海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析本科毕业论文.docx

1、海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析本科毕业论文河北农业大学本科毕业论文论文题目 海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1 的克隆 与生物信息学分析 材料目录：1、任务书 （ 1 ）份2、开题报告 （含文献综述） （ 1 ）份3、指导教师评阅书 （ 1 ）份4、答辩记录表 （ 1 ）份5、论文正文 （ 1 ）份6、其它材料专业名称农学论文题目海岛棉抗黄萎病基因GbEDS1 的克隆与生物信息学分析题目来源国家自然科学基金目的意义： 我国目前推广的棉花品种抗黄萎病性能差，不能满足市场的需要。因此，培育抗黄萎病棉花品种，是当前棉花育种迫切需要解决的问题。近年来，植物发育生物学研究取得了

2、突飞猛进的发展，许多重要的发育机制在分子水平上得以阐明，这就为利用遗传工程的方法改造植物生长发育过程奠定了基础。抗黄萎病基因的研究能为品种改良提供依据，具有显著的学术理论价值和潜在经济价值。本研究利用RT-PCR和RACE技术从海岛棉克隆抗黄萎病相关基因EDS1的cDNA及开放阅读框序列（Open reading frame，ORF），并通过生物信息学分析，以预测该基因在棉花抗黄萎病过程中所起的作用，为基因功能验证提供理论依据。可行性分析： 1、研究条件 课题组已有利用电子克隆方法、RT-PCR和RACE技术，从棉花中克隆出抗黄萎病相关基因的先例，并对基因进行了表达特异性分析、原核表达分析。同

3、时课题组成员熟练掌握分子生物学理论基础和实验技术、生物信息学的应用因此，具备开展基因克隆技术和条件。本实验室为河北省重点学科作物遗传育种实验室和河北省作物种质资源重点实验室，具有先进的仪器设备条件，完全能够满足本研究的需要。因而在人员和仪器设备条件方面也是可行的。2、预期结果 获得GbEDS1基因cDNA全长2190bp，开放阅读框长1848bp。 对该基因进行生物信息学分析预测其功能并为其功能的研究奠定理论依据。3、可能存在的问题从棉花样品中高效地提取完整的RNA，由于其植物体内多糖多酚含量高，给提取带来难度。进度安排： 2013.3.1-2013.3.15: 查找国内外相关文献，学习与本试

4、验有关的实验技术，制定实验方案。2013.3.15-2013.3.25：提取棉花总RNA，获得质量较高的RNA，进行cDNA的片段合成。2013.3.25-2013.4.25：设计并合成相关引物，扩增棉花相关基因GbEDS1及全长ORF，克隆并测序。2013.4.25-2013.5.10：对基因进行生物信息学的分析，从而预测基因的功能。2013.5.10-2013.5.30：整理实验材料，撰写论文，准备答辩。 专家意见：专家签字：年 月 日学院意见:院长： 年 月 日 农 学院 农学 专业 刘通 学生：现把 2012-2013 学年，第 二 学期的毕业论文安排下达给你，你本学期承担的毕业论文任

5、务如下：1、依据本任务书中论文题目、目的意义、可行性分析的内容完成开题报告。2、按照开题报告的要求按期完成毕业论文各项工作的实施。3、完成毕业论文的撰写。4、完成毕业论文的答辩。 请按相关要求完成毕业论文任务。教师签字： 2012年5月4 日河北农业大学本科毕业论文开题报告题 目： 海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克 隆与生物信息学分析 学 院： 农学院 学生姓名： 刘通 专 业： 农学 班级学号： 2009014010216 指导教师姓名： 张艳 指导教师职称： 讲师 2012 年 6 月5 日学生姓名刘通专业班级农学0902学 号2009014010216指导教师张艳职 称讲师所在学院

6、农学院论文名称海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析选题依据： 理论依据 本研究根据不同物种的EDS1核酸保守区域设计简并引物，利用RT-PCR和RACE技术从海岛棉克隆抗黄萎病相关基因EDS1的cDNA及开放阅读框序列（Open reading frame，ORF），并利用生物信息学软件分析序列特征特性。目的意义棉花是世界上重要的经济作物，据估计，棉花创造的年产值达1800-2000亿美元，全世界有18亿人口以种植棉花为生1。棉花在整个生长过程中都受到病害的威胁，而黄萎病是棉花病害中对生产和产量威胁最大、危害最重的病害。棉花黄萎病（Verticillium wilt）是一种

7、土传真菌性病害，由于其寄主广泛、土壤传播快、抗逆性强和变异性大等特点，已经成为棉花生产上第一大病害2。随着植物抗病机理研究的不断深入和基因工程手段的运用，通过向棉花中定向导入外源抗病基因以提高棉花对黄萎病的抗性，创造新的抗病种质已经成为防治黄萎病的有效途径3, 4。EDS1（enhanced disease susceptibility 1）基因在1999年被首次克隆5, 6，研究表明，EDS1是烟草中RPS4调节的过敏反应HR所依赖的一个信号元件7；番茄中Ve1介导的对大丽轮枝菌的抗性反应依赖于EDS1和NDR18, 9；葡萄EDS1基因具有抗白粉病的作用10。EDS1诱导了R基因控制的抗性

8、，即调节了活性氧的爆发及HR反应的表达，并且通过在侵入位点积累水杨酸（Salicylic Acid, SA）的方式增强了对病原菌的抵抗作用11, 12。研究报道进一步证实EDS1基因是植物抗病反应中的一个重要信号元件。因此，关于EDS1的研究对于解决植物致病和抗病机制、进行品种改良和针对分子靶标进行新农药的开发备受广泛的关注。关于植物抗病信号网络中参与抗病反应的关键基因，不同物种在抗病机制上可能具有一定的保守性（Fradin 等, 2009; Fradin等, 2011; 陈捷胤, 2010; Gayoso, 2010）。基于此，本研究将根据不同物种的EDS1核苷酸保守区域设计简并引物，通过R

9、T-PCR和RACE技术克隆海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1并对其进行生物信息学分析。研究结果将为棉花抗黄萎病育种提供重要基因资源，为解析黄萎病抗性机制提供理论依据。参考文献1 Kumria R, Sunnichan V G, Das D K, et al. High frequency somatic embryo production and maturation into normal plants in cotton (Gossypium hirsutum) through metabolic stressJ. Plant Cell Rep, 2003, 21: 635-639.2

10、周兆华, 张天真, 潘家驹, 等. 大丽轮枝菌在棉花品种上的致病力分化研究J.中国农业科学，2000, 33 (2): 51-573 简桂良, 卢美光. 棉花抗黄萎病品种选育方法探讨J. 植物病理学报, 2004, 34(4): 356-360.4 潘家驹, 张天真. 黄萎病抗性遗传研究J. 南京农业大学学报, 1994, 17(3): 8-18.5 Falk A, Feys B J, Frost L N, Jones J D G, Daniels M J, and Parker J E. EDS1, an essential component of R gene-mediated dise

11、ase resistance in Arabidopsis has homology to eukaryotic lipases J. Proc Natl Acad Sci USA 96, 1999, 3292-3297.6 Jirage D, Tootle T L, Reuber T L, Frost L N, Feys B J, Parker J E, Ausubel F M, and Glazebrook J. Arabidopsis thaliana PAD4 encodes a lipase-like gene that is important for salicylic acid

12、 signaling J. Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96:13583-13588.7 Goodman R N, Novacky A J. The hypersensitive reaction in plants to Pathogenes M. APS Press, 1994.8 Fradin E F, Zhang Z, Juarez Ayala J C, Castroverde C D, Nazar R N, Robb J, Liu C M, Thomma B P. Genetic dissection of Verticillium wilt resis

13、tance mediated by tomato Ve1J. Plant Physiol, 2009, 150: 320-332.9 Expression of RPS4 in tobacco induces an AvrRps4-independent HR that requires EDS1, SGT1 and HSP90 J. Plant Science, 2004, 10: 213-224.10 Fei Gao, Xiao Meishu, Mohammad, Babar Ali, Susanne Howard, Nan Li, Patrick Winterhagen, Wenping

14、 Qiu, Walter Gassmann. A functional ortholog is differentially regulated in powdery mildew resistant and susceptible grapevines and complements an Arabidopsis EDS1 mutant J. Planta, 2010, 231:1037-1047.11 Feys B J, Moisan L J, Newman M A, and Parker J E. Direct interaction between the Arabidopsis di

15、sease resistance signaling proteins, EDS1 and PAD4J. EMBO, 2002, 20:5400-5411.12 Rustrucci C, Aviv D H, Holt B F, Dangl J L, and Parker J E. The disease resistance signaling components EDS1 and PAD4 are essential regulators of the cell death pathway controlled by LSD1 in Arabidopsis J. Plant Cell, 2

16、001, 13: 2211-2224.文献综述： 棉花黄萎病是一种土传的维管束真菌病害，落叶型菌系致病危害性强、在土壤内难以根除，所以分离构建抗黄萎病基因和培育转基因抗黄萎病棉花就显得尤为迫切。Zhou等1利用PCR扩增得到了萝卜Rs - AF1基因，体外抑菌实验表明，Rs - AF1 对大丽轮枝菌的孢子萌发和菌丝生长有明显的抑制作用。窦道龙2利用35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因(从拟南芥中克隆的)的组成型表达载体对陆地棉品种进行花粉管通道法转化，抗黄萎病鉴定结果显示转基因植株对黄萎病的抗性都明显增强。另外，从海岛棉中克隆到了多聚半乳糖醛酸酶(PGIPs)基因，这是从棉属植物中克隆的第

17、一个PGIP基因。PGIP基因编码的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白可以与真菌内源多聚半乳糖醛酸酶非抑制性结合，降低了该酶的活性，抑制真菌的作用，同时还诱导寡聚糖的合成，进一步诱导棉花的防御反应。最近，一些研究者从海岛棉品种中构建了用于抗黄萎病基因的克隆及其相关研究的文库3, 4。目前，棉花抗黄萎病基因工程中应用的基因主要有几丁质酶、-1，3-葡聚糖酶、植物防卫素、硫素及葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GO)等外源抗病基因5。其中，比较成功的报道是GO基因，该基因编码的葡萄糖氧化酶催化-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2，H2O2 在直接抑制病原菌生长的同时，也可作为信号转导物质诱导棉株

18、系统抗性的形成。王志兴、张宝红等分别将GO基因导入棉花，获得对黄萎病抗性明显提高的棉花株系6, 7。蔡应繁、崔百明等利用遗传转化法将抗真菌的-1，3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因导入棉花，经Southern 杂交检验，已得到阳性结果，进一步的研究还在进行中8, 9。乐锦华等用花粉管通道法将菜豆几丁质酶基因与烟草-1，3-葡聚糖酶基因双价植物表达载体pBLGC导入新疆棉花主栽品种(系) 550、822、1304 和石远321，通过PCR、Southern blot检测，进行黄萎病抗性筛选，得到抗病性良好且遗传性稳定的转基因抗病棉花10。20世纪70年代以来，随着植物基因工程技术的发展，应用遗传转化

19、的方法能够打破物种之间的生殖隔离障碍，而且可以获得生物的定向变异、提高育种的目的性和可操作性，为创造新的生命类型开拓了无限广阔的前景。目前，植物抗病基因工程中常用的基因主要包括以下几类1：编码引起植物广谱抗性蛋白的基因，编码具有抑菌或抗菌活性蛋白的基因，与植物结构相关的防御基因，病原菌致病因子的解毒或中和基因，参与植保素代谢的基因，总之，表达这些基因的植物对真菌的抗性大都得到了不同程度的提高，其中，许多基因协同表达一般比单基因转化效果明显。所以，可以把这些基因用于棉花抗病基因工程育种，通过它们的过量表达来提高棉花中萜类物质的含量，把上面的基因单独或一同转入棉花中来介导并提高棉花对黄萎病的抗性。

20、参考文献1 Zhou, Xiang, Jun Lu, Shan, et al. A cotton cDNA (GaPR10) encoding a pathogenesis related protein with in vitroribonuclease activity Science, 2002, 162 (4): 629-637.2 窦道龙. 棉花抗黄萎病基因工程研究和防卫反应相关基因的克隆, 中国农业科学院博士研究论文, 20023 左开井, 吴菲, 唐克轩等. 海岛棉品种根部黄萎病菌诱导表达全长cDNA文库. 棉花学报, 2002, 14 (5) : 291-294.4 Neuma

21、nn M J, Dobinson K F. Sequence tag analysis of gene expression during pathogenic growth and microsclerotia development in the vascular wilt pathogen Verticillium dahliae Fungal Genetics & Biology, 2003, 38 (1) : 54-63.5 段红英, 丁笑声. 棉花抗黄萎病基因工程研究综述, 作物杂志, Crops, 2007, 016 王志兴. 转基因抗病棉花和抗虫马铃薯株系的培育, 中国科学院植

22、物研究所博士后研究工作报告, 2000.7 张宝红, 姚长兵, 巩万奎等. 棉花葡萄糖氧化酶基因转化棉花和抗性愈伤组织的获得, 棉花学报, 2001, 13 (2): 78-81.8 蔡应繁, 裴炎. 抗真菌基因导入棉花创造高抗黄萎病材料. 西南农业学报, 2000, 13 (4): 45-49.9 崔百明, 祝建波, 肖路等. 转-1, 3-葡聚糖酶和几丁质酶基因棉花. 生物技术, 2002, 12 (4): 1-2.10 乐锦华, 祝建波, 崔百明等. 利用目的基因转化技术培育棉花抗病新品种. 石河子大学学报, 2002, 6 (3): 173-178.研究方法、内容： 1研究方法(1)

23、棉纤维发育相关基因GbEDS1的克隆。(2) 基因的生物信息学分析，主要包括以下内容：a) 分析基因编码蛋白质的氨基酸序列分析；b) 对基因信号肽及跨膜域的预测；c) 蛋白质模体分析；d) 亚细胞定位；e) 序列同源性分析。(3)基于生物信息学的分析，对所克隆的基因进行功能的预测。2 研究内容(1) GbEDS1基因的克隆。a)棉花总RNA的提取与cDNA的合成；b) GbEDS1基因的克隆和序列分析。(2) GbEDS1基因的蛋白分析。a) GbEDS1基因的氨基酸序列分析；b) GbEDS1的亲疏水性分析；c) GbEDS1的信号肽分析。(3) GbEDS1序列与其他物种EDS1同源比对分

24、析。进度安排：2013.3.1-2013.3.15: 查找国内外相关文献，学习与本试验有关的实验技术，制定实验方案。2013.3.15-2013.3.25：提取棉花总RNA，获得质量较高的RNA，进行cDNA的片段合成。2013.3.25-2013.4.25：设计并合成相关引物，扩增棉花相关基因GbEDS1及全长ORF，克隆并测序。2013.4.25-2013.5.10：对基因进行生物信息学的分析，从而预测基因的功能。2013.5.10-2013.5.30：整理实验材料，撰写论文，准备答辩。指导教师意见：论文选题针对性强，试验材料有代表性，试验方案可行，预期结果明确，同意开题。指导教师： 20

25、12年9月 30日审 核 小 组 成 员姓 名职 称备 注姓 名职 称备 注王省芬教授李文龙讲师刘立峰教授李志坤副教授李喜焕副教授开题报告记录：棉花RNA提取过程如何防止其降解？基因克隆过程中如何避免基因组的干扰？审核小组评语：论文选题依据比较充分，试验设计比较合理，研究方法可行，工作量较大，研究结果对于棉花黄萎病抗性的改良具有一定理论意义和应用前景。同意进入下一阶段的试验。审核小组组长：（签字） 2012年 10 月 20 日学院意见：院长： 年 月 日河北农业大学本科毕业论文指导教师评阅书学生姓名：刘通 学号：2009014010216专业班级：农学0902 所在学院：农学院论文题目：海岛

26、棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析 指导教师评语： 该同学遵守学校的各项规章制度，对工作认真负责，能够较好的完成各项实习任务。学习态度端正，具有较为扎实的生物科学基础理论和专业知识。论文对棉花抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析进行了研究，论文选题针对性强，依据充分，具有一定的科学意义和应用价值。试验设计科学合理，研究方法可行，符合本科论文要求。论文写作格式规范，条理清晰，层次分明，数据可靠，结果分析透彻，文献参考得当，符合一般科技论文写作要求。该生在做毕业论文的研究过程中基本掌握了本学科领域的基础理论和专业知识。论文不足之处在于：（1）前言部分过于繁琐，可以删

27、去与研究内容相关不大的部分；（2）文章参考文献格式尚需进一步修改；成 绩 评 定：87.6是否同意答辩： 指导教师（签名）： 年 月 日河北农业大学本科毕业论文答辩评分表评分指标分 值评 价 内 容得 分论文选题10选题有重要理论意义或实用价值。立题依据充分。文献引用12阅读、引用文献资料较广泛，较全面了解本领域学术动态，综合分析能力较强。论文难度及工作量14难度较大，工作量大。论文成果的创新性12有独到见解，有较大的创新性成果。理论基础与科研能力16具有坚实的基础理论和系统的专门知识，具有较强的独立从事科研工作的能力，研究方法和技术体系得当。写作能力16条理清楚，层次分明，说理透彻，文笔流畅

28、，表格、绘图准确规范，中外文摘要简明扼要，语句通顺，语法正确，符合科技写作规范。答辩报告10能简明扼要、重点突出地阐述论文或设计的主要内容，有新见解，结论明确；时间掌握恰当。回答问题10思维敏捷，逻辑性强，准确流利地回答各种问题。总 分10087.6注：本表为答辩小组成员评分用表，评分标准参照河北农业大学毕业论文质量评定参考标准河北农业大学 2013 届本科毕业论文答辩记录表所在学院：农学院 专业班级： 农学0902 时间：2013 年 6 月 6日学 生 姓 名刘通学 号2009014010216指导教师姓名张艳职 称讲师毕业论文题目：海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析

29、答 辩 小 组 成 员姓 名职 称成 绩姓 名职 称成 绩王省芬教授李志坤副教授刘立峰教授李喜焕副教授李文龙讲师答辩小组评语：答辩小组组长：（签字）2013年 6 月 6 日答 辩 成 绩：87.6 河北农业大学 本科毕业论文(设计)题 目：海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析 学 院： 农 学 院 专业班级： 农学0902班 学 号： 2009014010216 学生姓名： 刘 通 指导教师姓名： 张 艳 指导教师职称： 讲 师 二O一三年 六 月 一 日海岛棉抗黄萎病相关基因GbEDS1的克隆与生物信息学分析农学专业 刘通摘要：本研究根据不同物种的EDS1核酸保守区域设

30、计简并引物，利用RT-PCR和RACE技术从海岛棉克隆抗黄萎病相关基因EDS1的cDNA及开放阅读框序列（Open reading frame, ORF）。GbEDS1 cDNA全长2190bp，其中5非编码区168bp，3非编码区174bp，ORF为1848bp，编码615个氨基酸。GbEDS1基因核酸序列与毛果杨EDS1(XM-002322106）具有64%的同源性，该基因内部无信号肽结构。关键词：棉花; 抗黄萎病; GbEDS1; 克隆; 生物信息学分析Molecular Cloning and Bioinformatics Analysis of GbEDS1 Related with Verticillium Wilt Resistance from Gossypium barbadenseAuthor:Liu TongMajor: Agr