病原细菌鉴定方法.docx

1、病原细菌鉴定方法病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：126 字号： 大 中 小 一、实验目的系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。二、知识背景细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项：1病料采集（1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为：全身感染血液及内脏；局部感染病患部位；特殊病例

2、特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织（2）病料的采集时间也应特别注意：活体病料应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化；患畜死后应立即采集病料，越早越好。2无菌操作无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，

3、玻璃器皿可高压灭菌也可干热灭菌，胶皮塞、培养基等则要高压灭菌。3培养基培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。（1）制作培养基的基本原则依据细菌的物质代谢要求和营养需要，必须含有细菌生长繁殖所需要的碳源、氮源、矿物质以及生长环境条件。（2）制作培养基的基本要求适宜的水分和各种营养物质；适宜的酸碱度与渗透压；不含抑制细菌生长的物质；应均质透明；应彻底灭菌；对某些微生物必须提供一些特殊物质。（3）培养基的种类 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物质；可作为一些特殊培养基的基础成分。 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质（如血

4、液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对营养要求高的微生物。 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物的目的。 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；从而达到区分不同的微生物。 厌氧培养基：利用物理、化学或生物学方法，去除氧气后的培养基；可用于厌氧性细菌的分离和培养。4细菌在培养基上的生长情况（1）固体培养基单个细菌在培养基表面生长、繁殖到一定程度时形成的肉眼可见的子细胞群

5、落称为菌落，它是由数以万计相同的细菌集合而成。众多细菌在固体培养基表面密集生长所形成的细胞群体称为菌苔。 菌落的形态特征大小、形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为3型：光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，新分离的细菌大多呈光滑型菌落。粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗

6、原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型，如炭疽孢杆菌、结核分枝菌等。粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光泽、似水珠样。多见于厚荚膜或丰富粘液层的细菌、结核杆菌等。 菌落溶血特征溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现12mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。 色素有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。 气味某些细菌在培

7、养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、白色假丝酵母菌（酵母味）和放线菌（泥土味）等。（2）液体培养基细菌在液体培养基中有3种生长现象：大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊；少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌等则呈沉淀生长；枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。（3）半固体培养基半固体培养基主要用于细菌动力试验，有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线两边的培养基仍然澄清透明，为动力试

8、验阴性。5分离细菌所要满足的培养条件（1）适宜的培养基条件；（2）适宜的温度条件；（3）适宜的气体条件。三、细菌的分离方法细菌分离就是把病料中的病原菌或把目的菌从微生物的混合材料中分离培养出来，并获得目的菌的单一生长材料，从而进行诊断及有关研究工作。1待检材料的处理无菌采集的病料不经处理可直接用于分离；污染较严重的病料，接种前必须处理后方可进行分离培养。（1）加热处理法当怀疑病原菌为芽胞菌时，可加入5-10倍灭菌生理盐水研磨(液体病料除外)，75水浴30min(或80 15-20min)，可杀死细菌繁殖体(包括杂菌及病原菌)；然后将处理过的病料接种到适当的培养基上。（2）接种易感动物把病料接种

9、易感动物，待其发病死亡后，取其血液或组织器官，接种到培养基上。利用此方法不但可以从污染的材料中分离出病原菌，而且还可以确定病原菌的毒力。（3）化学药品处理有些化学药品对某些细菌有极强的抑制力，而对另一些细菌则没有抑制作用或很小。因此可将适宜的化学药品加入培养基中。如龙胆紫则可抑制许多G菌的繁殖，有利于G菌的分离培养；2平板划线分离培养法（1）培养基平板的准备取普通琼脂培养基或含有特殊成分的琼脂培养基，融化并让其冷却至50左右，倾入灭菌平皿中，每个平皿约15mL，使其分布均匀，冷却凝固后即为固体平板培养基。（2）各种物品的准备取出待检病料，置于工作台上；接种前准备好酒精灯、接种环、火柴、酒精棉球

10、、试管架等。如有超净工作台，应先打开通风机，过滤除尘，如有紫外线灯应同时打开，10-15min后可开始工作。不论在桌面上还是在超净工作台上接种，都要事先作好准备工作，把所用的物品器械摆好。 （3）平板划线以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底,拇指和食指打开上盖，使盖与底成30角，以便划线。右手握接种环，先灭菌铂丝部分，待丝烧红后，再于火焰上灭菌金属棒部分。把接种环上的病料涂在培养基一侧，一般作5-8次划线。将环上的多余细菌材料烧掉后，从第1次划线引出第2次划线；再从第2次划线引出第3次划线，如此反复3-4次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后

11、的1-2次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。（4）培养物的观察病料在接种培养基后，经过一段时间，应取出来检查其生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有，则需进一步检查菌落是否纯一。当从临床病料中分离细菌时：多数情况下，沿划线生长较多的菌落，是待检病原菌的可能性较大；少数零散分布或不在划线上生长的菌落，多为杂菌。为慎重起见，可挑选若干个可疑菌落分别进行鉴定。3厌氧菌的分离培养法通常使用物理去氧、化学去氧和生物去氧，实验室常用：厌氧培养箱、厌氧肉汤4细菌的纯培养与移植接种 分离培养的目的就是要获得纯培养。细菌的纯培养就是只含一种细菌的培养物，最理想的纯培养是一个细菌的后代。细菌的移植接种

12、就是把某种细菌材料移种到一个新的培养基上，使它在其上生长。四、细菌的培养技术根据目的和要求的差异，可采取不同的培养方法1、表面培养又称固体表面培养。将细菌液均匀地接种于固体培养基表面,平放静置培养，然后收集菌苔。2、深层培养将细菌液接种于液体培养基进行培养。包括液体静置深层培养和生物反应器（发酵罐）深层培养。3、透析培养根据小分子能透过半透膜扩散，而将不同分子量的物质分离原理设计的一种细菌培养装置进行细菌培养。五、细菌的生化试验细菌由于其种类不同，对营养物质的吸收与排出，分解与合成的能力不同，这与细菌本身所固有的和环境诱导的酶有密切关系，细菌在自然界是一种巨大的生化动力，在它们的代谢过程中往往

13、同时产生多种代谢产物，有些对人类有利，有些会引起动植物和人类疾病，细菌的这些合成和分解代谢产物具有种的特异性，我们可借此来进行细菌种的鉴定。1、氧化型与发酵型（O/F）的测定（1）原理不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发酵。这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。（2）培养基成分：蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，琼脂4g，葡萄糖10g，0.2%溴麝香草酚蓝（BTB）12mL，蒸馏水1000mL制法：将蛋白胨、琼脂、盐类和水混合，加热融解，调pH为7.2，然后加葡萄糖和指示剂，混合加热10min，分

14、装试管，加塞包装，115高压蒸汽灭菌20min，取出使成琼脂柱。（3）试验方法 用18-24h斜面培养物接种于两管O/F培养基，穿刺接种，距管底有一定距离。 加lmL灭菌的液状石蜡油到一个O/F试验管作发酵试验 37下孵育48h或更长点时间（4）结果判定 只在没有覆盖石蜡油的一管发酵糖产酸或产酸产气者属氧化型（或呼吸型） 两管均发酵糖产酸或产酸产气者为发酵型2 、糖类分解（发酵）试验（）原理细菌分解糖的能力是受遗传基因控制的，是细菌含有直接分解糖的酶或诱导产生的酶作用的结果，是细菌种的特征的表现，可帮助细菌的鉴定，含糖培养基中含有指示剂，若某细菌分解糖则产酸（发酵）或产酸产气（氧化），会使培养

15、基的指示剂改变颜色，可判断细菌是否分解某种糖或醇或其他碳水化合物。（）培养基需氧菌常用邓亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液加0.5%-0.7%的琼脂1.6%溴甲酚紫酒精溶液+特定糖或醇（见附录）（有市售各种微量发酵管也可用）。厌氧菌用含胨、盐、硫羟代乙醇酸钠、琼脂的高层半固体培养基半指示剂同上。（3）试验方法 琼脂斜面培养物用接种针挑取少量菌穿刺接种于糖发酵管深部（勿穿到管底！）。 若所要接种的细菌营养要求高，则需要先将糖发酵管加热融化后，再加几滴除菌的马血清（牛血清也可），摇匀待凝固后再行接种（如巴氏杆菌、布鲁氏菌等）。 将接种管标记清楚放人37孵育，24-48h观察结果，有的菌对某一糖的发酵

16、属迟缓作用，则需要培养一个月之久。（4）结果判定无变化 培养基不变色产 酸 培养基变黄产酸产气 培养基变黄并有气泡3、淀粉水解试验（1）原理有的细菌具有淀粉酶，能水解培养基中的淀粉成麦芽糖。淀粉水解后遇碘液不再呈蓝紫色反应。（2）培养基与试剂 3%可溶性淀粉琼脂平板（见附录）和革兰氏碘溶液（见附录一）（3）试验方法 将细菌划线接种于3%可溶性淀粉琼脂平板上，在37培养24h。 取出平板，在菌落处滴加碘液少许，观察。 培养基呈深蓝色，说明淀粉未被水解，即淀粉酶阴性。能水解淀粉的细菌其菌落周围有透明的环（即淀粉酶阳性）。4、吲哚（靛基质）试验（1）原理有些细菌（如大肠埃希氏菌）能分解蛋白质中的色氨

17、酸生成吲哚，后者与对位二甲基氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。（2）培养基：邓亨氏蛋白胨水溶液（见附录）。（3）试 剂：欧立希氏（Ehrlichs）试剂 Kovacs试剂对位二氨基苯甲醛 1g 对位二氨基苯甲醛 5g无水乙醇 95ml 戊醇（或异戊醇） 75ml浓盐酸 20ml 浓盐酸 25ml先用乙醇溶解试剂后加盐酸，避光保存。（4）试验方法 试管试验法：以接种环将待检菌新鲜斜面培养物接种于邓亨氏蛋白胨水溶液中，置37培养24-48h （可延长4-5d）。于培养液中加入戊醇或二甲苯2-3mL，摇匀，静置片刻后，沿试管壁加入欧立希氏或Kovacs试剂2mL。在戊醇或二甲苯下面的液体变为红色

18、者为阳性反应。 斑点试验法：将一片滤纸放在培养皿的盖子上或一张载玻片上；滴加1-1.5ml试剂液于滤纸上使其变湿；取18-24h血琼脂平板培养物涂布于浸湿的滤纸上；在1-3min内棕色的试剂由紫红变为红色者为阳性。 加热试验法：将一小指头大的脱脂棉，滴上两滴欧立希氏试剂，再在同一处加滴上两滴高硫酸钾（K2S2O8）饱和水溶液，置于含培养液的被检试管中，离液面约半寸；将被检试管放入烧杯或搪瓷缸水浴煮沸为止；脱脂棉上出现红色者为阳性。5、甲基红（M.R）试验维倍（V-P）二氏试验。（1）原理甲基红是一种pH指示剂，pH的变色范围为pH4.4（红色）pH6.2（黄色），当细菌分解培养基中葡萄糖产酸，

19、且产酸量大致使培养基在加入甲基红指示剂后显红色为阳性。V-P试验则是某些细菌能使葡萄糖发酵而产生丙酮酸，丙酮酸再变为乙酰甲基甲醇，乙酞甲基甲醇又变成2,3,丁二烯醇，2,3,丁二烯醇在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用产生粉红色化合物。通常M.R和V-P试验是密切相关的，如果一个微生物M.R是阳性，则V-P是阴性；或者相反。这个试验对区别大肠埃希氏菌与肠杆菌是特别有用的。（2）培养基 葡萄糖蛋白胨水溶液（见附录）。（3）试剂 M.R试剂甲基红 0.02g95%酒精 60mL蒸馏水 40mL V.P试剂甲液：萘酚酒精溶液（萘酚5g无水乙醇100mL）乙液：KOH溶液（KOH 4

20、0g，水100mL）将甲液和乙液分装棕色瓶中，于4-10保存。或硫酸铜 1g浓氨水 40mI10%KOH 950mL蒸馏水 10mL待溶解后分装棕色瓶中备用。（4）试验方法 M.R试验：接种细菌于培养基中，在37培养24-48h后。于培养物中加入几滴试剂，变红色者为阳性反应，桔红到黄色则为阴性。 V-P试验:取出培养24hV.P试验用葡萄糖蛋白胨溶液lmL。将6%小萘酚酒精溶液0.5mL加入，随后加16%KOH 0.5mL，轻摇，然后让其静置10-15min。在15min内出现红色者则为阳性，1h后可出现假阳性。6、柠檬酸盐利用试验（1）原理在这个培养基中柠檬酸钠为唯一的碳源，磷酸铵是唯一的氮

21、源，若细菌利用这些盐作为碳素和氮素来源而生长，利用柠檬酸钠则生成碳酸盐以及铵盐被利用所产生的NH3+转变为NH4OH，使培养基变碱，pH升高，指示剂溴麝香草酚蓝就显出深蓝色。（2）培养基西蒙氏（Simmons）柠檬酸钠琼脂斜面培养基（见附录）。（3）试验方法将被检菌纯培养物或单个菌落划线于柠檬酸钠琼脂斜面并在37培养24-48h。肠杆菌、枸椽酸杆菌和一些沙门氏菌种产生阳性反应，可见菌体生长好或培养基显为深蓝色。7、石蕊牛乳试验（1）原理石蕊是一种指示剂，当pH升至8.3时碱性显蓝色，pH降至4.5时酸性显红色；pH接近中性，未接种的培养基为紫蓝色故称紫乳。石蕊也是一种氧化还原指示剂，可以还原为

22、白色，所以，石蕊牛乳（紫乳）是用来测定被检细菌几种代谢性质的一种鉴别培养基。（2）培养基加石蕊酒精饱和溶液于新鲜脱脂乳中，分装小管，经流通蒸汽灭菌而成。（3）试剂石蕊酒精溶液的制备：8g石蕊在30mL的40%乙醇中研磨，吸出上清液，加乙醇研磨，连续两次。加40%乙醇总量100mL，并煮沸1min。取用上清液，必要时可加几滴1mol/L盐酸使呈紫色。现多用溴甲酚紫代替石蕊，即于100mL脱脂乳中加1.2mL 1.6%溴甲酚紫酒精溶液。（4）试验方法与解释将被检菌接种于紫乳，置37温箱培养，观察结果。若细菌分解乳糖产酸，指示剂变色（石蕊为红色，溴甲酚紫为黄色）。若产酸产气，使牛乳酸凝，气体使凝块中

23、有裂隙，如产气荚膜梭菌呈“暴烈发酵”。若为紫色，表示乳糖虽未分解；若为蓝色表示乳糖虽未发酵，但细菌分解培基中所出现的氮源物质而产碱所致。若指示剂还原则为无色，常出现在酸凝块形成之后。8、硫化氢试验（1）原理凡细菌能分解含硫氨基酸，产生H2S者，其所产生的H2S会使培养基中的醋酸铅（或含醋酸铅的湿润滤纸条）或FeCl3形成黑色的硫化铅或硫化铁。（2）培养基 醋酸铅琼脂（见附录）。 三糖铁琼脂斜面（见附录）。 营养肉汤，肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面。（3）试验方法与解释 用接种针蘸取纯培养物，沿试管壁作穿刺，37孵育24-48h或更长时间，培养基变黑者为阳性。 或将纯培养物接种于肉汤，肝浸汤

24、琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面，在试管壁和棉花塞间夹一6.50.6cm大小的试纸条（浸有饱和醋酸铅溶液），培养于37，观察，纸条变黑者为阳性。9、硝酸盐还原试验（1）原理有些细菌能从硝酸盐提出氧而将其还原为亚硝酸盐（偶而还会形成NH3+ N2、NO、NO2和NH4OH的其它产物），若向培养物中加入对氨基苯磺酸和-萘胺，会形成红色的重氮染料对磺胺苯-偶氮-萘胺，这对鉴定细菌是有用的试验（锌也可还原硝酸盐为亚硝酸盐，而且对区别假阴性反应和真阴性反应是有用的）。（2）培养基 适用于需氧菌的硝酸钾蛋白胨水。 适用于厌氧菌的硝酸盐培养基。（3）试剂甲液：甲基-萘胺0.6g 5mo1/L冰醋酸100mL稍加

25、热溶解，用脱脂棉过滤，放棕色瓶中，4-10保存。乙液：对氨基苯磺酸0.8g 5mol/L冰醋酸100mL先用5mo1/L冰醋酸30mL溶解对氨基苯磺酸，再加冰醋酸至100mL。放入带玻璃塞的玻璃瓶中4-10保存。（4）试验方法与解释用纯菌培养物接种到硝酸盐培养基中，在37培养18-24h，再加试剂甲和乙各3-5滴，在30s内出现红色即为阳性。若无颜色出现，加少量锌渣，随后出现红色则是真正的阴性试验。10、尿素酶试验（1）原理细菌分解尿素产生两分子氨，使培养基pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有尿素酶。（2）培养基 Christensens尿素琼脂培养基，内含尿素，蛋白陈和酚红指示剂（见

26、附录）。（3）试验方法用接种环将待检菌培养物接种于尿素琼脂斜面，不要穿刺到底，下部留作对照。置37培养，于1-6h检查（有些菌分解尿素很快），有时需培养24h到6d（有些菌则缓慢作用于尿素）。阳性反应，则琼脂斜面由粉红到紫红色。11、接触酶试验（1）原理本试验是检测细菌有无接触酶的存在，过氧化氢的形成看作是糖需氧分解的氧化终未产物，因为H2O2的存在对细菌是有毒性的，细菌产生酶将其分解，这些酶为接触酶（过氧化氢酶）和过氧化物酶。（2）试剂 3%H2O2（新配）。（3）试验方法与解释可用接种环将一菌落放于载玻片的中央，加一滴3%H2O2于菌落上，立即观察有无气泡出现，也可在菌落和H2O2混合物之

27、上放一张盖玻片，可帮助检出轻度反应，还可降低细菌的气溶胶颗粒的形成。也可直接将3%H2O2加到培养琼脂斜面或平板上直接观察有无气泡出现（血琼脂平板除外）。12、氧化酶试验（1）原理测定细菌细胞色素氧化酶的产生。阳性反应限于哪些能够在氧气存在下生长的同时产生细胞内细胞色素氧化酶的细菌。（2）试剂1%四甲基对苯二胺（Tetra-methy-p-phenylene diamine dihydrochloride），新鲜配制，装棕色瓶贮存4，一个月。（3）试验方法加2-3滴试剂于滤纸上，用一搅拌签挑取一个菌落到纸上涂布）观察菌落的反应。阳性反应在5-10s内由粉红到黑色，15min后可出现假阳性反应。

28、也可将试液滴在细菌的菌落上，菌落呈玫瑰红色然后到深紫色者为阳性。也可在菌落上加试液后倾去，再徐徐滴加用95%酒精配制的1%的（-萘酚溶液，当菌落变成深蓝色者为细胞色素氧化酶阳性。（4）注意事项 作时只能使用搅拌签（或铂金环），因为铁丝会出现假阳性反应。 不要使用含葡萄糖培养基上生长的菌落，因为它的发酵作用会抑制氧化酶的活性，可能给予假阴性结果。13、苯丙氨酸脱氨酶试验（1）原理若细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能将培养基中的苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂变为绿色。变形杆菌和普罗菲登斯菌以及莫拉氏菌有苯丙氨酸脱氨酶的活力。（2）培养基与试剂 培养基：DL-苯丙氨酸2g，氯化钠5g，（L

29、苯丙氨酸1g），琼脂12g，酵母浸膏3g，磷酸氢二钠1g，蒸馏水1000mL，分装于小试管内，121高压蒸汽灭菌10min，作成斜面。 试 剂：10% FeCl3水溶液（3）试验方法将被检菌18-24h培养物取出，向试管内注入0.2mL（或4-5滴）10%FeCl3，溶液于生长面上，变绿色者为阳性。14、氨基酸脱羧酶试验（1）原理这是肠杆菌科细菌的鉴别试验，用以区分沙门氏菌（通常为阳性）和枸椽酸杆菌（通常为阴性），若果细菌能从赖氨酸或鸟氨酸脱去羧基（-COOH），导致培养基pH变碱，指示剂溴麝香草酚蓝就显示出蓝色，试验结果为阳性。若细菌不脱羧，培养基不变则为黄色。（2）培养基基础培养基：蛋白胨

30、5g 酵母浸膏 3g葡萄糖1g 蒸 馏 水1000mL0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL 调整pH至6.8，在每100mL基础培养基内，加入需要测定的氨基酸0.5g，所加的氨基酸应先溶解于1.5%NaOH溶液内。L-赖氨酸0.5g1.5%NaOH溶液0.5mLL-乌氨酸0.5g1.5%NaOH溶液0.5mL 加入氨基酸后，再调整pH至6.8，分装于灭菌小试管内，每管1mL，121高压蒸汽灭菌10min。（3）试验方法1）从琼脂斜面挑取培养物少许，接种于试验用培养基内，上面加一层灭菌液状石蜡。2）将试管放在37培养4d，每天观察结果。3）阳性者培养液先变黄后变为蓝色，阴性者为黄色。15、-半乳糖

31、苷酶（ONPG）试验（Ortho-nitrophenyl-Dgalactopyranoside Test）（1）原理细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一种是-半乳糖苷酶透性酶（-galactosidase permease），它位于细胞膜上，可运送乳糖分子渗人细胞。另一种为-半乳糖苷酶（-galactosidase），亦称乳糖酶（Lactase），位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述两种酶的细菌，能在24-48h发酵乳糖，而缺乏这两种酶的细菌，不能分解乳糖。乳糖迟缓发酵菌只有-D-半乳糖苷酶（胞内酶），而缺乏-半乳糖苷酶透性酶，因而乳糖进入细菌细胞很慢，而经培养基中1%乳糖较长时间的诱导，产生相当数量的透性酶后，始能较快分解乳糖，故呈迟缓发酵现象。ONPG可迅速进入细菌细胞，被半乳糖苷酶