具有羟乙基团的二氮杂冠醚稀土金属配合物剪切dna的研究大学论文.docx

1、具有羟乙基团的二氮杂冠醚稀土金属配合物剪切dna的研究大学论文 编号 毕业设计（论文） 题目 具有羟乙基团的二氮杂冠醚稀 土金属配合物剪切DNA的研究 二级学院 化 学 化 工 学 院 专 业 化学工程与工艺 班 级 学生姓名 学号 指导教师 评阅教师 时 间 摘 要为了获得能高效稳定地切割DNA的模拟核酸酶，本文根据文献合成了带有羟乙基支链的1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷配体（L），将其作为化学核酸酶的模拟模型，用于质粒超螺旋 pUC19 DNA的剪切反应；并采用紫外-可见光谱法研究了稀土金属离子M（Ce3+，La3+）与配体L形成的稀土金属配合物ML（CeL，LaL）

2、的形成。通过琼脂糖凝胶电泳法研究了不同浓度、不同PH、不同反应时间条件下金属配合物ML（CeL，LaL）对DNA剪切效果的影响，并进一步研究了其作用机理。 实验结果表明，稀土金属离子M（Ce3+，La3+）与氮杂冠醚配体形成1:1的金属配合物ML (CeL, LaL)；琼脂糖凝胶电泳实验表明金属配合物ML（CeL，LaL）能有效地切割pUC19 DNA，且都随着反应时间的增加剪切效果逐渐增强。镧离子配合物（LaL）在pH值为6.03左右，浓度为1.010-5 mol/L时对pUC19 DNA的剪切效果最好；铈离子配合物（CeL）在pH值为7.04左右，浓度为1.010-5 mol/L时对pUC

3、19 DNA剪切效果最好。关键词：二氮杂冠醚；稀土金属离子；镧系金属配合物； 剪切DNA AbstractIn order to obtain analog nucleases which can cleave DNA stably and efficiently, the complex 1,4,10,13- tetraoxa-7,16-diazabicyclo octadecyl ligand (L)with hydroxyethyl was synthesized accoding to the literature ,it was used to be the simulation m

4、odel of metal complexes as chemical nucleases to study the cleavage of supercoiled plasmid pUC19 DNA;Also, the formation of the complex（CeL，LaL）with rare earth metal ions M (Ce3 +, La3 +) and azamacrocyclic ligand was studied by employing UV-visible spectroscopy.By using agarose gel electrophoresis,

5、 we studied the different effects of metal complexes reacted with supercoiled plasmid pUC19 DNA under the different condition of concentrations, PH, reaction time and whether added inhibitors,further more, we explored the reacting maganism of metal complexes cleavage DNA .The experimental results sh

6、ow that rare earth metal ions M (Ce3 +, La3 +) conbined with the aza-crown ether 1:1 to form the metal complexes ML (CeL, LaL) .The experimental results of agarose gel electrophoresis show that metal complexes ML (CeL, LaL) can both accelerated the breakage of pUC19 DNA from supercoiled form (form I

7、) to lined form (form ) effectively , and with the reaction time increasing, the shear effect was enhanced gradually. Lanthanum ion complex (LaL)performed excellent cleavage ability at a pH of about 6.03, a concentration of 1.0 10-5 mol / L ,while cerium ion complex (CeL) performed excellent cleavag

8、e ability at a pH of about 7.04, concentration to 1.0 10-5 mol / L.Keywords: aza-crown ether; rare earth metal ions ;lanthanum complex; DNA cleavage 1 前言 11 前言 DNA不仅能存储遗传信息，而且能通过碱基的互补配对及转录、翻译等过程使碱基所携带的遗传信息得以传递；此外DNA对生长发育、繁殖和维持遗传特性的稳定性等方面起着举足轻重的作用，也有生物变异、遗传疾病、肿瘤癌症等有密切的联系，一些小分子化合物会破坏核酸结构，从而妨碍基因的正常表达1,

9、2。在特异性识别出碱基对并在特定的位点剪切DNA是基因技术的关键，故选择合适的限制性内切酶显得尤为重要，而限制性内切酶的数量、质量和种类都与实际需求相差甚远，所以将金属配合物作为高效高选择性的人工核酸酶的研究具有很好的学术和应用价值3。1.1 核酸的组成及结构 核酸由戊糖、碱基和磷酸根组成的核苷酸构成4。戊糖可分为两类:D-核糖和D-2-脱氧核糖。碱基主要有五种，其中DNA和RNA所共有的碱基有三种为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶，胸腺嘧啶为DNA特有，尿嘧啶为RNA特有5。1.1.1 DNA的一级结构DNA的一级结构指的是由磷酸二酯键连接起来的脱氧核苷酸链直线分子，由于构成该直链分子的碱基顺序各不相

10、同，所以根据半保留复制机制的转录翻译过程得到的蛋白质也有很大的差异性，这就决定了遗传信息的种类和数量。1.1.2 DNA的双螺旋结构DNA最稳定常见的构型即DNA的双螺旋结构，该DNA的特点有5：构成该DNA的两条脱氧核苷酸链是反相平行的，这两条链均呈右手螺旋结构；两条链之间通过氢键连接。双螺旋结构之所以稳定，是因为氢键的作用、碱基平面间的堆积力以及疏水作用和静电力作用的存在。1.1.3 DNA的超螺旋结构DNA的超螺旋结构,指在二级结构的基础上再盘绕扭曲后的三级结构，由于DNA的该结构呈高度致密的状态，体积较小可装入细胞核中，而且由于质粒DNA三级构造比较简单,故在化学、药学等方面的应用受到

11、了极大的追捧。质粒DNA一般有三种构型:共价闭环DNA、开环DNA和线性DNA。共价闭合环形DNA，即组成DNA的两条核苷酸链均为环形结构；开环DNA，指的是两条多核苷酸链中的一条维持原本的形状不变,另外一个核苷酸链上有一个或几个缺口；线性分子，即两条链的同一部位被剪切5,6。1.2 DNA及人工核酸酶的重要意义DNA在维持物种遗传特性的稳定性、基因的复制、转录和翻译等生理过程中起着格外关键的作用，若有一小部分的基因片段发生变异会对生理活动产生很大的影响。由于核苷酸的碱基序列各不相同，只有通过对应酶的特异性与专一性才能被识别出来，并由酶结合断裂磷酸二酯键，所以生物体内的生化反应往往需要酶的参与

12、，DNA的合成和降解也需要酶的催化。天然酶的识别序列短、只能在特定的条件下使用，只能在有限的位点上切割DNA、且体积大、稳定性差、提纯难度较高、价格又昂贵，这些缺点时使天然酶在制药、医学、生物学等领域的应用受到了很大程度的限制。从1980年开始，由人工合成的用来剪切核酸的酶即人工核酸酶7 得到了快速的发展。人工核酸酶模拟物指的是在一些化合物母体如冠醚、大环多胺、环糊精等上面，共价接入一些催化基团，来模仿天然酶的空间结构使其具有催化活性中心，进一步识别核苷酸序列并断裂磷酸二脂键，起到在固定位置切割DNA的作用。人工核酸酶这种新型酶工具的优点众多，它结构相对简单、制备比较方便而且成本相对较低，不仅

13、可以模拟限制性内切酶的功能，并且可以在较温和的条件下稳定、高效、专一地在任何位点上断裂DNA，达到催化核酸的目标8。因此，合成和探究出可高效专一地剪切DNA的人工核酸酶，对生物制药、如肿瘤的基因治疗和环境保护等方面的研究具有重要的理论指导意义和广泛的应用价值9。1.3 DNA与金属配合物相互作用研究 20世纪60年代末，Rosenberg10发现铂氨的配合物可以抗癌，这个重要发现吸引了大家的目光，开始关注金属配合物与DNA 之间的相互作用。由于金属离子及其配合物在多种生物化学反应中, 起着重要的酶催化作用，将金属配合物作为人工的模拟核酸酶会催化DNA使之发生结构或性质的变化，故金属配合物与DN

14、A 之间的作用方式和机理有指导性的意义。探讨小分子化合物与核酸之间的切割机理及在何种适宜的反应条件下小分子活性最高、切割效率最好等等，这些都具有非常重要的意义。 在国际上，Kimura课题组对大环多胺和DNA间的相互作用做了很多的设计方案并进行了大量的研究11,12，国内方面，川大余孝其课题组也合成了大量的金属配合物，对人工核酸酶的研究做了大量的实验，并得出了比较理想的效果6，13。1.3.1 大环配合物与DNA的相互作用 汪明等14首先用紫外-吸收光谱滴定法探究了四核铁配合物，苯并咪唑基甲基胺与DNA之间的作用，然后通过凝胶电泳实验，得出了配合物能够促进DNA水解的反应动力学和影响因素，结论

15、如下：在酸性条件下，四核铁配合物Fe2(2-O2-)-Fe2(OH-)过程中产生了亲核试剂OH-，由于亲核试剂对磷酸二酯键的结合作用从而使DNA水解，四核铁配合物促进DNA的水解效果在磷酸盐等反应介质体系pH值较高的情况下会受到抑制。四核铁配合物对DNA序列没有明显的选择性，在剪切质粒DNA时会使从其从超螺旋结构转变为线性结构。 王晓燕等15合成了一种四氮大环配合物，并测定了其对超螺旋结构质粒DNA的水解效果，在试验条件为pH=7.0 、反应时间为48小时条件下，发现 Cu 配合物水解效果优于Zn和Co的配合物。通过凝胶电泳实验得出，开链环状DNA 所占的比例随着时间增长而增大（反应24小时后

16、，开链环状DNA达到了 80%，反应48小时后，接近100%）。探讨其裂解机理得出结论：其裂解可能是经过水解的方法。 丁超等16通过模板导向的方法，得到大环双核金属Ni（）配合物，并用多种方法如红外光谱法、元素分析等方法对其结构进行了检测确定。利用紫外光谱、分子荧光和粘度试验分析了大环双核金属镍配合物对 DNA的反应，并得出反应机理：两者是以插入模式实现相互结合的。 何远等17通过曼尼希反应（mannich反应）合成了两种配体H2L1和 H2L2 ，所用药品为二呋喃亚甲基乙二胺、多聚甲醛和含氯或溴的水杨醛，这两种配体是同双核。经过一些列的实验对金属配合物与小牛胸腺DNA间是否发生反应及作用的模

17、式进行了探讨比较，得到的结论如下：第一，体系在加入小牛胸腺 DNA后，紫外实验的吸收峰强度有所下降，而且出现了红移现象，这说明配合物与DNA间发生了反应；第二，配合物可插入到DNA中并将超螺旋结构切割成其他结构；第三，在不添加抑制剂的条件下，发现配合物剪切DNA有良好的效果，并得出其配合物是通过氧化切割的途径实现对DNA的剪切。 黄俊18等通过琼脂糖凝胶电泳试验及荧光淬灭试验，发现简单咪唑嗡盐（不含双核大环多胺的）对 DNA 的反应活性比配体和配合物对DNA的反应活性要低得多；由于配合物带正电，DNA带负电荷，二者之间有静电作用，故该配体和配合物可以防止DNA不被裂解；在体系中加入水解酶时，咪

18、唑嗡盐配体以及配合物会保证DNA不被催化水解。1.3.2氮杂冠醚金属配合物与DNA的相互作用氮杂冠醚指用氮原子替换冠醚环上的氧原子，由于特殊的分子结构，通过化学修饰在其母体上替换原子或连接一些具有特殊性质的官能团，能够获得与人体内某些生物酶结构相似的配合物，用于核酸酶模型，模拟酶催化反应中的识别过程和各种生化催化反应，在制药、核酸酶模型等方面体现了广泛深刻的应用价值。李凤莲19的粘度实验和光谱实验的结果表明:这几种金属氮杂冠醚配合物中，当金属离子为铜离子，则配合物与小牛胸腺DNA的作用方式为插入结合；金属离子为铈离子则与DNA结合方式为部分插入；金属离子为镍、钴、锌时则与DNA的作用方式为沟面

19、结合或者静电作用。通过琼脂糖凝胶电泳法得出的实验结果，能够观察到这几种金属氮杂冠醚配合物剪切DNA的效果:它们剪切DNA后超螺旋结构的条带亮度会随着体系中金属配合物浓度的增大而减弱。Schneider20等对含氮的稀土大环配合物与pBR 322质粒DNA之间的反应得出了以下结论：稀土大环配合物会使该种DNA的双螺旋结构变成单链DNA，并且会使原本的质粒DNA的t1/2为2000年，在配合物与其作用后t1/2缩减到50min。其切割机理为水解机理。1.4 镧系金属配合物与DNA作用的研究进展有关含过渡金属离子的大环多胺金属配合物的作用在之前已有大量的研究，由于过渡金属(如铜、锌、镍、镉等)具有以

20、下特点：结构简单多样、易分离提纯且成本较低、具有丰富的光物理化学性质，故能够在生理条件下借助于光化学反应、氧化还原反应使核酸断裂。但其缺陷也很明显, 它们不仅能作用于磷酸二酯键，同时也与脱氧核糖环发生氧化反应，从而不可再用连接酶连接断裂产物，而且分子的特异结合部位会受到损伤21，另外有报道证实，金属铍和镉会引发癌症，它们与DNA中负性原子的络合能力更强，会使酶失活22。 稀土离子的离子半径大、所带电荷多，由于具备良好的亲氧性故可与磷脂键较好的结合，并且能与羟基配体在很简单的条件下形成性质稳固的配合物。这些配合物之所以可以剪切DNA是通过氧化切割，羟基对核酸链进行了亲核进攻或通过水解作用，且将其

21、作为人工核酸酶的水解效率高、选择性好。镧系元素特殊的电子层结构，决定了其在舍去外层三个电子后，每一个电子层都显现为稳定结构，所以它们只能生成氧化数为+3的稳定化合物，且镧系金属离子与大环配体的结合常数大，同时在pH接近7的体系中，不容易水解，也不会轻易生成金属氢氧化物的沉淀，这样它们就能表现出更佳的反应活性23。La的亲核能力比较大，故可与DNA更好地结合，可以作为理想的模拟核酸酶24。周春琼等25合成了四种含甲基苯酚的金属配合物，所用金属离子为Zn2+、Mn2+、Eu3+和Nd3+，并它们的结构进行了分析印证；通过凝胶电泳实验来探索配合物与质粒 DNA 的作用效果，得出在温度为37时，这四种

22、配合物都不能有效地剪切DNA；而将温度升高到50、体系pH值为8.0的条件下，只有Eu3+和Nd3+对应的配合物能够将大多数的超螺旋结构的DNA剪切成为缺刻型DNA结构；而在温度为37的条件下，改变稀土配合物与H2O2 的比例，使稀土配合物：H2O2 =1：20，此时即便配合物的浓度低，也可将超螺旋结构全部剪切为缺刻型DNA。周文骏26 等合成了含甲氨基苯酚的铈配合物，并用红外光谱图进行表征，观察在胶束体系中的金属铈配合物与核酸的相互作用，在反应48小时后进行电泳，电泳条带图显示这种铈双核配合物可以很好地剪切DNA分子。1.5 金属配合物与DNA的作用方式 核酸是一类重要的大分子，但由于一些外

23、界因素的影响或自身基因表达中的问题会使DNA发生突变，从而导致一些疾病如癌症等。通过小分子与DNA的相互作用，可以定点切割核酸，这为人们研究基因疾病提供了新的思路，也引起生物界、医学界、化学界的广泛关注。小分子与核酸的结合方式可概括为以下三类：非共价结合、共价结合和剪切作用，另外有研究表明，小分子与DNA还存在“半嵌插结合”的作用方式5 。1.5.1 非共价结合 非共价结合指小分子与DNA间的相互作用依赖的是正负电荷之间的吸引力，故两者之间的相互作用较弱，结合是可逆的。非共价结合有静电结合、沟槽结合和嵌插结合这三类，除此之外常见的氢键、范德华力、堆积作用和疏水作用等较弱的相互作用也是非共价结合

24、27。 （1）静电结合(Electrostatic Binding)：由于DNA双螺旋外部的的磷酸骨架与小分子化合物带相反的电荷，故两者可以发生静电作用。这种静电结合的作用比较弱，且只是与磷酸骨架结合。 （2）沟槽结合(Groove Binding)：DNA的超螺旋结构由戊糖（D-2-脱氧核糖）和磷酸骨架扭结螺旋产生，从侧面看到的深浅不同的凹陷即为DNA的沟槽。主沟槽（Major Groove）的开口大且凹陷较深，次沟槽（Minor Groove）的开口较小，这两种沟槽在立体结构、电势的高低等方面都有极大的差异。 （3）嵌插结合(Intercalative Binding):分子嵌入DNA的必

25、要条件是分子具有平面结构，将这些具有平面或者近乎平面的分子插入到DNA的碱基对中即可，小分子与DNA的嵌插结合与DNA的结构、插入配体的平面面积和基团组成、插入的取代基等因素有关。通过嵌插结合与静电力的作用，能使小分子具有抗病毒抗肿瘤的生物活性4。1.5.2 共价结合共价结合4 指构成金属配合物提供一个电子，DNA中的戊糖、碱基或磷酸根提供一个电子，两者之间通过形成共价键实现结合。1.5.3 剪切作用剪切作用是指小分子化合物在与DNA的两条链实现特异性结合之后使DNA链发生断裂的作用，小分子与DNA的结合特性决定了分子断裂DNA的位点。有研究28发现，锌()、锰()和钴()的配合物能够特异性识

26、别DNA的位点,从而对DNA产生切割作用。1.6 氮杂冠醚大环配体 由于氮杂大环上可连接多种官能团，故所得的配体有很多种，一般由二醛或二酮化合物与氨先进行缩合反应，形成希夫碱，之后在进一步还原得到29。合成时若主体相同只是所连接的官能团不同，便可获得多种性质各异的氮杂冠醚大环配体；另外，若配体含一个环则称为单大环配体，含两个以上的环称为多大环配体30-32。 基于以上所述原因，本论文用紫外可见光谱法和凝胶电泳法研究具有羟乙基官能团的氮杂大环配体（1,4,10,13-四氧-7,16-二氮杂-18-冠-6）和镧离子、铈离子形成的金属配合物（LaL、CeL）在不同的反应条件下剪切超螺旋质粒pUC19

27、 DNA的效果。2 实验部分2.1 带羟乙基支链的二氮杂大环配体的合成 本文按照文献33的方法合成了配体1,4,10,13-四氧-7,16-二氮杂环十八烷（结构如图1.1），将19.0g（101.6mmol）的1,2-（2-氯乙氧基）乙烷（C6H12Cl2O2）和33.3g（222.2mmol）钠化碘加入到50mL丙酮，回流搅拌70h；然后冷却抽滤，得滤液，旋干，得淡黄色油状稠液体残余物，溶解于160ml醚中，用60.3g硫代硫酸钠的240mL水溶液洗涤三次，分液，将乙醚相旋干，得到32.5g（ 87.8mmol）无色油状液体1,2-（2 -碘乙氧基）乙烷(C6H12I2O2)。将33.3g（

28、191.4mmol）的1,2-双（2-氮乙氧基）乙烷（C6H14N4O2）的100毫升乙腈溶液缓缓加入到含有32.5g（87.8mmol）的1,2-（2 -碘乙氧基）乙烷、125.4g碳酸钠和400ml乙腈的混合物中，回流18h后过滤，滤液旋干，得残留物溶解在溶液50mL丙酮和50mL1,4-二氧六环的混合溶液中，加热半个小时左右，冷却过夜，析出白色晶体，抽滤，将晶体溶于100ml水，加350mL氯仿加热萃取18h；分液，将氯仿层旋干，得粗产品，干燥，后用正庚烷重结晶四次，得配体L1。产率：8.2%，m.p.: 111.0-112.3; LC-MS (API-ES): (M+H)+: m/z=

29、263.2, calcd for: 263.2; (M+2H)2+: m/z=132.2, calcd for: 132.1; (M+2H+K)3+: m/z=101.2, calcd for: 101.1; 1H NMR (ppm, CDCl3) H: 3.60 (t, J =9.2 Hz, 16H, CH2O), 2.80 (t, J =9.2 Hz, 8H, CH2N), 2.08 (s, 2H, NH). 图1.1 二氮杂大环配体1,4,10,13-四氧-7,16-二氮杂环十八烷（L1）的结构带羟乙基支链的二氮杂大环配体的合成：称取1.5908g的配体L1，在冰溶条件下加入10ml的甲

30、醇溶解；再加入1ml的环氧乙烷，回流（前2h用制冷循环水，0，后1h用普通自来水），温度设为60；旋干甲醇，得黄色油状产物2.4g。即为带羟乙基支链的二氮杂大环配L(结构如图1.2所示)。LC-MS (API-ES): (M+H)+: m/z=351.2, calcd for: 351.2; (M+2H)2+: m/z=176.1, calcd for: 176.1。整个合成路线图见图1.3。图1.2带羟乙基支链的二氮杂大环配体（L）的结构图1.3带羟乙基支链的二氮杂大环配体的合成路线图2.2 紫外-可见分光光度法2.2.1 主要试剂与仪器紫外实验用到的重要试剂如下表所示：表1 实验主要试剂药

31、品名称化学分子量药品等级产商Tris碱121.14AR广东省化学试剂工程技术研究开发中心六水硝酸镧433.02AR国药集团化学试剂有限公司六水硝酸铈434.24AR国药集团化学试剂有限公司NaCl58.4AR重庆博艺化学试剂有限公司NaOH40.00AR成都市科龙化工试剂厂HCl37.5AR重庆博艺化学试剂有限公司本实验中用到的重要仪器如下表所示:表2 实验主要仪器型号规格名称产商TU-1901型双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司PB-10型PH计上海虹益一起仪表有限公司BS224S型电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司GZX-9246型电热鼓风干燥箱上海博讯实验有限公司医疗设备厂OT54383型移液枪外国进口2.2.2 紫外-可见分光光度法原理紫外-可见分光光度法是一种很常见的分析物质组成的方法，应用范围广泛、易于操作、分析物质的结构比较准确可信。基于物质分子对紫外光区或可见光区的吸收峰强度，就可进行定性、定量等分析；或反之对于在紫外光区和可见光区有较弱的吸收峰的物质中含有某些在此光区有强吸收峰的杂质，可进行纯度分析或结构分析34。2.2.3 溶液的配制（1）Tris缓冲液：称取0.3028g的Tris碱和1.4624g的NaCl溶于500mL的容量瓶中