳分公司），AUTOMATIC ICE MACHINE(XB70 GRANT)，超净工作台（SW-CJ-IC型双人单面 苏州净化设备有限公司），超低温冰箱（702 Thermo ELECTRON CORPORATION），气浴式振荡器（ZJS-1320科大创新股份有限公司中佳分公司），电热恒温水浴锅（HH-S4型 北京科伟永兴仪器有限公司），电子天平（AUY220 SHIMADZU CORPORATION JAPAN），微波炉（WD900ASXL2311 顺德市格兰仕电器实业有限公司

13、），微量移液器（DS75985、DA39029，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司），电泳仪（JY-ECP3000 北京君意东方电泳设备有限公司），高速冷冻离心机（KDC-160HR科大创新股份有限公司中佳分公司），电热鼓风干燥箱（101型 北京科伟永兴仪器有限公司），隔水式电热恒温培养箱（PYX-DHS-4050-BS 上海跃进医疗器械厂），普通冰箱（BCD-254（KK25V61TL） 博西华家用电器有限公司），超纯水机（KL-RO-20（台湾艾柯）成都康宁实验专用纯水设备厂），凝胶成像系统（BIO-RAD Gel-Doc-EQ BIO-RAD Laboratories），小型高压灭菌锅（T

14、H-1020），P2 Thermal Cycler(PCYL220 ISSUE 1、P221267HBP2220 Thermo ELECTRON CORPORATION)4 方法4.1 狗头枣叶片总DNA的提取 采用CTAB法提取狗头枣叶片总DNA，参照林加涵等9的方法，并略作修改，具体操作如下：称取新鲜狗头枣叶片0.120.13 g，置于预冷的灭菌后的研钵中，用液氮迅速研磨成粉末后，转入1.5 ml无菌离心管中；加入600 l 65 预热的2CTAB细胞提取液，轻轻混匀后，65 保温1 h，其间每5 min摇一次；加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），轻轻上下颠倒混匀，12000 rpm离心

15、10 min；将上清转至另一洁净的离心管中，加入1/10上清液体积的10CTAB，轻轻混匀，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀，室温下12000 rpm离心10 min；取上清，重复上述步骤；取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，缓慢颠倒混匀，会看到絮状抱团的白色沉淀，室温静置30 min，12000 rpm离心5 min，弃上清；75%乙醇洗涤沉淀23次，离心弃上清，自然风干；在沉淀中加入50 l无菌水，溶解DNA，低温保存备用；取上述所提DNA样品5.0 l与Loading buffer混合后点样，90 V稳压电泳约30 min，EB染色10 min后，凝胶成像。4.2 ACO

16、基因的扩增以DNA为模板，ACO-U、ACO-L为引物，按照下列体系及参数进行扩增反应：PCR反应体系（25.0 l）：1） ddH2O 17.3 l2） 10buffer（含Mg2+） 2.5 l3） d NTPs 2.0 l4） up primer（10 mol/L） 1.0 l5） lower primer（10 mol/L） 1.0 l6） Template 1.0 l7） Taq DNA Polymerase（5 U/l） 0.2 lPCR扩增反应参数 1) 95 5 min 2) 95 1 min 3) 59 50 s 循环30次4) 72 1 min 30 s 5) 72 10

17、min6) 4 +4.3 PCR扩增产物回收 将上述PCR产物电泳，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对其进行回收。4.4 PCR产物与T载体连接连接体系（10.0 l）：10T4 DNA Rapid Ligation Buffer 1.0 lpGM-T（约50 ng/l） 1.0 lT4 DNA Ligase (3 U/l) 1.0 l新鲜PCR片段 7.0 l将以上体系轻轻混匀，瞬时离心，封口，于低温恒槽中，16 连接过夜。4.5 重组质粒DNA的转化4.5.1 感受态细胞的制备用无菌牙签在LB平板上挑取新培养的DH5单菌落，接种到盛有5 ml LB液体培养基的50 ml 锥形瓶中，37 ，280

18、r/min震荡培养过夜；将上述培养物按照体积比1:100 放大于装有50 ml LB液体培养基的150 ml锥形瓶中继续培养23 h至OD600=0.30.4左右；将上述培养物转入50 ml无菌离心管中，冰浴30 min；4 ，6000 r/min条件下离心5 min，尽可能将上清去干净；用5 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2V原菌液:V CaCl210:1 溶液重悬沉淀物，冰浴30 min；4 ，6000 r/min条件下离心5 min；弃上清液，用600 l冰预冷的0.1 mol/L CaCl2 V原菌液:V CaCl250:1溶液重悬沉淀物，然后加入甘油至其终浓度为1530，按1

19、00 l/份分装，液氮速冻，放在-70 冰箱备用，使用时取出冰浴消融。4.5.2 转化将连接液，感受态细胞置于冰浴中，每100 l感受态细胞中加入5.0 l的连接液，快速轻柔混匀，冰浴30 min；将感受态细胞取出，放入42 水浴中，热激70-90 s，迅速取出后置于冰上静置3-5 min；向离心管中加入400 l不含抗生素的LB液体培养基，37 180 rpm 30 min后，调至 260 rpm 再摇30 min，使质粒上相关的抗性标记基因表达。4.6 重组子的筛选在LB固体培养基中加入Amp(100 mg/ml)，使其终浓度为100 g/ml，振荡混匀后倒平板，20 ml板；每板加入40

20、 l X-gal (20 mg/ml)，20 l IPTG (200 mg/ml)，涂布均匀，晾干；每板加上述转化产物250 l，涂匀后封口，37 恒温培养过夜。4.7 重组子的鉴定4.7.1 质粒DNA的提取及滞后检测挑取筛选平板上的蓝、白斑于加有Amp（100 g/ml）的LB液体培养基中，蓝斑作对照，37 280 rpm振荡培养过夜；取11.5 ml于离心管中，12000 rpm离心2 min，收集细胞；将细胞悬浮于200 l溶液中，充分混匀后，室温放置10 min；加入200 l溶液，上下轻轻颠倒混匀，冰浴5 min；加入200 l溶液，轻轻混匀，冰浴15 min；12000 rpm离

21、心15 min，将上清移至另一无菌离心管中；向上清中加入等体积的酚-氯仿(25:24:1)，混匀，12000 rpm离心5 min，取上清；加两倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20 静置30 min，12000 rpm离心5 min，收集沉淀；用200 l 75%乙醇洗涤两次（每次12000 rmp,5 min）；自然风干后，加入50-100 l无菌水溶解。取上述所提质粒DNA样品5.0 l与Loading buffer混合后点样，80 V稳压电泳约30 min，EB染色10 min后，凝胶成像系统成像。4.7.2 PCR检测以4.7.1步所提取获得的质粒DNA为模板，进行PCR扩增反应，其参数

22、及体系同方法4.2，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。4.7.3 酶切鉴定 以4.7.1步所提取获得的质粒DNA为模板，按下列体系（20.0 l）进行酶切反应： DNA 16.5 l 10EcoRbuffer 2.0 l EcoR 1.5 l 37 保温约13 h。4.7.4 测序将经上述多种方法鉴定获得的阳性重组子送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。测定的序列进行NCBI/BLAST同源性分析，并分别利用ORF在线搜索软件和DNAMAN软件对所得序列进行基因结构分析和氨基酸翻译。5 结果与分析5.1 狗头枣叶片总DNA电泳检测结果：提取的狗头枣叶片总DNA结果见图1。从图中可以看出，所提取的

23、DNA完整,没有降解,质量较好,可以满足PCR扩增的要求。 图1 狗头枣叶片总DNA电泳图Fig.1 Electrophoresis figure of total DNA of leaf from Goutou jujube1、2、4、5.狗头枣叶片总DNA1、2、4、5. Total DNA of leaf from Goutou jujube 5.2 目的基因的PCR扩增结果：PCR反应结束后，取5.0 l进行电泳检测（图2）。从图中可以看出，所获得片段约为1300 bp，与预期值相符，初步表明扩增到目的片段。5.3 目的基因PCR扩增产物回收结果：用回收试剂盒对PCR产物进行回收，取5

24、.0 l进行电泳检测（图3）。从图中可以看出：回收得到的片段大小约为1300 bp，且条带较清晰，可用于进行连接反应。5.4 重组子的筛选结果：如图4所示，经培养后的Amp固体培养基上长出了许多蓝斑和白斑，从中随机挑选大小均匀、表面光滑且透明的若干白斑进行重组质粒滞后鉴定，并挑选一个蓝斑作为对照。5.5 重组质粒的鉴定5.5.1 质粒滞后鉴定：从图5可以看出1、2、3、4和5号（白斑质粒）较M号（蓝斑质粒）均滞后，初步表明目的DNA片段可能插入到了T载体上，可进一步对滞后质粒做PCR鉴定。 图5 质粒提取电泳图 Fig.5 Electrophoresis figure of plasmidM.

25、蓝斑质粒;15.白斑滞后质粒 1. Blue-plaque plasmid; 2-6.White-plague lag plasmid 5.5.2 PCR鉴定结果：以上述14号（白斑质粒DNA）为模板，分别进行PCR扩增。PCR反应结束后，各取5.0 l进行电泳检测（如图6）。从图中可以看出：所获得片段大小均约1300 bp，与目的片段大小一致，进一步表明14号白斑很可能均为所需重组子，进而可对滞后质粒做酶切鉴定。5.5.3 酶切鉴定结果：用EcoR I对从重组子（2号）中提取到的质粒DNA进行酶切，从图7可以看出：得到的片段大小约为1300 bp，与目的片段大小一致，表明目的DNA片段已经插

26、入到了T载体上，2号白斑即为所需重组子。5.6ACO基因的测序结果及分析5.6.1 ACO基因的测序结果：测序结果如图8所示，本试验中所克隆到的序列全长1294 bp。用ORF在线搜索软件进行基因结构分析表明，该基因含有4个外显子、3个内含子，分别在106201、430541与8771002 bp碱基处。用DNAMAN软件对该序列进行翻译发现编码区序列长960 bp，编码319个氨基酸（最后一个密码子为终止密码子），序列见图9。克隆所得序列已成功提交GenBank，登录号为JF812966.1（基因），AEP19803.1（蛋白）。1 ATGGAGAATT TCCCAGTTAT CAACTTG

27、GAG AATCTCAATG GTGAAGGAAG GAAGGCTACA61 ATGGAACAGA TTAGAGATGC TTGTGAGAAC TGGGGTTTCT TTGAGGTAAA AATGCTAGCT121 ATTTTTTTAA TGTTATAGCA CATTATTTTC TTTTGGCACG GTGATTATGG TGCTTATCTT181 AACAAAAACA AAAATTGGCA GCTTGTGAAT CATGGTATAG CCCCTGAGTT TATGGACAAA241 ATAGAGAGGA TGACAAAAGA GCATTACAGG AAGTGCATGG AGCAGAGGTT

28、 CAAAGAGCTT301 GTTGCAAGCA AAGGTTTGGA AGCTGTTCAG ACAGAGGTCA GTGACATGGA TTGGGAAAGC361 ACTTTCTTCT TGCGCCACCT TCCTGTTTCT AACATATCAG AGATTCCAGA TCTCCATGAT421 GATTACAGGT ATTATTTTCC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAT TCCCAGATAT CTAAAATGTT481 GATAAATCAT ACACAATGCA GAGTTCTAAA AAAGAAATCC AAAAAATTAA TTTTCTACAG541 GAAAGCGAT

29、G AAGGAATTTG CTTTGAAATT GGAGACACTA GCTGAGGAAC TACTAGACCT601 GTTATGTGAG AATCTTGGAC TTGAAAAAGG GTATCTGAAA AAGGCCTTCT ATGGATCAAA661 AGGTCCAACT TTTGGAACCA AGGTGAGCAA TTATCCACCA TGCCCAAAAC CGGAGTTGAT721 CAAAGGTCTC CGAGCCCACA CAGATGCAGG TGGCATCATC TTGCTGTTCC AGGATGACAA781 AGTCAGCGGC CTCCAGCTAC TTAAGGATGG

30、TCAATGGATT GATGTCCCTC CTATGCGCCA841 CTCCATTGTA GTCAACCTTG GCGATCAACT TGAGGTAAGC CCTCCATGTT TTAATAAACA901 AATCCAACTC CAAATTAAAA TTTGTCTTTT TATTTTTTTT AATACCCCAA AAAAACAAAG961 ATAGTGAAAA TCTGAACTAT GAAAAATATG TTTTTTACAG GTTATAACAA ATGGGAAATA1021 CAAGAGTGTA GAACACAGAG TGATTGCACA AACAAATGGT ACCAGAATGC C

31、CATAGCTTC1081 ATTCTACAAC CCCGGTAGTG ATGCTGTTAT TTACCCTGCA CCAGTCCTTG TCGAGAAAGA1141 AGCAGAGGAG AAGAAGCAAG TTTACCCAAA ATTTGTTTTT GAAGATTATA TGAAGCTTTA1201 TACTGCGTTG AAATTCGAGC CCAAAGAGCC AAGGTTCAAA GCCATGAAAG CAGTGGAAAC1261 TAATGTTGGT TTGGGTCCAA TTGCTACAGC TTAA图8 狗头枣ACO基因的核苷酸序列Fig.8 Nucleotide sequence of ACO gene from Goutou jujube下划线核苷酸为PCR引物；阴影处为内含子序列；其余为外显子序列The portion