苦参碱的提取与含量测定.docx

1、苦参碱的提取与含量测定苦参碱的提取与含量测定摘 要 :本论文通过单因子试验, 研究了乙醇浓度、 浸泡时间、 浸泡温度、 提取次 数和液料比对苦参中苦参碱提取率的影响;采用紫外可见分光光度法测定该成分 含量,作为评价指标。目的是为了优选苦参中苦参碱的提取条件,测定苦参中苦 参碱的含量。最佳条件是:乙醇浓度为 60%、浸泡时间为 2.5小时、浸泡温度为 60、提取次数为 2次、液料比为 12:1,在此最佳工艺条件下苦参碱含量与提取 率均较高, 苦参中苦参碱的得率为 8.89%。 优选得到的提取工艺条件, 简便易行且 稳定性好。关键词 :苦参; 苦参碱; 提取条件; 含量测定Matrine Extr

2、action and DeterminationAbstract: In this paper, single-factor experiment was conducted to study the ethanol concentration, soaking time, soaking temperature, frequency and fluid extraction than expected rate of extraction of matrine in matrine impact; using UV-visible spectrophotometric determinati

3、on of the ingredients, as the evaluation indicators. The purpose of optimization of the extraction of matrine in matrine conditions, the determination of matrine in matrine content. The best conditions are: 60% ethanol concentration, soaking time of 2.5 hours, soaking temperature of 60 , for 2 times

4、 the number of extraction and liquid feed ratio of 12:1, the optimum conditions in the concentration and extraction of matrine rates are higher in Matrine Kushen a rate of 8.89 percent. The optimized extraction conditions, simple and good stability.Key Words: Kushen; Matrine; extraction conditions;

5、Determination1.5 本文的研究目的及意义 . 53.4 苦参中苦参碱理化性质的分析结果 . 144 结论 . 14参考文献 . 15致 谢 . 161 前言生物碱是指从植物中分离出的一类含氮杂环的有机物,具有碱性和显著的生 理活性。 目前从植物中分离出的生物碱有 5000-6000种, 一些生物碱因其具有防治 病虫害等作用,被开发为植物源农药产品,并成为近年来研究的热点。适宜的提取方法对制备生物碱农药保持有效成分的活性具有重要意义。随着 科技的发展,生物碱提取和纯化方面出现了许多新技术,如微波萃取技术、超临 界流体萃取技术、超声萃取技术、膜分离技术、高速逆流色谱等,这些方法使生

6、物碱中有效成分提取率和纯度与常规提取方法相比,均有所提高。苦参,别名野槐根、山槐根、干人参、苦骨。双子叶植物纲,豆科。落叶亚 港灌木。根黄色、奇数羽状复叶,夏季开花,碟形花冠,淡黄色。中医学上以根 入药。根呈圆柱形,微扭曲,外表棕黄色,粗糙,有明显的纵皱纹,皮孔突出,皮 薄易脱落,多破碎向外反卷,断面黄色,显纤维,有粉质,中心部微菊花心,味 极苦。主产于西昌、德昌、甘洛等县市,年产量 10万多公斤,功能清热燥湿,杀 虫利尿,主治各种传染性皮肤病和痢疾,痔血、湿热黄痘、是配制各种治疗皮肤 药品的主要原料,可根据其药用价值、进一步开发加工增值。1.1 苦参碱的特点苦参碱 Matrine(Sopho

7、carpidine:本品系从豆科属植物苦参 (Sophora flavescens Ait.或平科植物广 豆根 (Sophora subprostrata Chun et T.Chen中 分 离出来的生物 碱。性状:苦 参碱是白金雀儿碱 (lupanine的异构体 , 为白色粉末,有四种形 态。a -苦参碱,为针状或 柱状结晶,熔点为 76度;-苦参碱,为斜方 晶状体,熔点为 87度;r -苦参碱,为 液体,沸点为 223度;&-苦参碱 是柱状结晶,熔点为 84度。常见的是 a -苦参碱 ,苦参碱能溶于水 、笨、氯仿 、甲醇、乙醇 ,微溶于石油醚。苦参碱 在 1958年首次被分离 和确认,是一

8、类独特的生物碱 (喹里西 啶生 物碱,也称羽 扇生物碱 tetracyclo-quinolizindine alkaloids,存在 于 Sophora 类植物中,主 要用来治疗癌症,病毒性肝炎 ,心脏病 (例如病毒性心肌炎 ,以 及皮肤病牛皮 癣和湿疹 (psoriasis and eczema。1.2 研究苦参碱的目的和意义在我国,乙型 肝炎患者和乙型肝炎病毒携带者 有 1亿多人,每年治疗经 费高达百亿元 ,严重影响国家的经济发展和人 民的身体健康。目前,治疗慢 性乙型肝炎的 药物颇多,但临床效果高、低不 一,临床比较认同的是 IFN-, 但因其价格较 贵及副作用使其临床应用受限, 而苦参

9、素有 IFN-相似的治疗 作用,且不良 反应少,价格低廉等优点,将是 一种极有前途的乙型肝炎治疗 药物。目前公认的具 有抗病毒作用的中药主要是苦参 素。苦参素是 从苦豆子或苦参中提取的生物碱 ,其主要成分是氧化苦参碱。 祖国传统医学 认为其具有清热利湿,退黄利尿 之功。现代药理 研究发现苦参素具有以下作用:a. 抑制 乙肝病毒的作用。b. 降酶保肝作 用。c. 抗肝硬化 作用。d. 免疫调节作 用。近 10年来,国内、 外对氧化苦参 碱及苦参碱 的研究较多 20,但 仅限于实 验研 究。 1994年, 上海市传染 病医院研究 者发现氧化 苦参碱抗麻 鸭乙型肝炎 病毒 作用,经上 海市多家医院

10、协作采用氧 化苦参碱治 疗慢性乙型 肝炎结果均 取得 良好疗效; 1996年 12月, 由卫生部指 定的上海医 科大学附属 华山医院、 北京 佑安医院完 成了 40例随机 双盲验证及 其它有关药 效、不良反 应的基础论 证工作; 1998年 2月 24日,卫生部批准氧化苦参碱为治 疗慢性乙型肝炎的五类 新药 。苦参素注 射液,苦参素 胶囊和苦参 素片是我国 自主开发完 成、享有完 全知 识产权的纯 天然生物碱类 药品,由于 疗效可靠, 临床使用量 迅速增长,故进一步加强 对苦参碱的研究具有重要的社会 意义和巨大的经济效益。 1.3 国内外研究的状况近几年来对苦参碱 的研究已得到了突飞猛进的发展

11、,尤其是苦参碱 的制备技 术和药理性质的研究。从苦豆子中提取分离纯化苦参碱,在本世纪 30年代起国外学者 Oreknov 等就已 经做了研究。他们采用分级碱化、石油醚中反复溶解、转变为碘氢酸盐的方法来 分离提取苦参碱。而在 1964 年,外学者 Aslunov 等首次采用了氧化铝柱层析法来 提取分离苦参碱 1。在 1973 年, Mohaxoba 等将苦豆子提取的总生物碱按照极性 的大小分成强碱和弱碱,然后用不同极性的溶剂进行萃取,再结合柱层析法进行 提取和分离 2。在 1974年, Mohaxoba 又从可溶于石油醚的非极性生物碱中,利用 生物碱碱性强弱的不同,用同一溶剂分段萃取,再结合氧化

12、铝柱层析提取分离苦 参碱, 在 1977年 Kyhkapob 用甲醇提取总生物碱经苯提取后柱层析, 提取和分离苦 参碱 3。国内对苦参碱的研究起步较晚 19。在 1983年宁夏人名出版社出版的仲仁山著 的苦豆子的研究及其应用一书中记载了 1971年宁夏盐池制药厂赵博光等利用 生物碱的极性不同,用不同极性溶剂进行萃取,分为若干部分,再利用氧化铝柱 层析和反流分布法进行分离, 从而得到苦参碱的工艺。 1980年中草药杂志第 8期 350页公开了同样是赵博光等对苦豆草成熟的种子及花期叶中的苦参碱提取分离的生 产工艺进行了初步的研究。认为用甲苯提取分离苦参碱,所得产品纯度高,且具 有价廉、易回收的优点

13、 4。中国专利公开了从苦豆子制备苦参碱的工艺,它是将苦豆子经浸出、提 取、转型、沉 淀、催化加氢和水相有机萃取,重结晶等工艺步骤,制得苦参碱。 高红宁 5等利用陶瓷膜微滤技术来澄清苦参水提液, 李宗效 6等利用工业甲醇回流 提取苦参粉多次后合并提取液过滤,滤液减压蒸馏回收溶剂,然后用亲脂性溶剂脱脂萃取的方法来提取和分离苦参碱。 张存莉 7等用不同浓度的乙醇和阳离子交换 树脂对苦参中苦参碱进行了提取和纯化,并对不同的苦参中的苦参碱的纯化工艺 进行了比较和研究。张奎远 8等利用正交设计对乙醇的浓度、用量、提取时间、 提取次数等进行了正交实验确定了苦参中苦参碱的最佳提取工艺。 于喜水 9等做了 乙醇

14、法、氨 -氯仿法、阳离子交换树脂法三种方法的对比实验,证明了树脂法提取 苦参碱收率高、质量好。杨基森 10等用正交试验对苦参提取、精制工艺条件进行 了考察,以苦参碱为定量指针,用薄层扫描法测定不同工艺条件苦参碱含量变化 的动向参数,结果表明水提醇沉法损失较大,醇提水沉法损失次之。蔡中琴 11等 也用正交试验对苦参碱的提取工艺进行了优选。试验选择提取溶剂、提取方式、 浓缩温度三个因子,每因子三水平,用正交表进行试验设计。结果表明用水作提 取剂,采用渗漉法,渗漉液 80下浓缩为提取苦参碱的条件。秦学功 12等也考察了 苦豆子中苦参碱的提取工艺。在室温下用稀盐酸水提取苦豆子中苦参总碱,考查 pH 值

15、、浸提时间、苦豆子粉粒度及保持副压、超声波振荡下总碱浸出率,并对比 热浸状况,结果表明稀酸水冷浸条件下苦参总碱浸出率比热浸要高,并且也可加 快浸提速度。秦学功 12等也作了用大孔吸附树脂吸附分离苦参碱的研究,以总生 物碱吸附量和解吸率为指标,从大范围筛选树脂,并研究吸附与解吸的优化条件。 随着苦参碱研究的深入,其分析检测方法也得到了很大程度的改进,目前用 来分析检测苦参碱的方法主要有以下几种,即酸碱滴定法、安培滴定法、改良 REIFER 、试剂显色法、毛细管气相色谱法、双波长薄层扫描法、纸色谱法、柱色 谱法、分光光度法薄、层色谱法、高效液相色谱法 13,其中前几种方法操作过程 复杂、灵敏度低,

16、在苦参碱的分析测定中不常用。分光光度法也可用于苦参中苦 参碱的测定中,但此法也有一定缺陷,在测定中可能会受到其它杂质和色素的干 扰而影响了测定结果。因此,此法一般是和薄层色谱法同时运用的。而薄层色谱 法自从 1958年建立后,应用范围极其广泛。经过各种改进后,基本上代替了纸色 谱法。它操作迅速,能以较高的分离性能处理微量物质,此法除特别的挥发性物 质外,基本上可用于所有的各种化合物,尤其成为植物成分分析和研究方面不可 缺少的实验手段,也是目前对生物碱定性分离的主要方法。具有代表性的有康红 英 14等采用薄层色谱法鉴别和分离了色嗄诺中的苦参碱,证明了此法简便、省时、 分离效果好、斑点清晰、结果易

17、判断。陆华 15等采用薄层扫描法测定了苦参散中 苦参碱的含量。高效液相色谱法则在苦参碱含量测定中应用的比较普遍,它可以将苦参碱与其它副产品完全分离,从而快速、准确的测定苦参碱的含量。具有代 表性的有熊英等采用 RP-HPLC 法测定了龙凤洁身纯中苦参碱和蛇床子素的含量, 证明此法灵敏、准确。1.4 本文的研究内容本论文通过单因子试验,对苦参中苦参碱的提取工艺条件进行了研究,研究 了乙醇浓度、浸泡时间、浸泡温度、提取次数和液料比对苦参中苦参碱提取的影 响;采用紫外可见分光光度法测定该成分含量,作为评价指标。以期为苦参的精 深加工与利用和苦参中苦参碱的生物学活性研究与应用提供依据。1.5 本文的研

18、究目的及意义通过对苦参中苦参碱的提取工艺的研究,选择提取苦参中苦参碱的最佳提取 条件。苦参素在治疗慢性乙型肝炎中有同 IFN-相似的治疗作用,且不良反应少, 价格低廉。研究苦参中苦参碱的提取,可以为苦参素的制造和治疗慢性乙型肝炎 提供依据。2 实验部分2.1 实验仪器及药品试剂UV-7504紫外 -可见分光光度计:上海欣茂仪器有限公司; DF-101S 磁力搅拌 器:金坛市岸头国瑞实验仪器厂; HHS 数字恒温水浴锅:天津华北实验仪器有限 公司; FA1004电子天平:上海恒平科学仪器有限公司; NOKIA1200计时器:北京 诺基亚制造厂。(1苦参碱标准品:购自郑州永和制药有限公司(2苦参:

19、购自运城市药材市场(3溴麝草酚兰 pH=7.6缓冲液:精确称取溴麝草酚兰 0.125g ,加入到依式 子 “65.0X+435.0Y+水 =1000mL, X: 0.2mol/L的磷酸二氢钠, Y: 0.2mol/L的磷酸氢 二钠 ” 配制的溶液中,振摇。(4碘化汞钾溶液:二氧化汞 1.36g ,加水 60mL 使之溶解。另取碘化钾 5g , 加水 10mL 使之溶解。将两种液体混合,加水稀释至 1000mL 。(7 0.2mol/L的磷酸二氢钠:精确称取磷酸二氢钠 3.1202g ,加水稀释,定 容于 100mL 的容量瓶中。(8 0.2mol/L的磷酸氢二钠:精确称取磷酸氢二钠 14.19

20、6g ,加水稀释,定 容于 100mL 的容量瓶中。(9二氧化汞,碘化钾,无水乙醇,氯仿以上所用试剂均为分析纯。2.2 实验方法精确称取苦参碱标准品 250mg , 置于 25mL 容量瓶中, 用无水已醇定容, 摇匀。 精密吸取标准品溶液 4.0mL , 置于 10mL 容量瓶中, 用无水已醇稀释至刻度线, 摇 匀。再吸取稀释液 2mL 于三角烧瓶中,加 5mL pH=7.6的溴麝草酚兰缓冲溶液和 10mL 氯仿,密塞,振摇 2min ,移入 50mL 分液漏斗中,静置 30min ,分出氯仿层 于具塞比塞管中。空白试剂以 2mL 无水乙醇代替标准品稀释液,其他步骤同上。精确称取苦参碱标准品

21、250mg , 置于 25mL 容量瓶中, 用无水已醇定容, 摇匀。 分别精密吸取标准品溶液 1.0、 2.0、 3.0 、 4.0、 5.0mL, 置于 10mL 容量瓶中 , 用 无水已醇稀释至刻度线,摇匀。再分别吸取稀释液 2mL 于 5个三角烧瓶中,各加 5mL 的 pH=7.6的溴麝草酚兰缓冲溶液和 10mL 氯仿, 密塞, 振摇 2min , 移入 50mL 分液漏斗中,静置 30min ,分出氯仿层于具塞比塞管中。空白试剂以 2mL 无水乙醇代替标准品稀释液,其他步骤同上。精确取样品提取液 2mL , 加 5mL pH=7.6的溴麝草酚兰缓冲溶液和 10mL 氯仿, 密塞,振摇

22、2min ,移入 50mL 分液漏斗中,静置 30min ,分出氯仿层于具塞比塞 管中。在波长 410nm 处测定苦参碱的 A 值。重复 3次,取其平均值。根据标准曲 线方程求出提取物中苦参碱的含量,按下面方法计算苦参碱得率。苦参碱得率 = 苦参碱质量 /苦参质量 100%3 结果与分析3.1 苦参碱的最大吸收波长选择与标准曲线绘制表 1. 苦参碱的最大吸收波长选择波长(nm 吸 光 度 (A 平均值 (A 380 0.540 0.335 0.277 0.384 390 0.579 0.360 0.276 0.405 395 0.594 0.374 0.264 0.411 400 0.590

23、0.404 0.261 0.418 410 0.597 0.425 0.268 0.430 415 0.580 0.406 0.264 0.417 表 2. 苦参碱的标准曲线绘制浓度(L/mL吸 光 度 (A平均值 (A 1 0.124 0.133 0.132 0.130 2 0.279 0.272 0.259 0.270 3 0.401 0.362 0.353 0.372 4 0.511 0.493 0.481 0.495 50.7060.6270.6070.647 由图 1可知,苦参碱与溴麝草酚兰反应物在波长 410nm 处有最大吸收,与文献报道基本一致,故选择 410nm 为测定波长。继

24、续在 410nm 处测定各个浓度的吸 光度,以浓度(L/mL为横坐标,吸光度(A 为纵坐标,得回归方程为:Y=0.1259X+0.0051, R 2=0.9960(见图 2 。3.2 单因素试验表 3. 乙醇浓度对苦参碱得率影响表瓶号 吸 光 度 (A平均值 (A 得率(% 10.790 0.818 0.827 0.811 2.563 2 1.342 1.339 1.337 1.339 4.239 3 1.692 1.568 1.557 1.606 5.085 4 1.336 1.334 1.317 1.329 4.206 5 1.4771.4751.4741.4754.671 图 3. 乙醇

25、浓度对苦参碱得率影响图由图 3不同乙醇浓度对苦参碱得率的影响可知, 在乙醇浓度 40%-60%范围内, 随着浓度的增加,苦参碱得率逐渐升高,当浓度超过 60%,得率开始下降。这是由于此浓度的乙醇溶液和苦参碱的极性相差开始加大,进而导致苦参碱得率下降。 因此,提取所用乙醇浓度为 60%。提取次数 吸 光 度 (A 平均值 (A 得率(%1 1.063 0.994 0.993 1.017 5.3152 0.834 0.795 0.782 0.804 8.4483 0.490 0.469 0.464 0.474 7.4474 0.285 0.272 0.260 0.272 5.6555 0.201

26、0.195 0.198 0.198 5.102 由图 4提取次数对苦参碱得率的影响结果可知,并不是提取次数越多,苦参 碱得率就越高。提取 2次,苦参碱得率最高。提取次数再增加,得率不但不升, 反而开始下降。这是由于溶剂增加以及其他杂质的溶出,导致苦参碱浓度下降, 进而使得率略微下降。故提取的最佳次数为 2次。浸泡时间 吸 光 度 (A 平均值 (A 得率(% 1.0小时 1.063 0.994 0.993 1.017 5.3511.5小时 1.046 1.032 1.017 1.032 5.4302.0小时 1.181 1.150 1.144 1.158 6.1012.5小时 1.561 1.

27、489 1.481 1.510 7.9633.5小时 0.945 1.069 1.081 1.032 5.430 5.0小时 0.928 0.918 0.903 0.916 4.820 图 5. 浸泡时间对苦参中苦参碱得率的影响图由图 5浸置时间对苦参中苦参碱得率的影响可知, 浸置 2.5小时之内, 得率增 加,时间延长,得率开始下降。这可能是由于 2.5小时时,被提取的苦参碱浓度最 大,时间再延长,其浓度虽可继续增加,但过高的浓度导致苦参碱被分解、破坏, 进而苦参碱得率下降。所以,综合作用结果,浸置 2.5小时 , 得率最高。分别准确称取 2.0g 苦参于 4个三角烧瓶中, 各向其中加入 5

28、0%的乙醇 10.0mL ,表 6. 浸泡温度对苦参中苦参碱得率的影响表浸泡温度 吸 光 度 (A 平均值 (A 得率(% 30 0.836 0.830 0.832 0.833 3.287 40 1.190 1.156 1.142 1.163 4.597 50 1.379 1.221 1.191 1.264 4.998 60 1.468 1.472 1.400 1.447 5.725 图 6. 浸泡温度对苦参中苦参碱得率的影响图为了更好确定温度与得率的关系,选用不同的温度进行提取。由图 6浸泡温 度对苦参中苦参碱得率的影响可知,随着浸泡温度的升高,得率增加。运城学院学士学位论文 表 8. 上面

29、确定的最佳提取工艺下进行验证试验 吸 0.465 光 0.448 度(A 0.501 平均值(A 0.471 得率（%） 8.89 由表 8.上面确定的最佳提取工艺下进行验证试验可知，在此工艺下测定的苦 参碱得率最高，稳定且可靠16。 3.4 苦参中苦参碱理化性质的分析结果 苦参中苦参碱理化性质的分析结果 取苦参中苦参碱滤液 1mL，加碘化汞钾试液，立即产生明显淡黄色沉淀，表 明提取物为苦参碱。滤液冻干后为浅棕黄色粉末，略有豆腥味、微溶于高浓度的 乙醇、氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂21。 4 结论 本论文以不同浓度的乙醇为提取剂，通过单因子试验，研究了乙醇浓度、浸 泡时间、浸泡温度、提取次数和液

30、料比对苦参中苦参碱提取的影响；采用紫外可 见分光光度法测定该成分含量，作为评价指标17。得到了如下结论： 乙醇浓度为 60%、浸泡时间为 2.5 小时、浸泡温度为 60、提取次数为 2 次、 液料比为 12： 在此最佳工艺条件下苦参碱含量与提取率均较高， 1， 得率为 8.89%。 14 运城学院学士学位论文 致 谢 本论文是在老师杨美玲和崔东亚的悉心指导下才得以顺利完成的。老师严谨 的治学态度，忘我的工作精神始终是我学习的榜样和前进的动力。恩师的言传身 教，学生将受益终生，再次深表衷心的感谢和崇高的敬意! 同时，我也要感谢运城学院应用化学系的各位老师和领导对我学习、生活的 关心与帮助。四年来，他们一直关心我的成长，再次表示深深谢意。四年来，我 也得到 0501 班各位同学的帮助和支持。共同的学习和生活，使我们建立了深厚的 友情，再次一并感谢! 再次，我要深深感激我的家人。在我多年求学生涯中，给予我巨大的物质资 助和精神支持，他们的恩情我将铭记在心! 最后再次向所有关心、帮助和支持我的老师、同学、家人和朋友们表示深深 的感激