DNA测序常见问题及其分析.docx

1、DNA测序常见问题及其分析测序常见问题及其分析Collected by RobertoRun,12.10.2008(From: HTUTUUUTTH)1、PCR产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1图1-2解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行

2、PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。问题图3（测序引物有碱基缺失）测序引物有碱基缺失（一般是引物的5端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。3、样品有杂合/突变位点模

3、板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重叠峰(如图中箭頭所示)。解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序。4、poly A/T和C/G cluster导致的套峰和测序信号衰减图4-1图4-3图4-4RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。C/Gcluster在PrV基因组测序时遇到过。后来还是让TaKaRa公司给解决了，虽然不喜欢鬼子

4、，但有时候却不得不用它们的产品和服务。5、基因中含有重复序列可能的原因:样品中含有重復序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样，会导致Frame滑动，较短的重復序列会导致测序结果出现移码；而较长的重復序列会使定序信号衰减。解决办法:反向测序有时能够顺利的通过重復序列区域(但不是一定都能够)，通过多次的测序结果比对，拼接可以得到全序列结果。TT测序结果常见的几个问题TT(From: HTUTUUUTTH )1 、 为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别?这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-5

5、0 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。 2 、 为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂?由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。 3 、 测序结果怎么找不到我的引物序列?如果找不到测序所用的引物序列。这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方

6、向如果是反的，此时需找引物的互补序列。 4 、 测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点?可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。 5 、 你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事?首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是

7、否一致。 6 、 序列图为什么会有背景噪音(杂带)?是否会影响测序结果?序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。 7 、测序 结果为什么与标准序列有差别？原因可能有： 样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。当然尽管我们有时做了最大努力，但还是保证不了和文献序列完全一致，但我们测序报告是客户样品序列的真实结果。 8 、 PCR 产物测序与克隆后测序序列为什么有差别?PCR 产物克隆到载体中进行测序，有两个方面可能序列有变化：首先， P

8、CR 扩增过程中可能产生错配。将片段克隆到载体中也有可能发生突变；其次，测序的准确率并非100%。 9 、 有杂合位点，但你们的报告上看不到杂合的信号！如果在您认为应该出现杂合信号的位置上只出现单一的信号，那么可能是您样品突变的模板与正常的模板的比例没达到可以测出的浓度。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很低，仪器会自动将它作为背景信号了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在。其次，在同一位置，不同碱基的信号强度一般是不一样的，这样即使突变的模板所占的比例较高时，也不一定能准确检测到突变的存在，因为，测序仪

9、是主要用来测序正常的碱基序列的，软件分析结果时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。尊重结果，我们是不会人为将出现单一的信号修改为杂合位点的。 10 、 DNA 测序样品用 TE 溶液溶解好不好?由于 EDTA 是 Taq 聚合酶的一种潜在的抑制物, DNA 的测序反应也是 Taq 酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件,因此 DNA 测序样品溶解时，最好用灭菌水溶解。 11 、 我送什么形式的菌体样品好?菌体的一般形态有、菌液，平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌等。我们建议客户所送的形态以方便且不易受污染为准则，推荐穿刺培养菌。 上海客户用过夜培养好的菌液2 ml 。

10、12 、 为什么你们给我的序列是反的?测出来的结果与您预期的方向并不一致,可能是片断插入方向是非定向的，这在 PCR 产物 T/A 克隆中较常见。有时，客户要求的测序引物离克隆位点较近，如果反向引物相对克隆位点较远，为得到更好的结果，我们会选择反向引物测序，若是这种情况，用看图软件 Chromas 可以把图反转过来，就可得到正向序列。 13 、 Template mixed 为何种情况?测序结果表现为套峰，测序反应信号很好，测序结果杂乱,即同一个位置有二个峰。原因可能有：样品并非单一模板、 PCR 产物中有杂带、质粒为双克隆产物、引物特异性不高，有两个结合点， PCR 产物电泳时看不出，但测序

11、结果能清楚地说明这点。 14 、 polyT 或 polyA 后峰图杂，怎么也要收费?这种情况一般表现为 A 、 T 连续结构后面的测序结果出现套峰，是样品的内在原因。这类问题我们应该同正常测序一样，给客户报告，反应按正常收费。 15 、 我的引物做 PCR 条带很好，但为什么测不出序来？并不是能做 PCR 反应的引物都能测序，测序所用引物要求较高,必须与模板完全匹配（有时 5 端可以有个别碱基的简并），引物长度一般为20个碱基左右、 GC 含量适中，而且用于测序的引物一定要足够纯。 16 、如果 我的菌种培养得很好，测序应该不会有问题吧?对于宿主菌，提倡使用宿主菌 DH5 ， DH1 、 和

12、 C600 E.coli 菌株也可， XL1-Blue E.coli 菌株也不错，但其生长过慢。 JM 系列、 TG1 系列和 HB101 系列 E.coli 菌株等由于产生大量的碳水化合物（即糖），而应当尽量避免使用；其它宿主菌可能会对测序造成影响。 17 、 为什么 G/C rich 的样品没结果或结果不好，照常收费?由于 G/C 连续结构有时会造成反应中途无法正常进行，如果结构在引物下游近处，反应只有一小段的信号，有时甚至反应根本没信号。对于这种情况，本身就潜在不确定性的测序，有很大的失败因素。 18 、 PCR 产物150 bp 以下的为什么不适于直接测序?PCR 产物 150bp 以

13、下的纯化和定量都有一定困难，用于测序的 PCR 产物一般不低于150 bp 长度。一个150 bp 的 PCR 产物用于测序，去掉两个引物的序列大约40到50 bp ， 再加上测序起始端的一些读不好的碱基，真正能够得到的有用序列不过几十碱基。这只是最理想的假设，这么短片断测序失败的几率非常大，因此只能克隆后再进行测序。 19 、 我的质粒样品很好，测序结果怎不好?由于原因不明的复杂结构如发卡和回文结构，有时会出现突然信号减弱或消失；有时测序根本不能进行下去， DNA 碱基排列并无特别异常，可能是 DNA 整体出现复杂结构，反应无法进行。 20 、 我的样品还保留了吗?我想现在反向再测一个反应。

14、出于保密原则我们测序样品只保留一个月，所以若要再测序，请抓紧时间，否则只有重新送样。 21 、 已经测通了样品，但重叠的地方有错配，是为什么?测通的全序列是拼接后的结果，由于拼接处一般是在一次测序的末端和次个反应开始一段，通常会有一定的杂带，以序列信号好的为主，次的为参考，但也不绝对。 常见峰图及原因说明(From: HTUTUUUTTH )1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？2. 什么是碱基缺失？3. 什么是引物不纯？4. 重复结构对测序有哪些影响？5. 什么是模板不单一？6. Poly结构的测序结果是怎样的？7. 含有回文结构的模板测序结果是怎样的？8. 测序峰图为前双

15、峰的结果是什么样的？9. 测序峰图为后双峰是什么样的？10. 无信号的结果：信号值(ATGC的平均值)皆小于10011. 飘峰：这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移12. 没有任何干扰的结果Q-1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是，高质量的PCR产物才可能得到高质量的测序结果，如果您对PCR产物的纯度不很确定，希望您可以将PCR产物进行克隆处理，以

16、确保得到好的测序结果。以下图为例：该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。解决办法：改变PCR条件，重新扩增。或者可以将该PCR产物克隆到质粒中，初步筛选后进行单克隆测序。 Q-2.什么是碱基缺失？ A-2.以下图为例：碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段，上图的186位缺失两个连续的T解决方法：(1) 使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的。或者将该PCR产物克隆到质粒中，挑取单克隆测序。(2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可以改变PCR反应条件，重新扩增。Q-3.什么是引物不纯？ A-3.以下图为例：引物不纯造成移码现象，该种

17、现象与模板杂在峰图都表现为背景峰较杂，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前或者后都有一个同一碱基的小峰。解决办法：重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。Q-4.重复结构对测序有哪些影响？ A-4.以下图为例：重复结构将导致测序复制框的滑移，重复结构之后峰型混乱。解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该重复结构处，即可完成模板全长的拼接。Q-5.什么是模板不单一？ A-5.以下图为例：(1) 菌液为非单克隆：下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰（插入后双峰），即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。解决办法：重新挑取

18、单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。(2) PCR产物不纯，如下图所示：在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp位置有一个高高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。注：PCR产物测序都是以A高峰终止。解决方法：对PCR产物切胶纯化，再进行测序。Q-6.Poly结构的测序结果是怎样的？ A-6.以下图为例：以polyT为例，在polyA/T结构之后往往出现移码、双峰、套峰现象，而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减或者直接中断。解决办法：使用反向引物对

19、模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。如果是较长的PloyG/C，建议客户使用3.0试剂盒进行测序。Q-7.含有回文结构的模板测序结果是怎样的？ A-7.以下图为例：位点94至137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。解决方法：使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。A-8.测序峰图为前双峰的结果是什么样的？ A-8. (1) 产物中含有小片段PCR产物；(2) 引物有两个结合位点，其中一个结果中断解决方法：换引物反向测序。Q-9.测序峰图为后双峰是什么样的？ A-9.原因和解决方法同回文结构及插入后双峰。Q-10.无信

20、号的结果：信号值（ATGC的平均值）皆小于100A-10.以下图为例：测序无信号的判定：在确认引物、质粒抽提浓度、反应安排等条件无问题的情况下，测序结果峰型杂乱且信号值小于100的结果；此时则判定结果为测序无信号。两次测序无信号，我们会取消实验。Q-11.飘峰：这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移 A-11.以下图为例在用特殊试剂盒（3.0）时，会发生碱基替代，从而出现碱基位移的现象，即飘峰。解决方法：用普通试剂盒（3.1）测序消除碱基位移。注：3.0试剂盒只对局部高GC有效，对POlyA/T、重复结构（GT/GA等）无效，建议先用3.0试剂盒测序，然后用普通试剂盒进行纠正。

21、Q-12.没有任何干扰的结果 A-12.DNA 测序常见问题解答（FAQs）(From : HTUTUUUTTH )DNA 测序常见问题解答（FAQs）Q1. DNA测序的原理是什么？步骤如何？ABI 3730XL型测序仪测序的准确度如何？Q2. 为什么在测序报告上找不到我的引物序列？ Q3. 我有一个大于2KB的PCR片段，希望你们帮我测通。 Q4. 为什么我的PCR片段为300bp，而你们发送给我的序列却达到了700多bp？ Q5. 我的引物做PCR效果很好，为什么用于测序总得不到好的结果？ Q6. 我进行PCR反应时，所用的退火温度是59，是否可以用该温度对我的样品完成测序反应？ Q7.

22、 我的PCR扩增产物有多条带，是否可以为我完成切胶纯化，再进行测序反应？哪些情况下需要进行切胶纯化？ Q8. 我的PCR产物为单一条带，但未经纯化，是否可以直接送到贵公司进行测序？ Q9. 我的PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ Q10. 什么是碱基缺失？ Q11. 什么是引物不纯？ Q12. 重复结构对测序有哪些影响？ Q13. 什么是模板不单一？ Q14. poly结构的测序结果是怎样的？ Q15. 含有回文结构的模板测序结果是怎样的？Q1. DNA测序的原理是什么？步骤如何？ABI 3730XL型测序仪测序的准确度如何？答：DNA测序的原理是末端终止法。具体步骤如下：定

23、量：对样品及引物进行定量。测序反应：在反应体系中加入已定量的模板和引物，BigDye等试剂，PCR仪上完成测序反应。读取数据：利用测序仪读取被测样品的碱基序列。ABI公司目前承诺测序结果在800bp以内准确率为98.5%。Q2. 为什么在测序报告上找不到我的引物序列？答：1） 如果您提供的是PCR样品，在测序报告上找不到您的引物序列是正常的。这是因为测序反应是通过对被荧光标记的ddNTP的读取而获得基因序列的，而测序引物由于没 有荧光标记，因此自然在测序结果中就不会被识别。实际上不但测序引物无法识别，而且由于目前测序技术的局限性，紧靠测序引物一侧的3050个bp通常也无法100识别，如果需要验

24、证这个区域的碱基序列或者测序引物本身的序列，就需要用另一侧引物进行反向测序。2 ）您提供的是质粒或菌液样品,使用通用引物测序，找不到您的PCR引物可能是因为您的PCR引物距离载体的通用引物位点过近，由于测序反应在距离起始位点30-50bp内的结果可信度不高，因此会影响您正确读取您的PCR引物序列。Q3.我有一个大于2KB的PCR片段，希望你们帮我测通。答：对于片段较大的PCR样品我们建议您将其克隆进载体后再做测序。因为，一方面PCR产物的纯度不是很好掌握，测序的成功率不如质粒和菌液测序；另一方面，与PCR引物相比，一般载体上的通用引物与模板结合的能力更强。长度为1Kb的DNA模板需要两个测序反

25、应，才有可能得到完整准确的读长，对于1kb以上的DNA片断，在两个反应后还需要设计合成测序引物，测序后拼接出全长，对于这些测序引物，我们将按碱基个数收取引物合成费用。Q4.为什么我的PCR片段为300bp，而你们发送给我的序列却达到了700多bp？答：如果您查看峰图的话，可以在您的PCR序列终止处看到一个高高的A峰，该A峰是您的PCR测序反应的结束标志，在此标志之后的序列是噪音，而不是您的测序结果。因为我公司完全忠实于测序结果，不会对测序结果进行人为修改。所以在您收到结果时，请结合我们的DNA测序服务报告查看测序峰图，按照您的实验要求对测序结果进行分析。Q5. 我的引物做PCR效果很好，为什么

26、用于测序总得不到好的结果？答：用于测序的引物比用作PCR反应的引物要求高，以下是不适合用于测序反应的引物类型：不纯的引物：用于测序的引物纯度要求很高，合成中的小片段会直接造成严重的背景峰。用于测序的引物序列长度之所以一般在24个碱基之内，就是因为过长的引物纯度不易保证。简并引物，随机引物和有特殊标记的引物都不适合DNA测序。Q6. 我进行PCR反应时，所用的退火温度是59，是否可以用该温度对我的样品完成测序反应？答：非常抱歉，目前我公司不会单独对客户的测序反应设定特定的条件，全部的测序反应均在统一的条件下完成。Q7. 我的PCR扩增产物有多条带，是否可以为我完成切胶纯化，再进行测序反应？哪些情

27、况下需要进行切胶纯化。答：目前我公司通常只接收单一条带的PCR产物，一般不提供切胶纯化服务。如果老师自己实验室的确无法完成切胶工作，在同意交付25元/条带的服务费后，我公司可以提供此项服务。PCR产物电泳检测后发现以下情况之一时，建议进行切胶纯化：1） 除主带外，还存在其他条带；2） 引物二聚体在过柱纯化后还大量存在，将影响测序结果；3）体系中盐分在过柱纯化后还影响测序结果。Q8. 我的PCR产物为单一条带，但未经纯化，是否可以直接送到贵公司进行测序？答：可以。我公司将免费为您进行PCR产物的过柱纯化，目的在于去除PCR反应体系中的大部分小片段、剩余dNTP及大部分的盐分。Q9. 我的PCR产

28、物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？答：PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是，高质量的PCR产物才可能得到高质量的测序结果，如果您对PCR产物的纯度不很确定，希望您可以将PCR产物进行克隆处理，以确保得到好的测序结果。以下图为例：该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。解决办法：改变PCR条件，重新扩增。或者可以将该PCR产物克隆到质粒中，初步筛选后进行单克隆测序。Q10.什么是碱基缺失？答：以下图为例：碱基缺失常见在PC

29、R产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段，上图的186位缺失两个连续的T。解决方法：1) 使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的。或者将该PCR产物克隆到质粒中，挑取单克隆测序；2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可以改变PCR反应条件，重新扩增。Q11.什么是引物不纯？答：以下图为例：引物不纯造成移码现象，该种现象与模板杂在峰图都表现为背景峰较杂，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前或者后都有一个同一碱基的小峰。解决方法：重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。Q12.重复结构对测序有哪些影响？答：以下图为例：重复结构将

30、导致测序复制框的滑移，重复结构之后峰型混乱。解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该重复结构处，即可完成模板全长的拼接。Q13.什么是模板不单一？答：以下图为例，下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。对于PCR产物也同样有模板不单一的情况，如下图所示：在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp位置有一个高高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为2

31、00bp左右的小片段。解决方法：对PCR产物切胶纯化，再进行测序。Q14. poly结构的测序结果是怎样的？答：以下图为例：以polyT为例，在polyA/T结构之后往往出现移码现象，而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减。解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。Q15.含有回文结构的模板测序结果是怎样的？答：以下图为例：位点94至137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。解决方法：使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。手把手教您看测序图(From: HTUTUUUTTH )一般来说，我们只需把测序序列结果和原有的目的序列结果进行比对（Blast）就行了，如果序列百分之百吻合，或者所需要的突变点（片段）成功突变或插入片段成功插入，就OVER了。关键是测序结果有时候模怜两可，需要我们自己来把