骨髓间充质干细胞对体外损悲伤肌细胞凋亡的阻碍.docx

1、骨髓间充质干细胞对体外损悲伤肌细胞凋亡的阻碍骨髓间充质干细胞对体外损悲伤肌细胞凋亡的阻碍 郭俊芳, 张赢予， 莫亚宏， 王好， 周艳芳， 张国辉 【摘要】 目的： 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)在体外共培育条件下对多柔比星(doxorubicin， DOX)损悲伤肌细胞凋亡的阻碍及可能机制。方式： 贴壁法分离、培育骨髓间充质干细胞，第3代MSCs用于实验。原代培育3天的SD乳鼠心肌细胞， mg/L浓度的DOX处置4 h，成立心肌细胞损伤模型。将心肌细胞分为正常对照组、DOX损伤组、DOX损伤+MSCs共培育组。ELISA法检测细胞条件培育基内胰

2、岛素样生长因子 1(insulin like growth factor 1，IGF 1)的浓度。MTT检测MSCs条件培育基对DOX损悲伤肌细胞活性的阻碍。并检测各组心肌细胞caspase 9,caspase 3活性及各组心肌细胞凋亡率。结果： 第3代MSCs及原代心肌细胞均有IGF 1分泌，但MSCs条件培育基内IGF 1的浓度明显高于心肌细胞。MSCs共培育组心肌细胞活性高于DOX损伤组，但低于正常对照组（P<。DOX损伤+MSCs共培育组caspase 9,caspase 3活性及心肌细胞凋亡率低于DOX损伤组，但高于正常对照组（P<。结论： MSCs对多柔比星诱导的心肌细

3、胞凋亡有爱惜作用，这种爱惜作用与旁分泌机制有关。 【关键词】 骨髓间充质干细胞； 心肌细胞； 共培育； 凋亡 Abstract Objective: To investigate the effects of mesenchymal stem cells(MSCs) on doxorubicin（DOX） injured cardiomyocytes apoptosis in vitro on the condition of co culture and the possible ： Mesenchymal stem cells(MSCs) were isolated and purifie

4、d by adherent screening method, then expanded in third passage was used for primary cultured neonatal SD rat cardiomyocytes were exposed to mg/L Doxorubicin for 4 h to establish experimental model of toxic cardiomyocytes after having been cultured for 3 cardiomyocytes were divided into 3 groups: cul

5、tured alone(control group), DOX injured, DOX injured and co cultured with the level of insulin like growth factor 1(IGF 1) in the conditioned medium was measured with ELISA effects of MSCs condition medium on cardiomyocytes viability was determined by MTT activity of caspase 9 and caspase 3 were mea

6、sured by caspase cardiomyocyte apoptosis was detected by Annexin V FITC. Results： IGF 1 was significantly higher in the medium from cultured MSCs than in the medium from cultured viable cell number was larger in MSCs conditioned medium group than that of DOX injured group, but both decreased compare

7、d to control group(P<.The activity of caspase 9,caspase 3 and the apoptosis rate decreased significantly in co cultured group compared with the DOX injured group, but increased compared to control group（P<. Conclusion： It was concluded that paracrine mediators secreted by MSCs were involved in

8、 preventing DOX induced cardiomyocytes apoptosis. Key words mesenchymal stem cells； cardiomyocytes； co culture； apoptosis 最近几年来，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)由于具有获取方便、分化能力强、低免疫原性且无排斥反映等优势, 在修复损悲伤肌、改善心功能方面有专门大临床应用潜力，被国内外众多研究者所关注。传统观点以为，骨髓间充质干细胞在受损心肌微环境内能定向分化为心肌细胞1，改善心脏功能。但近来的一些研究对这种观点提出了质疑，以为细

9、胞医治增进了内生性的修复进程，而不是心肌细胞和血管内皮细胞的再生，旁分泌作用可能是其修复作用的基础2。本实验通过骨髓间充质干细胞与多柔比星(doxorubicin，DOX)损悲伤肌细胞的体外非直接接触共培育，观看MSCs对体外损悲伤肌细胞凋亡的阻碍，并探讨其可能作用机制。 1 材料和方式 要紧材料和试剂 实验动物 4周龄SD大鼠（100120 g）5只，13日龄新生SD大鼠30只，雌雄不限，由江苏大学实验动物中心提供。 要紧试剂 新生牛血清（Hy clone公司），胎牛血清（GIBCO公司），L DMEM干粉培育基（GIBCO公司），胰蛋白酶（Sigma公司），型胶原酶（Sigma公司），甲基

10、四唑蓝（MTT，Sigma公司）， 横纹肌肌动蛋白抗体免疫组化试剂盒（ SA，武汉博士德生物技术），Caspase 3和Caspase 9检测试剂盒（南京凯基生物科技公司），Annexin V FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技公司），多柔比星(DOX，浙江海正药业)。 细胞分离和培育 MSCs的分离和培育 拉颈脱臼处死4周龄SD大鼠，75%乙醇中浸泡5 min，无菌操作下掏出双侧的胫骨和股骨，用装有不含血清的无菌L DMEM培育基的注射器冲洗骨髓腔和干骺端，搜集冲洗取得的细胞悬液，1 500 r/min离心10 min，弃上清，用培育基反复吹打沉淀，混匀，计数，以3108/ml的浓

11、度种入含10%胎牛血清的完全培育基中（L DMEM培育基+10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+100 U/ml链霉素），并接种于50 ml的培育瓶中。在37,5%CO2及饱和湿度的培育箱中培育48 h后第一次全量换液，以后每距离34 d全量换液1次，710 d左右长至80%融合时用%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，继续传代培育。第3代MSCs用于实验，并用流式细胞仪检测第3代MSCs表面标志CD45和CD90的表达。 原代心肌细胞的分离和培育 无菌取13日龄乳鼠心脏，将组织块剪成1 mm1 mm1 mm的小块，加入等体积的%胰蛋白酶和%型胶原酶混合溶液，37恒温振荡分次消化，搜集各次消化的上清液并

12、过滤，1 000 r/min离心10 min，弃去上清后将细胞重悬于含10%新生牛血清的DMEM培育液中，然后接种于90 mm培育皿,置CO2培育箱中培育2 h，差速贴壁法去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。取心肌细胞悬液 ml与等量%台盼蓝液混匀，接种于细胞计数板上，于显微镜下观看，计算细胞悬液中的活细胞数，并调整细胞浓度至3105/ml。制备心肌细胞爬片，依照 SA免疫组化试剂盒的说明进行细胞染色，进行细胞纯度鉴定。 DOX诱导心肌细胞损伤模型及共培育体系的成立 新分离并差速培育后的原代心肌细胞，按3105/ml的浓度加入96孔培育板（200 l/孔）或6孔培育板（3 ml/孔），置CO2培育箱

13、中培育，培育72 h后用于实验。加入终浓度为1 mg/L的DOX（以含10%新生牛血清的L DMEM培育基配制）作用4 h，改换无血清培育基或含10%新生牛血清的L DMEM培育基。成功成立心肌细胞损伤模型后，在6孔培育板内置入插入式培育皿Millicell装置，Millicell装置内加入第3代MSCs悬液，心肌细胞和MSCs的比例为11，成立共培育体系。 细胞条件培育基的制备及IGF 1的测定 取传至第3代的MSCs及原代心肌细胞，别离按3105/ml的浓度加入6孔培育板，常规培育24 h后改换为无血清培育基，继续培育48 h后吸取培育板内的培育基，2 000 r/min离心10 min，

14、留取上清液作为条件培育基， 20保留。ELISA试剂盒检测条件培育基内胰岛素样生长因子 1（IGF 1）的浓度。 实验分组 依如实验要求分为正常心肌细胞对照组，DOX损伤组，DOX损伤+MSCs共培育组或DOX损伤+MSCs条件培育基组。 检测指标及方式 MTT法检测心肌细胞存活力 96孔培育板内培育72 h后的心肌细胞，分为正常心肌细胞对照组15孔：4 h后改换为无血清培育基；DOX损伤组15孔：1 mg/L浓度的DOX作用4 h后改换为无血清培育基；DOX损伤+MSCs共培育组15孔，1 mg/L浓度的DOX作用4 h后改换为MSCs条件培育基。继续培育48 h，每孔依次加入MTT及二甲基

15、亚砜，酶标仪检测各孔光密度D值（490 nm）。 心肌细胞caspase 9,caspase 3活性的测定 6孔培育板内培育72 h后的心肌细胞，分为正常心肌细胞培育组、DOX损伤组、DOX损伤+MSCs共培育组。每组均为6孔。继续培育48 h后依照试剂盒的说明测定各组心肌细胞caspase 9和caspase 3的活性。 Annexin V FITC流式细胞仪检测心肌细胞凋亡 6孔板内原代培育72 h后的心肌细胞，依照上述方式分为正常对照组、DOX损伤组、DOX损伤+MSCs共培育组，每组均为6孔，48 h后依照Annexin V FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明检测各组心肌细胞凋亡情形。

16、统计学处置 实验数据以均数标准差(s)表示，用统计软件进行处置，多组均数间比较采纳方差分析，P< 为不同有统计学意义。 2 结 果 MSCs培育、扩增和鉴定 原代MSCs培育24 h后即有少量细胞贴壁，细胞形态呈多边形或梭形，随着时刻的推移，贴壁细胞增多，并可见细胞克隆形成，第710天左右细胞可达80%90%融合。传代的细胞生长比原代要快，12 h后几乎全数贴壁并迅速割裂增殖，形态更均匀，为成纤维样，排列呈螺旋状或漩涡状。流式细胞仪检测第3代MSCs CD90(动物干细胞表面标志)表达阳性，阳性率达%，而CD45(造血细胞表面标志)阴性。 心肌细胞培育和鉴定 差速培育后的心肌细胞呈圆形，

17、%台盼蓝染色显示心肌细胞存活率在90%以上。培育12 h后细胞大体贴壁，慢慢变成梭形、三角形、多边形等形态，并显现自发性搏动，第3天细胞伸出的伪足彼此接触交织成网，慢慢形成细胞簇，搏动呈同步性，频率为80150次/min。 SA免疫组化染色显示胞质肌动蛋白染色阳性细胞在95%以上。 条件培育基内IGF 1测定结果 结果显示体外培育的MSCs及心肌细胞均有IGF 1的分泌，但MSCs条件培育基内IGF 1的浓度明显高于心肌细胞条件培育基（图1），不同有统计学意义（P<。 MSCs条件培育基对DOX损悲伤肌细胞活性的阻碍 实验结果说明，DOX损伤组心肌细胞活性明显下降，DOX损伤+MSCs共

18、培育组心肌细胞活性增加，但仍低于正常心肌细胞对照组，不同有统计学意义（图2）。 各组心肌细胞caspase 9和caspase 3活性的转变 检测结果如表1所示，DOX损伤组及MSCs共培育组心肌细胞caspase 3,caspase 9 活性均明显高于正常对照组，而MSCs共培育组caspase 3,caspase 9 活性低于DOX损伤组，不同具有统计学意义(P<。表1 MSCs对DOX损悲伤肌细胞caspase 9和caspase 3活性的阻碍 共培育条件下MSCs对DOX诱导损悲伤肌细胞凋亡的阻碍 1 mg/L DOX作用4 h后，心肌细胞初期凋亡率及总凋亡率均增加，和MSCs共

19、培育48 h后，凋亡率下降，但与正常心肌细胞对照组相较，凋亡率仍有增加，不同有统计学意义（图3和表2)。表2 MSCs对DOX诱导损悲伤肌细胞凋亡的阻碍 3 讨 论 病理性细胞凋亡是心肌细胞丧失的形式之一，是心血管疾病发生和进展的基础3。尽管最近的研究显示心脏内存在干细胞，心肌坏身后有少量心肌干细胞发生割裂增生4，但发生割裂增生的心肌干细胞数量极少，要紧靠形成瘢痕组织进行修复，最终进展成慢性心力衰竭。因MSCs具有自我复制能力、多向分化潜能及低免疫原性，国内外很多学者致力于MSCs在心血管疾病医治方面的研究,从基础实验到临床前期研究，一些客观检查指标说明疗效显著，对改善病情和预后起到了踊跃的作

20、用。 MSCs移植改善受损心脏功能的机制目前存在专门大的争议。Stamm等5研究以为MSCs移植到受损的心脏组织内以后，能定向分化为心肌细胞和血管内皮细胞，从而替代了受损的心肌细胞，改善心脏功能。但Shake等6研究发觉，在心肌细胞移植后，尽管能够在心肌和血管内皮细胞中观看到荧光标记的细胞存在，但数量超级有限，90%左右的移植细胞在移植后24 h内死亡，而细胞移植72 h后心脏的功能就有了明显的提高，心肌细胞定向分化难以说明心脏功能改善的结果，以为这可能与移植细胞分泌内源性血管活性物质有关，并非移植细胞分化为心肌细胞再生心肌的效应。 新近有实验说明，在心肌梗死的动物模型中，不仅表现为细胞移植后

21、心功能的改善，将转染AKT基因的MSCs培育后的上清液（无细胞）注入体内，心脏功能也有明显的改善7。这些均对以往以为MSCs是通过度化为心肌细胞而起作用的观念提出了质疑，以为MSCs对心脏的修复功能包括了旁分泌因子的作用，这些旁分泌因子有助于抑制心肌细胞的凋亡、增进微血管和毛细血管的生成、抑制胶原纤维的合成和心肌的重构。 多柔比星（DOX）是临床经常使用的化疗药物，与心肌细胞有特殊的亲和力，容易在心脏内特异性蓄积并产生心脏毒性，长期用药可引发剂量依托性的充血性心力衰竭，经常使用来制造心衰动物模型。DOX的心脏毒性要紧与其产生活性氧自由基（ROS）引发脂质过氧化及增进心肌细胞凋亡有关。半胱天冬蛋

22、白酶（caspase）是参与细胞凋亡机制的要紧成份，当心肌细胞在DOX作用下，细胞色素C释放，激活caspase 9，后者再激活其下游的caspase 3，诱导心肌细胞凋亡8。 本实验结果显示体外培育MSCs及心肌细胞均有自分泌能力，能分泌胰岛素样生长因子（IGF 1），前者分泌IGF 1的能力超事后者，而IGF 1在体内外能增进多种细胞的增殖、分化，同时能抑制细胞的凋亡和坏死，对心脏的发育、心肌细胞肥大、再生及抑制心肌细胞凋亡有重要作用，是一种重要的调剂因子9。MTT法检测心肌细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性，能间接反映心肌细胞的生长情形，本组结果提示MSCs条件培育基可增进受损心肌细胞的生长，

23、与MSCs分泌的促生长因子有关。 Millicell插入式培育皿是一种特殊的细胞培育装置，其半透膜的孔径为 m，能许诺细胞因子通过，而细胞不能通过。MSCs和DOX损悲伤肌细胞通过Millicell装置共培育，在模拟心肌微环境但非细胞直接接触的条件下，MSCs对DOX诱导的caspase 9及caspase 3激活有抑制作用，同时抑制了DOX诱导的心肌细胞凋亡。结合细胞条件培育基内细胞因子检测结果，提示MSCs能分泌促生长因子和抗凋亡因子，并通过旁分泌途径对心肌细胞产生了爱惜作用。 总的来讲，MSCs作为成体干细胞，在医治心血管疾病的领域具有壮大的吸引力，但在临床实践中MSCs要达到所期望的成

24、效还有许多困难要克服，还面临许多挑战，仍然需要更多的基础和临床实验来明确细胞的生物学特性及作用机制，以进一步优化MSCs的医治。【参考文献】 1 Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, et mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heartJ.Circulation,2002,105(1):93-98.2 Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, et derived stromal cells expres

25、s genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanismsJ.Circ Res,2004,94(5):678-685.3 Lockshin cell death: history and future of a conceptJ.Soc Biol, 2005, 199(3): 169-173.4 Beltrami AP， Urbanek K, Kajstura J，et that h

26、uman cardiac myocytes divide after myocardial infarctionJ.New Engl J Med,2001,344(23):1750-1757.5 Stamm C, Westphal B, Kleine HD, et bone marrow stem cell transplantation for myocardial regenerationJ.Lancet,2003,361(9351):45-46.6 Shake JG, Gruber PJ, Baumqartner WA, et stem cell implantation in a sw

27、in myocardial infarct model: engraftment and functional effectsJ.Ann Thorac Surg, 2002,73(6): 1919-1925.7 Gnecchi M, He H, Liang OD, et action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt modifie mesenchymal stem cellsJ.Nat Med,2005,11(4):367-368.8 Wu S, Ko YS, Teng MS, et induced cardiomyocyte and endothelial cell apoptosis in vitro and in vivo studiesJ.J Mol Cell Cardiol,2002,34(12):1595-1607.9 Laustsen PG, Russell SJ, Cui L, et roal of insulin and insulin like growth factor 1 receptor signaling in cardiac development and functionJ.Mol Cell Biol,2007,27(5):1649-1664.