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1、广东工业大学生化分离技术Doc1下游技术 第一章 提取与沉淀分离技术 v 生物大分子是指在生物体内存在的具有特殊生物学功能的高分子化合物，主要包括蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。v 提取的概念：在一定的条件下，用适当的溶剂（溶液）处理原料，使欲分离物质充分溶解到溶剂（溶液）中的过程。也叫抽提。提取液-固提取 液-液提取（萃取） 细胞破碎v 定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜v 目的：破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。v 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。 细胞壁结构对破碎的影响 细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 不同细胞壁的结构和

2、组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。 几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围； 使细胞具有一定的形状和强度。 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。*（细胞破碎方法 机械破碎法 高速组织捣碎机 匀浆器 研磨器物理破碎法 化学破碎法 酶学破碎法（物理破碎法的分类温度差破碎法 把待破碎的样品通过温度的反复变化而使细胞破碎。 压力差破碎法：通过压力的变化，使细胞内与细胞外所受的压力不同，而使细胞破碎

3、。超声波破碎法 通过超声波的作用，使细胞结构解体，而使细胞破碎。v 化学破碎方法 化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。 常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。 十二烷基硫酸钠：SDSv 酶学破碎方法 酶学破碎方法：利用溶解细胞壁的酶(外加的或细胞本身存在的酶)处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞膜 分为：外加酶制剂和自溶法。 但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。原其细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯

4、合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。提取方法1. 盐溶液提取法盐溶：在低浓度盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析：当盐浓度达到某一界限后，蛋白质的溶解度随盐浓度升高而降低。2. 酸溶液提取法3. 碱溶液提取法4. 有机溶剂提取法常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇等。v 影响提取的因素（P8） 1. 溶解度2. 扩散速度3. 温度4. pH值 5. 提取液的体积等电点：在某一个特定的pH值条件下，分子上所带的正、负电荷相等，净电荷为零，此时的pH值即为该分子的等电点。蛋白质在等电点下溶解度最小第三节 沉淀分离生物大分子的分离方沉淀分离盐析沉淀法 等电点沉淀法 有机溶剂

5、沉淀法 金属盐沉淀法 复合沉淀法 选择性变性沉淀法层析分离电泳分离超离心分离v 沉淀分离的定义：通过改变某些条件或添加某种物质，使某溶质在溶液中的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离。v （P10）1. 盐析原理：蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。在某一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到彼此分离的目的。 反离子作用改变了蛋白质分子表面的电荷。离子的存在使蛋白质的水化膜改变。v 盐的选择 蛋白质和酶的盐析通常采用中性盐。 其中在实际中应用最广的是硫酸铵（因为硫酸铵有温度系数小而溶解度大的优点，并且硫酸铵分段盐析效果比其它盐好，不易引起蛋白质变性。）v 盐析

6、时的注意事项1. 添加的硫酸铵的纯度要高。并要使其充分溶解。2. 在同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法。3. 盐析操作一般可在室温下进行，而某些对热特别敏感的酶，则应在低温条件下进行。4. 选择适当的蛋白质浓度，避免共沉淀作用。5. 沉淀要脱盐纯化。v 等电点沉淀法 沉淀原理：利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同的等电点这一特性，将不同蛋白质进行分离。 在实际使用时等电点沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。 加酸或加碱调节pH值过程中，要防止局部过酸或过碱。v 、 有机溶剂沉淀法 沉淀原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离

7、。 优点：分辨力比盐析法好，溶剂容易除去且可回收。 缺点：易使蛋白质和酶变性操作要点有机溶剂：常用乙醇和丙酮 温度：低温 离子强度：加入盐（减少蛋白质变性，提高分离效果） 的 浓度不宜太高第二章 过滤与膜分离技术的定义 粗滤和部分微滤采用高分子膜以外的物质作为过滤介质，称为非膜过滤，简称为过滤。 大部分微滤以及超滤、反渗透、透析、电渗析等采用各种高分子膜为过滤介质，称为膜过滤，又称为膜分离技术。 . 加压膜分离1） 微滤2）超滤3）反渗透电场膜分离2） （1）电渗析 离子交换膜电渗析第三章 萃取分离技术v 萃取分离原理：组分在两个互不相溶的液相中的溶解度不同。v 萃取分离特点：简便 、快速、应

8、用广v 萃取是生物分离中常用的单元操作 v 分配系数 衡量萃取体系是否合理的重要参数：ky/x Y-平衡时溶质在轻相中的浓度 X-平衡时溶质在重相中的浓度 双相萃取 利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法 可以构成双水相的体系有： 离子型高聚物非离子型高聚物 聚乙二醇葡聚糖 高聚物相对低分子量化合物 聚乙二醇硫酸铵v 超临界流体萃取v 超临界流体：当一种流体处于其临界点的温度和压力之下，则称之为超临界流体。v 特点：密度接近液体萃取能力强 粘度接近气体传质性能好 扩散系数大，是液体的近100倍。v 正是由于超临界流体具有的密度高、粘度小、扩散系数大、介电常数大等特点，因此具有

9、很好的萃取能力。 v 超临界二氧化碳萃取 临界点： T：304.1 K P：73.8 bar 优点： 临界条件温和 产品分离简单 无毒、无害 不燃 无腐蚀性 价格便宜v 反胶束萃取 表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体 当表面活性剂浓度超过临界微团浓度时，表面活性剂会在水溶液中形成聚集体 胶团和反胶团 反胶团： 表面活性剂的极 性头朝内，疏水 的尾部向外，中 间形成极性的“核”第四章 层析分离技术 层析分离原理：是利用混合物中各组分的物理化学性质的不同，使各组分以不同程度分布在两相（流动相、固定相）中。当流动相流过固定相时，各组分以不同速度移动，而达到分离。v 吸附层析定义：利用吸附剂

10、对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各组分分离的方法。v 吸附剂：凡能够将其他物质聚集到自己表面的物质，都称为吸附剂。 吸附剂与被吸附物分子之间的相互作用是由范德华力所引起的，其特点是可逆的。0洗脱方法与洗脱曲线 洗脱方法：（一）溶剂洗脱法（目前应用最广泛的方法）（二）置换法（三）前缘分析法v 洗出顺序：纯溶剂 吸附力最弱的组分 吸附力由弱到强的组分分别洗出 吸附力最强的组分 缺点：1. 在某些组分的吸附力相差不多 时，会出现两峰重叠或界限不 清的现象。 2.有“拖尾”现象。（解决方法：采用梯度洗脱法） 前缘分析法 洗出顺序：样品溶液的溶剂 吸附力最弱的组分 吸附力由弱到强的组分依次洗出 吸附

11、力最强的组分v 聚酰胺薄膜层析原理v 聚酰胺薄膜层析利用聚酰胺与各种极性分子产生氢键吸附能力的不同而将各组分分离。v 聚酰胺薄膜层析只适用于极性分子的分离。v 双向展开法的定义 如果样品且分较多，有一种溶剂不足以将全部组分分开，则可以在展开后将滤纸转动90O，再用另一种溶剂进行第二向展开，这称为“双向展开法”第二节 分配层析v 分配层析的原理 原理：分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。 分配系数：是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值。 通式在分配层析中展开方法（按溶剂在滤纸上的流动方向不同来分）1. 上行法： 将滤纸点样的一端向下浸入溶

12、剂中。2 . 下行法： 将滤纸点样的一端朝上浸入溶剂中（在层析缸上有一盛有展开剂的液槽） 。3. 环行法：（又叫水平法） 溶剂由滤纸条引向圆心，然后由圆心向四周扩散。双向展开法双向展开法也可分为上行法和下行法。薄层层析展开v 在密闭容器中进行v 展开方式与纸层析一样，但软板薄层只能近水平展开。v 分配薄层层析展开剂的选择与纸上层析相似，吸附薄层层析展开剂的选择与吸附柱层析的洗脱剂相同。色谱法：以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法。定义：担体是一种多孔化学惰性固体，在气相色谱中用来支持固定液v 性能要求：表面积大，

13、无吸附能力或吸附能力很弱。v 常用担体：硅藻土担体 三 气相层析（气相色谱） 定义：以气体作为流动相的一种层析方法。 气相色谱的特点1. 高灵敏度：可检出10-10g的物质2. 高选择性：可有效地分离性质极为相似的各种同分异构体和各种同位素3. 高效能：可把组分复杂的样品分离成单组分4. 分离速度快：一般只需几分钟即可完成5. 应用范围广：既可分析低含量的气、液体，又可分析高含量的气、液体，可以不受组分含量的限制6. 所需试样量少：一般气体用几毫升，液体样用几微升或几十微升 v 色谱柱的老化v 老化的目的：1.彻底除去填充物中残余溶剂和某些挥发性杂质。2. 促进固定液均匀的、牢固分布在担体的表

14、面上。v 老化的方法：通入载气，以略高于操作柱温而低于固定液最高使用温度的条件下处理十几至几十小时。直至基线平直。载气的选择：v . 用热导池检测器时，选择氢气或氦气（热导系数大）；2. 用氢焰检测器时，选择氮气；3.采用较低载体流速时，选择分子量大而扩散系数小的气体（氮气等），反之，选择分子量小而扩散系数大的气体（氦气等）。v 峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高。用h表示。v 峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积，用A表示。组分量与峰面积的关系m = fA = A/S 峰面积的测量方法 几何近似法（适用于对称峰）A = 1.065 hb 高效液相色谱优点： 分辩率高于其它色谱法；速

15、度快，十几分钟到几十分钟可完成；重复性高；高效相色谱柱可反复使用；5 自动化操作，分析精确度高。 v 液相色谱特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物。离子交换层析的优缺点v 优点：1. 处理量大、操作简单、价格低廉2. 具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件使可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活离子交换层析的应用v 离子交换层析技术在生物化学及临床生化检验等领域主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。 . 离子交换剂的选择最首要是要保证被分离物质的生物活性。 2. 分离阳离子用阳离子交换剂；分离阴离子用阴离子交换剂。 3.两性电解质

16、生物大分子，在高于其等电点的pH条件下，因带有负电荷，应采用阴离子交换剂，在低于其等电点的pH下，则采用阳离子交换剂。 梯度洗脱法 梯度洗脱法是采用一定变化的洗脱液进行洗脱的方法。可选用浓度梯度和pH梯度。 梯度洗脱分为: 连续梯度洗脱 阶段梯度洗脱第五章电泳技术电泳（纸电泳薄层电泳薄膜电泳凝胶电泳等电聚焦电泳v 定义：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程叫电泳。v 电泳的基本原理：P1031. 带电粒子在电场中会向着与自身所带电荷相反的电极移动。2. 在电场中，各种带电粒子的移动速度不同。电泳的支持介质（补） 在电泳中，采用支持介质的目的是防止电泳过程中的对流和扩散，以使

17、被分离组分得到最大分辨率的分离。固体支持介质v 纸、醋酸纤维素薄膜 （醋酸纤维素薄膜电泳的优点1. 电泳后区带界限清晰；2. 简便快速（20min1h)；3. 对蛋白质和染料均不吸附;样品用量少、应用范围广）、硅胶等 淀粉凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶基于分离组分的电荷密度 基于分离组分的电荷密度及分子大小v 泳动度（迁移率）P103v 定义：电泳迁移率是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。v 泳动速度的影响因素P1041. 带电颗粒的性质（所带净电荷量、自身形状和大小）。2. 电场强度 3 溶液的pH值 4 溶液的离子强度：离子强度越大，泳动速度越慢。电渗 5温度及缓冲液粘度v 电渗P10

18、4 电渗的定义：在电场中，液体对一固体支持物的相对移动。电渗的解决方法：用中性物质糊精、蔗糖或葡萄糖等与样品同时做纸层泳，然后将其移动距离从实验结果中除去。纸电泳是以滤纸为支持体的电泳技术。v 纸电泳（特点常压纸电泳设备简单，适用于大分子物质的分离，但速度慢，区带易扩散高压纸电泳速度快，适用于小分子物质，但发热量大缓冲液的作用(补)1. 使电流得以流动 2维持一定的pH过程1点样。电泳。显色。第五节 凝胶电泳P109 凝胶电泳是以各种具有网状多孔结构的凝胶为支持物的电泳技术。凝胶电泳特点。同时具有电泳和分子筛的双重作用，有很高的分辨力凝胶电泳的支持介质（特点1. 淀粉凝胶：重现性差，分辨率低，

19、电泳时间长2. 琼脂糖凝胶：有较高的机械强度；无毒；染色与脱色简单快速。但有电渗；凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离大分子核酸。3. 聚丙烯酰胺凝胶：是凝胶电泳常用的支持物。普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳(连续凝胶电泳 不连续凝胶电泳（样品胶、浓缩胶、分离胶 梯度凝胶电泳 SDS-凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶的制备原理v 单体：丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和缓冲液v 交联剂：N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，简称Bis) v 催化剂：过硫酸铵-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetramethyl

20、 ethylenediamine，简称TEMED) 不连续胶样品胶(上层):大孔胶、TrisHCl缓冲液、pH值6.7 浓缩胶(第二层):大孔胶、TrisHCl缓冲液、pH值6.7 分离胶(第三层): 该层为小孔胶、TrisHCl缓冲液、pH值8.9。 上下两电泳槽中:Tris甘氨酸缓冲液，pH值8.3。 连续凝胶电泳：制胶快而简单，pH值恒定，对分离pH值敏感的化合物有帮助。但分辨率较低v 不连续凝胶电泳：操作较繁杂，但可以得到电泳分离最重要的指标高分辨率（有三种效应:浓缩效应、电荷效应、分子筛效应）三、SDS-凝胶电泳原理(SDS-polyacrylamide gel electropho

21、resisSDS-凝胶电泳中各种蛋白质的迁移率与蛋白质原有的电荷和分子形状无关，而只决定于蛋白质的分子量。不连续凝胶的制备。1.玻璃板洁净干燥2.注入分离胶制备液3.在分离胶上方加一薄层水4.分离胶聚合后，吸去水5.注入浓缩胶6.在上方加一薄层水7.聚合后吸去水8.注入样品胶染色与固定1. 氨基黑染色2. 考马斯亮蓝染色（最常用） 注意:考马斯亮蓝不能用于染色滤纸、醋酸纤维素薄膜第六节 等电点聚焦电泳基本原理定义：利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。电泳的对象：只限于蛋白质和两性分子。电泳的条件：凝胶中有稳定的、连续的和线性的

22、pH梯度。两性电解质载体常用多乙烯多胺与丙烯酸反应制备密度梯度溶液： 最常用的密度梯度溶液溶质是蔗糖。1. 凝胶：最常用的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶。2. 实验1-2思考题3. 1. 此实验中酶的提取之前是否需要细胞破碎?2. 此实验中为何Tris-HCl缓冲液有两种不同pH值?各有什么作用?3. 考虑提取中的各种试剂的用途,各步操作的目的第六章 离心分离技术超速离心机测定沉降系数沉降系数）在单位离心力作用下的沉降速度 1S等于10负13次方秒v 等电点聚焦的优点1. 分辨率高；2. 随着电泳时间的增加，区带越来越窄；3. 不管样品在什么部位，都可以聚集到其等电点位置；4. 很稀的样品都能分离，且重现性好；5. 可测定蛋白质或多肽的等电点离心方法常速离心高速离心超速离心 差速离心 密度梯度离心 等密度梯度离心