微生物的遗传变异.docx

1、微生物的遗传变异微生物的遗传变异内容提要 细菌遗传变异的物质基础主要是基因组。质粒作为自我复制单位，控制细菌的某些次要性状，如抗性等，质粒可以转移、也可以丢失的特点得到高度重视。转座因子因具有可移动性，成为研究细菌遗传变异的有用工具。毒力岛是从基因水平认识细菌毒力因子的新概念。基因突变是细菌最重要的变异，可用化学或物理的方法人为造成。转化、转导、接合是细菌个体间交换遗传物的天然方式，对细菌的变异具有重要意义，还可以采用原生质体融合及转染等人工方法达到相似的目的。掌握细菌遗传变异的规律，有利于动物传染病的诊断和预防，并可推动基因工程技术的进步。细菌与其他生物一样，通过遗传（heredity）与变

2、异（variation）生存与发展。所谓细菌的遗传，系指亲代细菌与子代细菌的相似性，它使细菌的性状保持相对稳定，是各种细菌存在的根据。所谓细菌的变异，指亲代与子代以及子代细菌之间的不相似性，细菌得以发展进化。第一节 细菌遗传的物质基础一、基因组（genome）细菌的基因组位于核体，是遗传的主要物质基础。核体又称染色体（chromosome）是由环状双螺旋两条DNA长链组成，含细菌的遗传基因，控制细菌的遗传与变异。每条DNA单链的骨架由磷酸和脱氧核糖组成，支链含有四种碱基，即两种嘌呤：腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G），两种嘧啶：胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。细菌染色体DNA以半保留方式进行复制。新形成

3、的DNA双链分子与亲代的完全相同，所携带的遗传信息也与亲代的完全相同。倘若在DNA复制中，子代DNA发生改变，便会出现变异。二、质粒（plasmid）质粒是细菌染色体外的遗传物质，多为环状双螺旋DNA分子，可为一种或若干种。质粒可以自身复制，随宿主菌分裂传到子代菌体。质粒是自行复制单位，有多个拷贝者，称为松弛型复制；有的需随染色体一起复制，仅一个拷贝者，称为严紧型复制（stringent replication）。前者称为松弛型质粒，后者称为严紧型质粒。质粒可编码细菌多种重要的生物学性状，但不为细菌生命所必需的性状。在一定条件下，质粒可以转移，可丢失，也可重新获得。编码性菌毛的质粒称致育质粒或

4、F质粒（fertility plasmid），具有F质粒的细菌有性菌毛，为雄性细菌；无F质粒的细菌无性菌毛，为雌性细菌，该质粒与细菌的有性结合有关。编码细菌各种毒力因子的质粒统称毒力质粒或Vi质粒（virulence plasmid），如致病性大肠杆菌在粘膜上定居及产生毒素的能力可由不同质粒编码，其中K质粒编码对粘膜具有粘附活性的菌毛，ST质粒与LT质粒分别编码耐热肠毒素和不耐热肠毒素。细菌对抗菌药物或重金属盐类的抗性则由R质粒（resistance plasmid）所决定。一个质粒可同时具有几种编码功能。质粒可以在细菌间转移，当质粒从一个细菌转移至另一个细菌时，携带的性状也随之转移。质粒的转

5、移不仅可以发生在同种、同属的细菌之间，有的甚至还可以在不同种属的细菌间进行。按其转移的特性可将质粒分为二类：接合性质粒（conjugative plasmid）与非接合性质粒（nonconjugative plasmid）。接合性质粒一般使细菌有致育性，并且在细菌之间接触时能从一个细菌转移到另一个细菌中去（如F质粒）。非接合性质粒不能在细菌之间转移，但有的可以通过以噬菌体为载体或直接进入另一个细菌而转移。非接合性质粒也可以与接合性质粒结合随接合性质粒转移。有的质粒还可以结合到染色体上，如F质粒在变形杆菌内是独立存在的，但在大肠杆菌内则可与染色体结合，这种质粒称为附加体（episome）。穿梭载

6、体（shuttle vector） 是一类特殊的质粒，可在某种属关系差异较大的微生物中转移，例如在大肠杆菌与酵母之间。利用它可携带质核或真核微生物的外源序列。三、转座因子（transposable element）近年来发现微生物的某些DNA片段作为一个独立单位可在染色体上移动，此种移动甚至可发生在不同种细胞之间。这种可移动的DNA片段称之为转座因子。细菌的转座因子有三种类型：插入序列（insertion sequence, IS）、转座子（transposon, Tn）以及某些特殊的噬菌体，例如Mu，是促变噬菌体（mutator phage）的简称。IS与Tn具有两个共同特点，一是都携带编码

7、转座酶（transposase）的基因，二是在其DNA末端都有短的倒置末端重复子。重复子长约401000 bp。IS分子量较小（0.71.4 kb），Tn比IS大（22.5 kb），除转座酶基因外，还含某些具有重要特性例如抗性标记的基因。Tn是当今遗传学及基因工程研究的有用工具。Mu分子量约22.5 kb，与一般温和噬菌体不同，它可整合到大肠杆菌染色体的任何位置，从而引起插入突变。四、毒力岛（pathogenicity island, PAI）是20世纪90年代提出的一个新概念。PAI是指病原菌的某个或某些毒力基因群，分子结构与功能有别于细菌染色体，但位于细菌染色体之内，因此称之为“岛”。PA

8、I虽然是染色体的DNA片段，但两端往往具有重复序列与插入元件，其G+Cmol%及密码使用与细菌染色体有明显差异，分子量较大，多为3040 kb，也有达100 kb者。一般认为，PAI不位于质粒或附加体，基因编码的产物多为分泌性蛋白或细胞表面蛋白。一种病原菌可以有一个以上的毒力岛。毒力岛的生物学意义尚不清楚，推测其与细菌的毒力变异有关。鉴于毒力岛的结构特点，决定了它可在细菌的不同菌株甚至不同菌种之间进行DNA重组。有人指出，在环境中存在着致病菌株与非致病菌株，后者通过基因重组从前者获得了毒力岛，从而具备了致病性，而不是通过自身固有基因的修饰导致的毒力变异。目前一些新致病菌的出现有可能归咎于此。笫

9、二节 基因突变基因突变（gene mutation）简称突变，是变异的一种，指生物细胞遗传物质DNA分子结构突然发生了稳定的可遗传的变化。它是生物进化的一个重要因素。一、细菌变异的类型细菌的变异可分为非遗传性变异和遗传性变异。前者基因无改变，只是为了适应外界环境的不适而发生的暂时性性状改变，细菌的菌落形态变异多属于此；后者基因发生改变，引起相应性状的稳定可遗传的变化，因基因突变和基因重组所致。细菌的基因突变按发生改变的范围大小，分为染色体畸变（chromosomal aberration）和点突变（point mutation）。染色体畸变是指染色体的一大段发生了变化，它包括染色体结构上的缺失

10、（delection）、重复（duplication）、插入(insertion)、易位（translocation）、和倒置（inversion）。点突变是相应基因上的DNA链中一个或少数几个核苷酸对的改变，包括核苷酸对的置换（replacement），进一步可分为转换（transition）与颠换（transversion）和因缺失或插入而造成的移码（frame shift）。细菌的突变也可分为自发突变（spontaneous mutation）和人工诱变（induced mutation）。自发突变是在未经人工改变的外界条件下，自然发生的突变，它经常发生，但发生的机率（突变率）很低，通常

11、仅约106109。人工诱变是在应用诱变因素的影响下而发生的突变，其突变率常高于自然突变。二、细菌变异的常见表型细菌基因突变而表现的变异类型很多，常见有以下几种。（一）菌落形态变异细菌的菌落可大致分为两种类型，即菌落表面光滑、湿润，边缘整齐的光滑型（smooth type，S型）和菌落表面粗糙、枯干，边缘不整齐的粗糙型（rough type，R型）。在一定条件下，光滑型菌落可变为粗糙型，称为SR变异。SR变异，经常伴随着S型抗原的丧失和病原菌毒力由强变弱等性状的改变（表6-1）。表6-1 光滑型与粗糙型菌落的性状改变性状光滑型（S型）粗糙型（R型）菌落性状光滑、湿润、边缘整齐粗糙、枯干、边缘不整

12、齐菌体形态正常、一致可异常而不一致表面抗原具有特异性表面多糖抗原特异性表面多糖抗原毒力强弱或完全丧失对噬菌体的敏感性敏感不敏感生化反应性强弱在生理盐水或0.2%的台盼蓝中的悬浮均匀混悬自家凝集肉汤中的培养特性均匀混浊颗粒状生长，易于沉淀对正常血清杀菌作用的敏感性不敏感敏感对吞噬作用的抵抗力较强较弱荚膜细菌的荚膜形成可形成不形成（二）抗原变异由于细菌基因突变而引起其抗原结构发生改变的变异类型。当编码细菌的抗原结构包括菌体抗原、鞭毛抗原、荚膜抗原等的基因发生突变时，细菌形成相应抗原结构的能力丧失，引起细菌抗原性变异。如常见的细菌细胞壁缺陷变异（细菌L型等）、荚膜变异或鞭毛变异等。（三）抗性变异是对

13、某种化学药物或致死物理因子抗性的变异。通过自发突变以及抗性遗传因子的传递，而产生大多数抗性。它和化学药物的存在并无关系，细菌获得抗性以后，即使在没有药物的条件下生长繁殖数代，一般也不丧失抗性。但细菌对于青霉素、氯霉素、四环素、红霉素等抗生素可出现由于诱导而产生的耐药性，它并非起源于遗传因子的改变，而类似于诱导酶的产生，系基因所携带的遗传信息在表达过程中发生的诱导现象，例如培养枯草杆菌或蜡样芽胞杆菌于含少量青霉素G的培养基中时，可诱导这些细菌产生青霉素酶以破坏青霉素。（四）营养型变异营养缺陷型变异是细菌丧失合成一种或几种生长因子的能力，无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。如变异株丧失对某种

14、糖类、维生素、氨基酸或其它生长因子的合成能力，在补充这些营养物质的培养基上才能生长。这种突变对研究细菌代谢产物的生物合成途径很有用处。此外，营养型变异菌株可作为杂交、转化、转导和原生质体融合等研究中的标记菌种。三、诱发细菌变异的方法诱发突变是应用人工方法使细菌增殖和复制DNA时出现“错误”，从而育成人类需要的细菌变异品系。许多物理和化学因素可作为细菌的诱变剂，提高细菌的突变率。如下介绍常用的诱变方法及其致突变的机制。（一）物理方法包括温度及各种射线，如紫外线、激光等非电离辐射和射线、射线、射线、快中子等电离辐射。1. 温度：温度诱发基因突变的机制似乎是专一对GC碱基对的作用。包括使C脱氨基转换

15、为尿嘧啶（U），在复制中造成GCAT转换；以及引起G-脱氧核糖键的移动，从而在DNA复制过程中出现包括两个G的碱基对，在再一次复制中造成GCCG颠换。2. 辐射：辐射的诱变作用一般认为有直接作用和间接作用两个方面。前者是指辐射直接作用于染色体，包括引起DNA骨架断裂所造成的染色体畸变，和使DNA分子上相邻的T形成二聚体而引起的复制差错。间接作用是使染色体以外的细胞物质发生变化，再由这些物质作用于染色体引起突变；它包括碱基类似物的形成及其突变诱发作用，和电离辐射引起过氧化氢和游离基的产生以及它们对突变的诱发。（二）化学方法常用的化学诱变剂有碱基类似物（如5溴脱氧尿苷（UBr）、5氟脱氧尿苷、2氨

16、基嘌呤、8氮鸟嘌呤）、亚硝酸、羟胺、烷化剂（丙酸内酯和芥子气等）、亚硝基胍、吖啶类染料（吖啶黄、吖啶橙、原黄素等）、烷化剂和吖啶类结合的化合物（名为ICR191，是美国某癌症研究所的制品）、溴化乙锭等。它们的作用机制复杂而各有差异，总的说来主要有以下几方面。1. 取代DNA中的碱基，从而使DNA的某些碱基对发生置换。例如UBr是T的结构类似物，通常以酮式出现，能代替T与A形成氢键而配对；在较少的情况下，也能以烯醇式出现，此烯醇式可与鸟嘌呤（G）形成氢键。因此，当它代替T与A配对掺入DNA时，在以后的DNA复制中就可能引起AT对被GC对置换的突变发生（图6-1 a）；当它首先是代替C与G配对参入

17、DNA时，则在DNA复制中就可能出现GC对被AT对的置换（图6-1 b）。ATGCaAUBrbGUBrAT+GUBrGC+AUBrAT+ATGC+AUBrGC+GCAT+AUBr图6-1 5溴尿嘧啶的诱变机制2. 使碱基发生化学变构，从而引起DNA的某些碱基对发生置换。例如亚硝酸对碱基有氧化脱氨基作用，可以使C成为U与A配对，或A成为次黄嘌呤（H）与C配对，从而引起DNA的某些碱基对发生置换突变。3. 插入DNA相邻的碱基之间，引起移码突变。在邻近的两个嘌呤碱基之间插入吖啶染料分子，可引起DNA复制时碱基增添或缺失的错误，造成密码子的移码，出现基因突变。4. 引起DNA分子断裂而诱发染色体畸变

18、。例如许多烷化剂（氮芥、硫芥、环氧乙烷等）除能诱发点突变以外，还能诱发染色体畸变。其作用机制据认为是使DNA分子上的碱基被烷化以后，能够被核酸内切酶所断裂。亚硝酸也是一种很有效的诱发缺失的诱变剂。（三）生物学方法利用各种生物学的方法可诱使微生物发生变异，使细菌发生毒力等性状的改变，获得性能良好的菌株。1增强毒力：连续通过易感动物，可使病原菌毒力增强。有的细菌与其他微生物共生，或被温和噬菌体感染，也可增强毒力。例如产气荚膜梭菌与八叠球菌共生时毒力增强；肉毒梭菌当被温和噬菌体感染时，方产生毒素。2减弱毒力：病原菌毒力自发减弱的现象，常见于传染病流行末期所分得的病原菌株。人工减弱病原微生物的毒力通常

19、使用病原菌通过非易感动物、鸡胚等方法。如将禽霍乱强毒菌株通过豚鼠190代后，再经鸡胚传40代，育成禽霍乱弱毒菌株。无论自然变异弱毒株或人工培育的变异弱毒株，均由于DNA上核苷酸碱基顺序的改变的结果。第三节 基因的转移与重组在某种情况下，两个不同性状细菌的基因可以发生部分转移，经过基因间的重组(recombination)，形成新的遗传型个体。接受基因的细菌为受体菌，提供基因的细菌为供体菌。细菌的基因转移和重组的主要形式有转化、转导、接合、原生质体融合和转染。（一）转化(transformation)供体菌游离的DNA片段直接进入受体菌，使受体菌获得新的性状，称为转化。转化的发生过程，首先是供体

20、的DNA片段吸附于受体细菌的细胞膜上。这种吸附起先是可逆的，后来则不可逆，细胞膜上的双链DNA分解成单链，与一种特异的蛋白结合，穿入受体菌细胞内，与其DNA发生整合，取代一部分原来的DNA，受体菌由于获得外源的DNA而改变了遗传性状（图6-2）。20世纪20年代发现的肺炎链球菌的转化是经典范例转化现象不是所有细菌都有转化现象。大多数细菌不能接受外源性DNA，不能将它整合到染色体之中；另外，细菌还能产生内切酶，能识别并破坏进入细胞的外源性DNA。是否发生转化与菌株在进化过程中的亲缘关系有着密切的联系。同时受体菌必须处于感受态（competence）才能转化。（二）转导（transduction）

21、以温和噬菌体为媒介，把供体菌的DNA小片段携带到受体菌中，通过交换与整合，使受体菌获得供体菌的部分遗传性状，称为转导。获得新遗传性状的受体菌细胞，称为转导子（transductant）。细菌的转导又分普遍性转导和局限性转导，普遍性转导与温和噬菌体的裂解期有关，局限性转导则与温和噬菌体的溶原期有关。1. 普遍性转导（general transduction）：温和噬菌体在裂解期的后期，其DNA已大量复制，与外壳蛋白装备新的噬菌体时，大约105107分子之一的新噬菌体装配错误，将细菌DNA的裂解片段装入噬菌体外壳蛋白中，成为一个完全缺陷的转导性噬菌体（transducing phage）。误被装入

22、的DNA片段可以是供体菌染色体上的任何部分，也可以是质粒DNA。由这种噬菌体介导的转导，称为普遍性转导（图6-3）。当转导噬菌体侵入另一受体菌时，可将错装的供体菌DNA片段带入受体菌，出现两种结果，一种是供体菌DNA片段与受体菌的染色体DNA整合，使后者成为遗传性状稳定的转导子，称完全转导（complete transduction）；另一种情况是，有一些供体菌的DNA片段不能与受体菌染色体整合，仍保持游离状态，不自身复制，但能转录、翻译和表达性状，称为顿挫转导（abortive transduction）。2. 局限性转导（restricted transduction）：由噬菌体所介导的供

23、体菌染色体上个别特定基因的转导，称为局限性转导。例如噬菌体进入大肠杆菌，当处于溶源期时，噬菌体DNA整合在大肠杆菌染色体的特定部位，即在半乳糖苷酶基因（gal）与生物素基因（bio）之间，细菌受紫外线照射或化学因素作用后，噬菌体从溶原期进入裂解期，其DNA又从细菌染色体上分离，分离时会有106的噬菌体将其本身DNA上的一段留在细菌染色体上，却带走了细菌DNA上两侧的gal或bio基因，这种发生偏差的噬菌体，称为部分缺陷噬菌体，当此噬菌体再次侵入受体菌时，可带入原来供体菌的特定基因gal或bio（图6-4）。应当注意转导与溶源转换（lysogenic conversion）两者的差别。后者是指温

24、和噬菌体感染其寄主后，噬菌体基因整合于寄主基因组中，寄主的性状发生变异，它是一种表面上与转导相似但本质上却不同的特殊现象。当噬菌体在寄主中消失时，通过噬菌体转换而获得的性状也同时丧失。（三）接合（conjugation）是两个完整的细菌细胞通过性菌毛直接接触，由供体菌将质粒DNA转移给受体菌的过程。接合性质粒有F质粒、R质粒、Col质粒等。1. F质粒的接合：F质粒通过性菌毛由雄性菌（F+）转移给雌性菌（F）的过程，称为F质粒的接合。在受体菌获得F质粒时，供体菌并不失去F质粒。受体菌在获得F质粒后即变为F+菌，也长出性菌毛（图6-5）。大肠杆菌的F质粒进入F菌后，能单独存在，自行复制。但有小部

25、分F质粒可整合到受体菌的染色体上，与染色体一起复制。整合后的细菌能以高效率转移染色体上的基因，称为高频重组菌(high frequency recombinant，Hfr)。Hfr不稳定，F质粒可从染色体上脱离下来变为F+菌，终止其Hfr状态。从染色体上脱离下的F质粒有时可带有染色体上几个邻近的基因，这种质粒称为F质粒。当F质粒转入F菌时，F菌可同时获得这一部分新的基因而成为F菌。所以F质粒有类似转导中的温和噬菌体，起着基因载体的作用。这种通过F质粒转移基因称为性导（sexduction）。F+、Hfr、F三种菌都有性菌毛，均为雄性菌。2. R质粒的接合：细菌耐药性的产生主要是由于R质粒在菌株

26、间的迅速转移和快速生长繁殖所致。R质粒有两种功能不同的部分组成，一是耐药性转移因子（resistance transfer factor ，RTF），其作用类似F因子；另一种是耐药性因子（RF），它决定耐药性。RTF和RF均能自主复制，但是只有两者一起存在时，这个细菌才能将耐药性转移给另一个细菌。R质粒的接合方式类似F因子的转移方式，先由RTF控制，耐药菌（R+）长出R菌毛，和敏感菌（R-）相接触，RF即由R+菌转移至R-菌内。当RF与F因子一起共存于某个细菌细胞时，有些RF可以阻止F因子的转移，称为fi+（fertility inhibition）因子；而另一些不阻止F因子转移的RF，称为f

27、i- R因子。3. Col质粒的接合：Col质粒控制细菌素的合成，这类质粒很多，有的可以产生性菌毛，在细菌间进行接合转移，称为转移性质粒；有的不能进行在细菌间接合转移，称为非转移性质粒；但当细菌细胞同时具有可转移的质粒如F因子时，则两者可同时发生接合转移。（四）原生质体融合（protoplast fusion）通过人为的方法，使遗传性状不同的两细菌细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组，以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子(fusant)的过程，称为原生质体融合。原生质体融合技术是继转化、转导和接合之后一种更加有效的转移遗传物质的手段。当前，有关原生质体融合在育种工作中的研究甚多，

28、成绩显著，除不同菌株间或种间进行融合外，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物细胞间的融合。（五）转染（transfection）受体菌获得从噬菌体而非从其它供体菌提取的DNA的过程，称为转染。另外，转染一词更广泛地用于真核生物细胞，其含义有差别，指真核细胞通过病毒感染，获得某一片段DNA或RNA的过程。与原生质体融合一样，转染也是一种人为的手段，通常多用于哺乳动物细胞，往往为了获得重组病毒而设计。笫四节 细菌遗传变异研究的实际意义以细菌进行遗传学研究，不仅可揭示细菌本身的许多遗传变异规律，而且推动整个分子遗传学的迅速发展。在微生物学领域内，细菌遗传变异的研究也有助于对其他有关问题的了解和发展，

29、例如帮助了解微生物的起源和进化，微生物结构与功能的关系，原核生物性状的调节控制，以及推动微生物分类学的深入发展。在实践方面，细菌遗传变异的研究在以下若干方面具有重大的实用意义。（一）疾病诊断在临床细菌学检查工作中，要作出正确的诊断，不但要熟悉细菌的典型特性，还要了解细菌的变异规律和变异现象，这对于临床分离菌的鉴定与疾病诊断具有重要意义。（二）疾病预防和治疗由于抗生素的广泛使用，细菌可发生变异而形成对该药物的耐性，或形成必须有该药物才方能生长的赖药性（drug dependence）。所以，在治疗细菌疾病用药时，应选择敏感的抗菌药物，并应防止耐药菌株的扩散。菌苗接种是使机体建立特异性免疫，预防传

30、染性疾病的有效措施，弱毒菌苗株都是病原菌的减毒变异株，有较好的免疫效果。可通过人工致弱的方法获得弱毒疫苗菌株。目前菌苗的研究，进一步应用变异的原理，通过基因工程技术改变决定毒力的基因，获得符合既定目标的变异株，以更有效地制备理想的菌苗。（三）基因工程基因工程是用人工方法将所需要的某一供体生物的目的基因DNA片段提取出来，在离体的条件下用适当的工具酶切割，将它与载体(vector)的DNA分子连接构建重组载体，再将其导入某一易生长、繁殖的受体细胞中，让外源遗传物质受体细胞中进行正常的复制和表达，从而获得新的产物。基因工程的主要操作步骤有：（1）目的基因分离。（2）目的基因与载体DNA的体外重组，

31、形成一个完整的有复制能力的嵌合体（chimaera）。（3）重组载体导入受体细胞，通常用转化的方法，导入能容纳外源载体的受体细菌。（4）复制与表达。重组载体在受体细胞内必须自主复制而获得扩增，以表达目的基因特有的遗传性状或产物，使之成为“工程菌”。如将人胰岛素的人工合成基因组合到大肠杆菌的质粒上，然后再转移至菌体内，生产出胰岛素。近年来，应用微生物的遗传工程获得如脑啡肽、卵清蛋白、干扰素等，极大地改进了这些生物制剂的生产工艺。应用基因工程技术来使细菌表达病毒的抗原成分，用以制备新型诊断试剂或疫苗，或用一种细菌表达出二种细菌的抗原，制备多价菌苗等。第五节 病毒的遗传与变异（1.5学时）随着分子生物学理论和其技术的发展，极大地推动了病毒遗传和进化的研究，丰富了对病毒基因组结构与功能的认识，使病毒遗传学成为病毒学研究的热点之一。一、突变病毒复制中出现的差错均为突变(m