酵母细胞分批培养实验.docx

1、酵母细胞分批培养实验酵母菌分批发酵试验一、实验目的1.学习酵母菌的发酵方法及其发酵过程的优化控制技术;2.学习和掌握分批发酵一般过程和操作规程。二、实验原理酿酒酵母是一种食品级的微生物，人类从几千年前就开始利用它了，像夏禹时期就有 仪狄作酒的记载。干酵母蛋白质含量高达45%且其蛋白氨基酸品种齐全，维生素丰富，营 养价值较高，是饲料工业、医药工业、发酵工业和食品工业 的重要原料。早在1900年 时，面包酵母己经形成大生产的规模。作为人类食物 的酵母生产，则是在第一次世界大战 时在德国发展起来的。酵母单细胞蛋白一直 是欧美市场上缺乏的蛋白质资源，国内也很匮 乏。本实验在发酵工程课堂教学理论基础上，

2、以分批发酵法制备酿酒酵母细胞为 实践内 容，深入理解发酵原理、方法以及过程及其优化控制方法。通过实践与理论的结合，加深 对发酵工程的认识，进一步增进专业能力和素养。发酵工程实验日程表序号实验项目时间实验内容安排1培养基制备与灭菌预计4学时1、 固体培养基配制500ml/组，分装2瓶；2、 培养皿清洗及包扎15畐ij/组；无菌水100ml/瓶；3、 吸管包扎4支/组；1、液体培养基制备：800ml/组，分装16瓶，灭菌0. IMPa, 20min.1、菌种的分离纯化：超净工作台消毒（UV照射20min） -75%乙醇擦拭台面；活性酵母菌粉-无菌水溶解（稀释10弋倍）-涡旋震荡5min;倒平板（1

3、0副平 皿/组）-平板划线分离-30C倒置培养。酵母菌种预计2活化与种2学2、接种准备工作：招净工作台消毒（ UV照射20min） - 75%乙醇擦弑台面。子制时1、种子培养接种：平板单一菌落-种子培养基（ 2环/瓶）-涡旋震荡3-5min ;2、摇瓶培养：摇床设置及调节（30 C, 200r/m ） -摇瓶固定-启动培养。发酵罐结1、发酵培养基配制：18Lo构、操作规 程及酵母2、发酵罐操作培训：发酵罐初始状态检查及调节-清洗（清水冲洗 2-3菌分批发遍）-发酵罐运行启动-发酵罐运行参数设置-空罐灭菌酵预计（0. 15NIPa, 20min ）进料一实罐灭菌（0. IMPa 维持 30min

4、）冷却一 火焰封口接种-发酵参数稳定状态调节与维持。38学时3、发酵取样：取样管灭菌-取样-再灭菌；4、发酵中间过程分析（0 hour ） : pH测定（pH计or精密试纸）；酸度（中和法）；残糖测定（折光法）；菌体浓度测定（ A.光密度法）5、中间取样：每间隔4h,取样管灭菌-取样-再灭菌.共计4-6次；酵母菌的1、水浸片制作及观察形态观察；预计4酵母细胞6学2、酵母菌分离条件试验的分离提时取3、发酵结束工作：器皿、设备还原，环境清洁实验一一培养基制备与火菌1、实验原理培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的 多种营养物质的混合物。一个完整的培养基配方组成包括

5、组成成分、各组成成分的浓度和 合适的pHL培养基的组成成分主要有碳源、氮源、无机盐和 微量元素、水、生长因子以及 特殊用途的前体和诱导物。实验利用葡萄糖、蛋白腺、酵母抽提物组成的培养基分批发酵 培养酵母菌。灭菌是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其抱子，或从中将其除去。绝 大多数工业发酵是需氧的纯种发酵，因此所使用的培养基须彻底灭菌。本实验釆用 121C, 30min的湿热灭菌法来对培养基进行灭菌处理。2、 仪器、材料和试剂(1)仪器电子天平；高压灭菌锅(2)材料蛋白腺；酵母抽提物；葡萄糖；去离子水；pH试纸；NaOH HCI； 100mL三角瓶； 250mL三角瓶；瓶塞；玻璃棒；称量纸

6、；100mL量筒；500mL烧杯；培 养皿(3)试剂固体平板培养基：葡萄糖2%,蛋白腺2%,酵母抽提物1%,琼脂2%。液体培养基：葡萄糖2%,蛋白腺2%,酵母抽提物1%3、 实验步骤(1)计算按固体培养基和液体培养基的配方，计算500mL固体培养基和 800mL液体培养基各物质的用量。(2)称药品用袪码天平准确称量各物质。(3)溶解将培养基的组分放加在500mL烧杯的水中，玻璃棒搅拌溶解。(固体培养基琼脂在室温下不能溶解，需加热煮化)。(4)分装液体培养基每组按50L培养基/250mL三角瓶规格分装16瓶；固体培养基分装250mL培养基/250mL三角瓶。(5)包扎 三角瓶口塞上瓶塞后用牛皮纸

7、和线绳包扎，以防灭菌时冷凝水沾 湿棉塞。在纸上写上培养基名称、组别、日期。(6)灭菌 放置于高压蒸汽灭菌锅内，121C湿热灭菌30mino(7)倒平板待高压蒸汽灭菌锅降温至60C时，取出培养基，液体培养基室温放置, 固体培养基在已紫外灭菌的超净工作台里倒制5-10只平板。实验注意事项】(1 )准确称量各物质，称完药品应及时盖紧瓶盖。(2)调pH值时要小心操作，避免回调。(3)不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。(4)灭菌操作中务必待压力下降到零后，才可打开锅盖1、实验原理菌种活化是指将保存在砂土管、冷冻干燥管、冷冻斜面中处于休眠状态的生产菌种 接入试管斜面或平板培养基进行复苏处理。活化后，

8、再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放 大培养而获得一定数量和质量的纯种。这些纯种培养物称为发酵的种子。种子的一般 制备过程可用下图表示：、子却咎阶廉 1 生户车岡艸子剁*窑轻* I中孑北胳挣出期阳 秒土话一申肝剧 It 子：1. 1 ! : ft-f. 20min 25mino从三角瓶中倾出清液，回收酵母细胞，并用少量的丙酮清洗酵母细胞、称重绘出 离心时间一酵母细胞得率的曲线。采用相似的步骤，在不同的转速1500, 3000, 4000r/min下离心lOmin,分 析转 速一酵母细胞得率之间的关系。根据上述结果，分析优化的离心条件并阐明原因。【实验注意事项】(1 )离心时样品需对称放置并平衡，平衡时如果缺少样品，可以用蒸憾水空白离心管代替。(2)各组在离心操作时，对离心时间、转速等进行协调，以节省实验时间。